Summary
Um método de engenharia de tecido exclusivo foi desenvolvido para alongar as fibras nervosas numerosos na cultura recapitulando crescimento estiramento do axônio, uma forma de crescimento do sistema nervoso através do qual os nervos alongados em conjunto com o crescimento do corpo aumentando.
Abstract
Durante a pré-sináptica desenvolvimento embrionário, os processos neuronais percorrer curtas distâncias para alcançar os seus objectivos através de cone de crescimento. Com o tempo, somata neuronal são separados de seus terminais de axônios devido ao crescimento esquelético do organismo ampliação (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Este Mecanotransdução induz a um modo secundário de crescimento neuronal capaz de acomodar alongamento contínuo do axônio (Bray, 1984; Heidemann e Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004)..
Axon Crescimento Stretch (ASG) é possivelmente um fator central na maturação de curto processos embrionárias nos nervos longos e tratos de substância branca característica do sistema nervoso adulto. Para estudar ASG in vitro, nós engenharia biorreatores para aplicar tensão aos processos de curto axonal de culturas neuronal (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aqui, detalhe que os métodos que usamos para preparar biorreatores e conduta ASG. Em primeiro lugar, dentro de cada faixa que se estende do biorreator, os neurônios são banhados em cima de um substrato micro-manipulada de reboque. Em seguida, regenerar neurônios seus processos axonal, via extensão cone de crescimento, em um substrato estacionário. Finalmente, o crescimento do estiramento é realizado por reboque os corpos celulares banhados a distância dos terminais do axônio aderida ao substrato estacionária; recapitulando o crescimento do esqueleto após o alargamento do cone de crescimento.
Os trabalhos anteriores mostraram que a ASG de embriões de ratos neurônios dos gânglios da raiz dorsal são capazes de as taxas de crescimento sem precedentes até 10mm/day, alcançando comprimentos de até 10 centímetros, enquanto que ao mesmo tempo, resultando em maior diâmetro axonal (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Isto está em contraste dramático com extensão regenerativa crescimento cone (na ausência de estímulos mecânicos), onde as taxas de crescimento 1mm/day média com a regeneração de sucesso limitado a comprimentos de menos de 3cm (Fu e Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Assim, um estudo mais aprofundado da ASG pode ajudar a revelar os mecanismos de crescimento desregulado que limitam a regeneração, na ausência de estímulos mecânicos.
Protocol
1. Visão Geral do Sistema biorreator Axon Estique Crescimento
- Duas abordagens predominantes têm sido utilizadas para aplicar forças experimental para os neurônios. Na primeira abordagem, as forças são aplicadas ao neurônio inteiro (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Na segunda abordagem, as forças são aplicadas diretamente para o axônio, puxando o cone de crescimento. Utilizando agulhas de vidro, esta última abordagem tem sido utilizada para a formação de novos modelo axônio (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), para identificar limiares vigor para alongamento e retração (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), e analisar agrupamento neurotransmissor nos terminais do axônio (Siechen, Yang et al 2009).. Uma extensão de engenharia de tecido exclusivo deste método foi desenvolvido para produzir grande nervo constrói através de um estiramento Crescimento Axon automatizado (ASG), sistema de biorreatores (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recentemente, desenvolvemos uma versão em miniatura do sistema de biorreator para estudar ASG microscopicamente em tempo real (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aqui, detalhes do protocolo de 9 dias (tabela 1) que usamos atualmente para preparar e executar biorreatores ASG rotineiramente.
- Operação global: O sistema de biorreator ASG é composto por três componentes principais: 1) uma câmara de biorreator com faixas independentes (poços alongada), onde os neurônios são cultivados e esticado, 2) uma tabela de movimento linear automatizado para aplicar forças de alongamento e 3) um motor passo unidade de controlador com software para controlar o crescimento stretch (figura 1).
- Resumidamente, fabricação de protótipos biorreator foi realizada em uma loja de máquina utilizando uma fresadora vertical (Bridgeport, Elmira, NY). Para a biocompatibilidade, a facilidade de esterilização e durabilidade, o biorreator componentes internos foram usinadas a partir de 08/03 polieter "(PEEK). Policarbonato transparente foi utilizada para tampas para permitir a microscopia de luz e de visão de culturas. Resistente à corrosão 316 parafusos de aço inoxidável e hardware completo a montagem (McMaster-Carr, Elmhurst, IL).
- A câmara de biorreator é composto de uma estrutura de alongamento que faz três pistas, um bloco ajustável de reboque que manipula células em toda a faixa, e projetando-se varas de reboque para manipulação externa (figura 2). Culturas de neurônios são banhados em descartáveis Aclar substratos cultura reboque apoiado pelo bloco de reboque (figuras 2 e 3). Um substrato lamela descartáveis estacionária atribui à parte inferior do quadro que se estende e abrange todas as três pistas. Antes do alongamento, os neurônios banhado devem estender os processos axonal a partir do substrato de reboque sobre o substrato estacionária via extensão cone de crescimento. A população de axônios que ponte os substratos sofram posteriormente esticar pelo deslocamento do bloco de controle de reboque.
