Summary
Une méthode d'ingénierie des tissus uniques a été développée pour allonger les fibres nerveuses dans la culture de nombreux en récapitulant la croissance des axones s'étendent; une forme de croissance des nerfs du système nerveux où s'allongent en conjonction avec la croissance du corps agrandissement.
Abstract
Pendant la pré-synaptique du développement embryonnaire, les processus neuronaux parcourir de courtes distances pour atteindre leurs objectifs par le biais du cône de croissance. Au fil du temps, soma neuronal sont séparés de leurs terminaisons axonales en raison de la croissance du squelette de l'organisme agrandissement (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Cette mécanotransduction induit un mode secondaire de croissance neuronale capable d'accueillir un allongement continu de l'axone (Bray 1984; Heidemann et Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004)..
Croissance stretch Axon (ASG) est concevable un facteur central dans la maturation des processus embryonnaires courtes dans les nerfs de long et faisceaux de matière blanche caractéristique du système nerveux adulte. Pour étudier ASG in vitro, nous avons conçu des bioréacteurs à appliquer une tension sur le processus à court axonale des cultures de neurones (Loverde, Ozoka et al. 2011). Ici, nous détaillons les méthodes que nous utilisons pour préparer et mener des bioréacteurs ASG. Premièrement, dans chaque ruelle étirement du bioréacteur, les neurones sont plaqués sur un substrat micro-manipulation de remorquage. Ensuite, les neurones de régénérer leurs processus axonal, via l'extension du cône de croissance, sur un substrat stationnaire. Enfin, la croissance étirer est effectuée par le remorquage du corps cellulaire plaqués loin de la terminaisons axonales adhéré au substrat stationnaire; récapitulant la croissance du squelette, après l'extension du cône de croissance.
Des travaux antérieurs ont montré que des embryons de rats ASG dorsale neurones ganglions de la racine sont capables de taux de croissance sans précédent allant jusqu'à 10mm/day, atteignant des longueurs allant jusqu'à 10cm, tandis que simultanément entraînant une augmentation des diamètres des axones (Smith, Wolf et al, 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Ceci est en contraste dramatique à l'extension de croissance cône de régénération (en l'absence de stimuli mécaniques), où les taux de croissance 1mm/day moyenne avec une bonne régénération limitée à la longueur de moins de 3cm (Fu et Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). En conséquence, une étude plus approfondie d'ASG peuvent aider à révéler les mécanismes de croissance déréglée qui limitent la régénération en l'absence de stimuli mécaniques.
Protocol
1. Présentation du système extensible Axon bioréacteur croissance
- Deux approches prédominantes ont été utilisés pour appliquer des forces expérimentales pour les neurones. Dans la première approche, les forces sont appliquées à l'ensemble du neurone (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Dans la seconde approche, les forces sont appliquées directement à l'axone en tirant sur le cône de croissance. Utilisation d'aiguilles de verre, cette dernière approche a été utilisée pour modéliser la formation de nouveaux axones (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), pour identifier les seuils de force pour un allongement et la rétraction (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), et d'analyser le regroupement des neurotransmetteurs dans terminaisons axonales (Siechen, Yang et al 2009).. Une extension des tissus uniques d'ingénierie de cette méthode a été développée pour produire de grandes nerveuses construit en utilisant une croissance axonale automatisés Stretch (ASG) bioréacteur (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Récemment, nous avons développé une version miniaturisée du système de bioréacteur à l'étude au microscope ASG en temps réel (Loverde, Ozoka et al. 2011). Ici, nous détaillons le protocole de 9 jours (tableau 1) nous utilisons actuellement pour préparer et effectuer des bioréacteurs ASG régulièrement.
- Opération d'ensemble: Le système de bioréacteur GSS est composé de trois éléments principaux: 1) une chambre de bioréacteur avec des voies indépendantes (allongée puits) où les neurones sont cultivés et étirée, 2) une table de mouvements automatiques linéaires d'appliquer des forces d'étirement et 3) un moteur pas à pas variateur avec un logiciel pour contrôler la croissance étirement (figure 1).
- Brièvement, la fabrication de prototypes bioréacteur a été effectué dans un magasin de machine à l'aide d'une machine à fraiser verticale (Bridgeport, Elmira, NY). Pour la biocompatibilité, la facilité de stérilisation et de la durabilité, les composants internes ont été bioréacteur usinées à partir de 3 / 8 "polyétheréthercétone (PEEK). Polycarbonate transparent a été utilisé pour les couvercles pour permettre la microscopie optique et la visualisation des cultures. Résistant à la corrosion vis en acier inoxydable 316 et de matériel complet l'assemblage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL).
- La chambre de bioréacteur est composé d'un cadre d'étirement qui forme trois voies, un bloc d'attelage réglable qui manipule les cellules à travers les ruelles, et saillante tiges de remorquage pour une manipulation externe (figure 2). Cultures de neurones sont étalées sur des substrats de culture jetables Aclar de remorquage pris en charge par le bloc de remorquage (figures 2 & 3). Un substrat lamelle jetables stationnaires attache au fond de l'image qui s'étend et couvre tous les 3 voies. Avant d'étirement, les neurones en plaqué doit s'étendre processus axonaux du substrat de remorquage sur le substrat stationnaire via l'extension du cône de croissance. La population d'axones qui relient les substrats subiront ultérieurement étirer par le déplacement du bloc de contrôle de traction.
- Le tableau mouvements automatiques linéaires se compose d'un moteur pas à pas (HT23-397, Motion Produits appliquée, Watsonville, CA) et une table de mouvement linéaire (MIPS-2-10-1.0mm, systèmes servo, Monteville, NJ), monté sur une table d'alignement delrin . La chambre de bioréacteur est assis dans la table parallèle à la table de mouvement linéaire. Les tiges de remorquage allant de la chambre de bioréacteur sont fixés à la table de déplacement linéaire à l'aide d'un adaptateur.
- L'étape d'entraînement du moteur du contrôleur (Si 2035, Motion Produits Appliquée) est programmé en utilisant le logiciel de programmation inclus Si pour contrôler la manipulation des substrats de remorquage. Étirer axonale est appliquée de façon progressive en prenant une série de mesures de petite cylindrée espacées par temps de séjour (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Ce système contrôlé par ordinateur offre la possibilité de programmer des profils personnalisés pour ASG, et est essentielle pour l'expérimentation continue pendant plusieurs jours à quelques semaines.
2. Préparation du bioréacteur
- Préparer les substrats de culture jetables de remorquage et fixes pour la culture neuronale:
- Substrats de culture de remorquage sont coupés de 8,5 "x 11" feuilles de film Aclar (33C 2,0 millions, sonder la structure, West Chester, PA). En utilisant une lame tranchant, couper des substrats à environ 0,5 x 2,5 cm, soit un peu plus courte que la largeur des voies pour permettre au moins de 1-2mm dégagement des deux côtés.
- Poncez légèrement inférieure au 1 / 3 rd des substrats de culture de remorquage sur les deux côtés à l'aide fines papier abrasif de grain 1200 (McMaster Carr). Ponçage des substrats de remorquage facilite la croissance des axones des substrats de remorquage sur la lamelle substrat stationnaire.
- Coupez un 5 x 7cm morceau de Aclar ou utiliser une lamelle de verre n ° 1 pour servir de substrat stationnaire (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA).
- E Nettoyersubstrats de culture électronique avec une solution diluée Alconox et rincez abondamment à purifier dH 2 O.
- Stériliser les substrats de culture par immersion dans de l'éthanol à 70% pendant 30 minutes. Autoriser les substrats sécher à l'air sous une hotte de culture de tissus stériles.
- Nettoyer la chambre de bioréacteur avec diluer Alconox et autoclave stériliser dans un récipient autoclave. Immédiatement après l'autoclavage, le transfert d'une hotte stérile et laissez sécher à l'air.
- Poursuivant dans le capot, la colle stériles les substrats de culture dans le bioréacteur utilisant du silicium RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) et de coton stérile à pointe écouvillons (McMaster Carr):
- Avec les jambes bloc de remorquage dans leur position verticale complète, colle les substrats de culture de remorquage pour les jambes bloc de remorquage à la portion non sablée. Eviter le contact avec la surface de culture poncé.