- A tabela de movimento automatizado linear consiste de um motor de passo (HT23-397, Produtos de Movimento Aplicada, Watsonville, CA) e mesa de movimento linear (MIPS-2-10-1.0mm, Sistemas Servo, Monteville, NJ) montado em uma mesa de alinhamento delrin . A câmara de biorreator está sentado dentro da tabela paralela à mesa de movimento linear. As hastes de reboque que se estende desde a câmara de biorreator são fixados na tabela de movimento linear usando um adaptador.
- A etapa motor de acionamento do controlador (Si 2035, Produtos de Movimento Aplicada) é programado usando o software incluído Si programador para controlar a manipulação dos substratos de reboque. Estiramento axonal é aplicada de forma gradual, tomando uma série de passos pequeno deslocamento espaçadas por tempos de permanência (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Este sistema controlado por computador fornece a capacidade de programar perfis personalizados para ASG, e é essencial para a experimentação contínua durante vários dias ou semanas.
2. Preparação de biorreator Câmara
- Preparar os substratos de cultura descartável de reboque e fixos para a cultura neuronal:
- Substratos cultura reboque são cortadas de 8,5 "x 11" folhas de filme Aclar (33C 2,0 mil, Probe Estrutura, West Chester, PA). Utilizando uma lâmina afiada cortar os substratos de aproximadamente 0,5 x 2,5 cm, ou ligeiramente menor que a largura das vias para permitir que pelo menos 1-2mm clearance de ambos os lados.
- Lixe levemente inferior º 03/01 dos substratos cultura de reboque em ambos os lados com uma lixa 1200-grão fino (McMaster Carr). Lixamento dos substratos de reboque facilita o crescimento de axônios das substratos reboque sobre o substrato lamela estacionário.
- Corte a 5 x 7cm pedaço de Aclar ou usar um No. lamela de vidro uma para servir de substrato estacionária (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA).
- ª limpasubstratos cultura e com uma solução diluída Alconox e enxaguar bem com purificada dH 2 O.
- Esterilizar os substratos cultura por imersão em etanol 70% por 30 minutos. Permitir que os substratos para o ar seco dentro de um capuz estéreis de cultura de tecidos.
- Limpar a câmara de biorreator com Alconox diluir e autoclave esterilizar dentro de um recipiente de autoclave. Imediatamente após a autoclavagem, a transferência para um capuz estéril e deixar secar ao ar.
- Continuando dentro do capô estéril cola, os substratos de cultura para o biorreator utilizando Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) e ponta de algodão estéril swabs (McMaster Carr):
- Com as pernas bloco de reboque na posição ereta plena, cola os substratos cultura de reboque para as pernas bloco de reboque na parte não-lixada. Evitar o contacto com a superfície lixada cultura.
- Cola o substrato de cultura estacionária para o fundo da câmara biorreator.
- Retire o excesso de cola e bolsas de ar delicadamente deprimente um cotonete seco contra os substratos colados.
- Desde Silicone ácido acético leaches RTV que é tóxico para os neurônios, o biorreator é deixada para secar sob luz UV dentro do capô para 2 dias inteiros antes de introduzir culturas neuronal.
- Inferior das pernas bloco de reboque para conseguir uma sobreposição de 2-3mm entre as pontas dos lixado reboque substratos e no substrato estacionário. Crucial atenção deve ser dada para o tamanho da sobreposição, se ele for muito grande, as pontas dos substratos de reboque pode desviar de substrato estacionário, reduzindo o número de axônios que se estendem a sobreposição (figura 3).
- Posição do bloco de reboque na posição inicial, com as hastes de reboque recolhido dentro do biorreator. Aperte os parafusos de imobilização para evitar o movimento das hastes de reboque antes de esticar o crescimento.
3. Culturas neuronal
- 1mL piscina de 10 mcg / mL de alto peso molecular poli-d-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) no soro livre de mídia na área de interface substrato de cada pista. Permitir que a solução para aderir sem ser perturbado por uma hora em temperatura ambiente. Lave delicadamente 3x com dH 2 O, seguido de um enxágüe final com meios de cultura. Pipetagem deve ser feita na parte de trás das pistas, o mais distante da interface substrato.
- Isolar explantes da raiz dorsal Gânglios (DRGs) de um rato E16 filhote. Usando um microscópio estereoscópico, diluir os explantes em gotas utilizando placas de Petri. Coletar explantes 04/03 utilizando uma pipeta de 100 L e placa na borda do substrato cultura lixado reboque. Cuidados devem ser tomados para a placa de explantes na borda do substrato de reboque utilizando uma pequena poça de mídia. Até 1 ml de meio de cultura por pista é suficiente para evitar a evaporação por várias horas, limitando o movimento dos explantes. Formulação de mídia: Neurobasal com B-27 + 0,5 mM L-Glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-glicose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) e 20 mM FDU + inibidores Uridina 20 mM de mitose (F-0503, U-3003, Sigma).
- Anexar a tampa e transferir o biorreator para uma incubadora por 1 hora ou até que as células aderem.