- Collez le substrat de culture stationnaire au fond de la chambre de bioréacteur.
- Retirer l'excès de colle et de poches d'air en appuyant délicatement sur un écouvillon sec contre les substrats collés.
- Depuis lixivie RTV silicone acide acétique qui est toxique pour les neurones, le bioréacteur est laissé à sécher sous la lumière UV dans le capot pour 2 jours complets avant d'introduire des cultures de neurones.
- Abaissez le bloc de remorquage de jambes pour atteindre un chevauchement de 2-3mm entre les extrémités des sablés substrats de remorquage et le substrat stationnaire. Une attention cruciale doit être portée à la taille de la superposition, si elle est trop grande, le bout des substrats de remorquage peut dévier hors du substrat stationnaire; réduire le nombre d'axones qui couvrent le chevauchement (figure 3).
- Positionner le bloc de remorquage à la position de départ, avec les tiges de remorquage rétracté à l'intérieur du bioréacteur. Serrer les vis de l'immobilisation pour empêcher le mouvement des barres de remorquage avant d'étirer la croissance.
3. Cultures de neurones
- 1mL piscine de 10 ug / ml de poids moléculaire élevé de poly-D-lysine (cat # 354210, BD, Bedford, MA) dans un milieu sans sérum à la zone d'interface substrat de chaque couloir. Laisser la solution d'adhérer au repos pendant 1 heure à température ambiante. Rincer délicatement 3x avec dH 2 O, suivi par un rinçage final avec les milieux de culture. Pipetage doit être effectué à l'arrière des voies, la plus éloignée de l'interface substrat.
- Isoler dorsale explants ganglions de la racine (GHM) à partir d'un rat E16 chiot. En utilisant un microscope stéréoscopique, diluer les explants en gouttes à l'aide des boîtes de Pétri. Recueillir des explants 3-4 à l'aide d'une pipette 100 ul et plaque sur le bord du substrat de culture de remorquage poncé. Des précautions doivent être prises à l'assiette des explants sur le bord du substrat de remorquage à l'aide une petite flaque de médias. Jusqu'à 1ml de milieu de culture par voie est suffisante pour empêcher l'évaporation pendant plusieurs heures, tout en limitant le mouvement des explants. La formulation des médias: Neurobasal avec B-27 + 0,5 mM L-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) et 20 uM FdU + 20 uM inhibiteurs mitotiques uridine (F-0503, U-3003, Sigma).
- Fixez le couvercle et le transfert dans le bioréacteur dans un incubateur pendant 1 heure ou jusqu'à ce que les cellules adhèrent.
- Remplissez le bioréacteur avec des milieux de culture au point le plus éloigné des explants pour éviter le délogement. Incuber le bioréacteur pendant un minimum de 5 jours alors que les neurones d'étendre les processus axonal sur le substrat stationnaire.
4. Croissance stretch Axon
- Le bioréacteur subit les procédures de préparation finale à l'intérieur d'une hotte stérile:
- Remplissez les réservoirs au sein du bioréacteur avec tampon phosphate salin à humidifier la chambre d'évaporation et de la limite de milieux de culture. Dans notre système, les murs d'enceinte creusée servent de réservoirs. Alternativement, les petits couvercles boîte de Pétri peuvent être placés de chaque côté du bloc de remorquage au-dessus des ruelles de la culture.
- Remplacer les milieux de culture et de remplir les ruelles de la capacité. Pipetage doit être effectué à l'arrière des voies, la plus éloignée de l'interface substrat.
- Siège du bioréacteur dans la table mouvement linéaire automatisé. Si l'expérience est d'être exécuté dans un incubateur, il ne doit pas être humidifié à cause de la corrosion potentielle de la table de mouvement linéaire automatisé.
- Fixez l'adaptateur tige de remorquage pour les tiges de remorquage.
- En utilisant le logiciel programmeur Si jogging le stade de la table de mouvement linéaire pour s'aligner avec l'adaptateur tige de remorquage et de l'attacher à la scène. Pour plus de commodité, de préparer des séquences Programmeur Si à l'avance afin de manipuler la scène par incréments spécifiques.
- Desserrez les vis d'immobilisation sur la chambre de bioréacteur pour permettre le mouvement libre du bloc de remorquage.
- Stretch est appliquée de façon progressive en initiant une série d'étapes espacées de petite cylindrée temps de séjour (Pfister, Iwata et al. 2006). Notre paradigme commence par prendre deux étapes um toutes les 172 secondes,résultant en un tronçon de filet de 1mm sur 24 heures. Après un jour, le taux d'étirement peut être rampe en augmentant le déplacement ou la diminution du temps de séjour (tableau 2).
- Une fois ASG est lancé, les changements de supports ne sont généralement pas nécessaires. Au fil du temps, cependant, la culture médiatique se tourne généralement acide et se manifeste par un changement de couleur jaunâtre. Si l'expérimentation supplémentaire est nécessaire, les vieux médias ne sont jamais complètement vidée, mais au lieu que partiellement modifiés afin de minimiser les traumatismes aux axones flottant.
5. Les résultats représentatifs:
Processus axonal peut subir une croissance remarquablement rapide étirer et robuste. Initialement, le processus commence par une période d'étirements lents (≤ 1mm/day) qui se compose de petits déplacements fréquents. Dans les premières 24 heures de stretching, mécanotransduction des voies de croissance neuronale se produit, par lequel les neurones commencent plus à la bouteille axone. Dans les 24 heures d'ASG continue, les axones montrent une tolérance croissante des déplacements plus importants et plus fréquents. En général, les axones peuvent résister à une augmentation du taux d'étirement 1mm/day toutes les 12-24 heures (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Augmenter le taux d'étirement trop tôt, cependant, peut conduire à une croissance plus rapide de sélectionner les axones, mais aussi mener à une occlusion pathologique qui provoque la déconnexion.
Étirez croissance des axones ont tendance à former des faisceaux, ressemblant à l'architecture des fascicules. Utilisant les protocoles actuels, la banque centrale, la partie étirer grandi de faisceaux des axones n'ont pas d'adhérences au substrat de culture. Seul le premier respectées, les segments proximal et distal d'étirement croissance des axones restent attachés à des substrats de culture. En conséquence, la partie centrale d'étirement des axones grandi flotter librement, et sont sensibles aux perturbations dues à la manipulation.
Pour des raisons diverses, certains axones ne peut pas croître au taux étirer appliquée. Par exemple, un neurone DRG avec deux processus axonaux, qui tous deux font l'objet d'étirer, peut ne pas être capable de traduire suffisamment de protéines et de croître au taux d'allongement appliqué. Les axones qui ne peuvent pas accueillir le tronçon appliquée sera minces suivants effet Poisson. Étirer ultérieures mener à une occlusion de l'axone, l'assemblage inhibant, conduisant à la déconnexion pathologique. La majorité des axones, cependant, sont capables de subir avec succès et ASG seul un faible pourcentage d'axones subissent ce processus d'élagage-like.
Figure 1. Étirez Axon croissance système de bioréacteur (A). Chambre de culture bioréacteur & automatisé de table de mouvement linéaire, (B) Étape moteur d'entraînement du contrôleur et le logiciel de programmation de silicium.
Figure 2. Chambre culture bioréacteur. Cette caricature illustre la chambre bioréacteur par le haut avec le couvercle retiré. La position du bloc de remorquage reflète le stade final de la croissance des axones s'étendent. Étirez les axones adulte peut être vu en paquets au sein des ruelles de la culture.
Figure 3. Interface Placage culture Substrat. Cette caricature illustre les composantes du mécanisme de traction au sein de chaque voie du bioréacteur de la vue latérale. (Top) se chevauchent correcte des substrats de culture de remorquage et stationnaires. (Bas) chevauchement excessif des substrats de remorquage et stationnaires des causes de la pointe du substrat de remorquage à friser.
Film 1. Fixation des substrats de culture à bioréacteur. Cliquez ici pour visionner la vidéo
Movie 2. Placage du DRG explants sur des substrats de remorquage. Cliquez ici pour visionner la vidéo
Movie 3. Utilisation SiProgrammer. Cliquez ici pour visionner la vidéo
Film 4. Extension du cône de croissance sur le substrat stationnaire. Cliquez ici pour visionner la vidéo
Film 5. Croissance stretch Axon. Cliquez ici pour visionner la vidéo
| Jour | Étape |
| 1 | Stérilisation & Séchage |
| 2 | Collage et assemblage |
| 4 | Coatings & Placage culture neuronale |
| 9 | Démarrer croissance stretch |
Horaire Expérience Tableau 1..
| Temps [hr] | Taux stretch [mm / jour] | Temps de passage [s] | Longueur totale [mm] | Temps total stretch [jours] | |
| Prétention | 24 | 1 | 172,8 | 0 | 1 |
| S'étirer | 24 | 1 | 172,8 | 1 | 2 |
| S'étirer | 24 | 2 | 86,4 | 3 | 3 |
| S'étirer | 24 | 3 | 57,6 | 6 | 4 |
| S'étirer | 24 | 4 | 43,2 | 10 | 5 |
| S'étirer | 24 | 5 | 34,6 | 15 | 6 |
Tableau 2. Taux Horaire Stretch. Toutes les étapes sont étirer 2 um de déplacement (10 moteur pas à pas les étapes stretch = um 2).
Discussion
Deux étapes critiques doivent être observées lors de la préparation des bioréacteurs. Tout d'abord, un chevauchement optimal à l'interface substrat est nécessaire pour s'assurer que les axones peuvent traverser sur le substrat stationnaire. Aclar qui est excessivement frisés ou autrement imparfaits ne devraient pas être utilisés (figure 3). Afin d'optimiser le recouvrement, confirment que le substrat de remorquage est sablé de façon uniforme et contact avec le substrat stationnaire uniformément sur une plaque de 2-3mm de contact prolongé. Le chevauchement doit être optimisée avant chaque expérience en prenant soin d'ajuster la hauteur des jambes de remorquage.
Deuxièmement, tout en offrant pour la fixation des neurones, les revêtements de substrat de soutenir les forces considérables tonte causé par le déplacement de la tension bioréacteur et contractile des axones (Heidemann et Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Les circuits doivent être soigneusement rincées à l'eau stérilisée à la fois avant et après enrobage lysine. Revêtements doivent être appliqués à partir aliquotes fraîchement dégelé et la propagation le plus uniformément possible. Surtout, les substrats doivent pas être déplacés ou autrement perturbées pendant la période d'adhésion. Dans les étapes suivantes, éviter tout contact avec les substrats pendant le placage, et une pipette toutes les solutions de l'extrémité de la voie éloignée de l'interface substrat.
Tolérances dans les connexions de chaque composant bioréacteur peut se manifester sous la forme de relais. Durant la période initiale d'ASG, le mou dans le système est évident que le mouvement de la table de mouvement linéaire automatisée survient sans mouvement du bloc de remorquage. Slack peut varier par expérience, mais il est généralement <1mm dans notre expérience. Pour cette raison, un «pré-tension" phase d'élimination mou de 1mm/day, pour une journée, qui précède le calendrier ASG au cours de laquelle les parties s'engagent bioréacteur et de commencer le mouvement des substrats de remorquage.
Dépannage peut être nécessaire si l'étape de déplacement de la table mouvement linéaire automatisée ne correspond pas au déplacement du bloc de remorquage après la phase de pré-tension est terminée. Asynchrone, les déplacements inexactes du bloc de remorquage sont associées aux «stiction» ou frottement statique dans le matériel de remorquage et de flexion de l'adaptateur. Pour éviter ces problèmes de se produire, le mouvement du bloc de remorquage doit être vérifiée par la main, après l'assemblage, pour lisses quasi-effort mouvement. Si la liaison se produit, l'assemblage de remorquage doit être libérée avant l'expérimentation. Une rigidité suffisante de l'adaptateur est également nécessaire pour assurer la précision, les déplacements synchrones ne sont pas surmontées par stiction du matériel de remorquage.
Disclosures
L'allongement ex-vivo mécaniques des cellules neuronales est breveté en vertu des brevets américains # 6264944 et # 7429267.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la NSF CAREER CBET-0747615. Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Douglas H. Smith et David F. Meaney pour leur encadrement et leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
References
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