- Preencher o biorreator com meios de cultura no ponto mais distante explantes para evitar deslocamento. Incubar o biorreator para um mínimo de 5 dias, enquanto neurônios estender os processos axonal sobre o substrato estacionário.
4. Axon Crescimento Estique
- O biorreator sofre procedimentos de preparação final dentro de um capuz estéril:
- Preencha reservatórios dentro do biorreator com tampão fosfato salina para umedecer a câmara e evaporação limite de meios de cultura. No nosso sistema, as paredes recinto escavado servem como reservatórios. Alternativamente, tampas pequeno prato de Petri podem ser colocados em cada lado do bloco de reboque em cima das pistas cultura.
- Substituir os meios de cultura e ocupam as ruas de capacidade. Pipetagem deve ser feita na parte de trás das pistas, o mais distante da interface substrato.
- Banco do biorreator dentro da tabela de movimentos automatizados linear. Se o experimento for executado dentro de uma incubadora, não deve ser umidificado devido ao potencial de corrosão da tabela de movimentos automatizados linear.
- Aperte o adaptador da haste de reboque para as varas de reboque.
- Si usando software programador jog o palco da tabela de movimento linear para se alinhar com o adaptador da haste de reboque e fixá-la ao palco. Por conveniência, prepare seqüências Programador Si com antecedência, a fim de manipular o estágio em incrementos específicos.
- Solte os parafusos de imobilização na câmara de biorreator para permitir a livre circulação do bloco de reboque.
- Estiramento é aplicada de forma gradual, iniciando uma série de passos pequeno deslocamento espaçadas por tempos de permanência (Pfister, Iwata et al. 2006). Nosso paradigma começa por tomar 2 passos mM cada 172 segundo,resultando em um trecho de um milímetro net durante 24 horas. Depois de um dia, a taxa de alongamento pode ser ramped, aumentando ou diminuindo o deslocamento do tempo de permanência (tabela 2).
- Uma vez ASG é iniciada, as mudanças de mídia geralmente não são necessários. Ao longo do tempo, no entanto, meios de cultura em geral gira ácida e é evidente por uma mudança de cor amarelada. Se a experimentação é necessária mais, a velha mídia nunca é totalmente drenado, mas apenas parcialmente alterada, a fim de minimizar o trauma de axônios flutuante.
5. Resultados representativos:
Processos axonal pode sofrer estiramento crescimento notavelmente rápido e robusto. Inicialmente, o processo começa com um período de alongamento lento (≤ 1mm/day), que consiste de pequenos deslocamentos freqüentes. Nas primeiras 24 horas de alongamento, Mecanotransdução de vias de crescimento neuronal ocorre, segundo o qual os neurônios começam Além do cilindro de axônio. No prazo de 24 horas de ASG contínua, os axônios mostram uma crescente tolerância em relação a deslocamentos maiores e mais freqüentes. Em geral, os axônios podem suportar um aumento na taxa de trecho da 1mm/day cada 12-24 horas (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Aumento da taxa de estiramento muito cedo, no entanto, pode levar a um crescimento mais rápido dos axônios selecionar, mas também levar a oclusão patológica que causa a desconexão.
Trecho de crescimento axônios têm a tendência para formar pacotes, assemelhando-se a arquitetura dos fascículos. Utilizando protocolos atuais, a central, parte estiramento cresceu de feixes de axônios não têm aderências ao substrato de cultura. Somente o inicialmente aderido, segmentos proximal e distal do trecho de crescimento axônios permanecer solidários com os substratos cultura. Assim, a porção central do trecho axônios cresceu flutuar livremente, e são sensíveis a interrupção devido ao manuseio.
Para uma variedade de razões, algumas axônios não pode crescer à taxa estiramento aplicada. Por exemplo, um neurônio DRG com dois processos axonal, sendo que ambos estão passando por trecho, pode não ser capaz de traduzir proteínas suficientes e crescer ao ritmo estiramento aplicada. Axônios que não pode acomodar o trecho será aplicada fina seguinte efeito de Poisson. Trecho subsequente vai levar a oclusão dos axônios, montagem inibindo, levando a desconexão patológica. A maioria dos axônios, no entanto, são capazes de sofrer ASG com sucesso e apenas uma pequena percentagem de axônios submeter a esse processo de poda-like.
Figura 1. Esticar Axon sistema biorreator Crescimento. (A) da câmara cultura biorreator e mesa de movimento automatizado linear, (B) Passo motor de acionamento do controlador e software de programação Si.
Figura 2. Chamber Cultura biorreator. Este cartoon retrata a câmara de biorreator de cima com a tampa removida. A posição do bloco de reboque reflete o estágio final do axônio crescimento estiramento. Estiramento axônios crescido pode ser visto em feixes dentro da pistas cultura.
Figura 3. Cultura da Interface Plating substrato. Este cartoon retrata os componentes do mecanismo de reboque dentro de cada faixa do biorreator de visão lateral. (Top) sobreposição correta dos substratos cultura de reboque e estacionários. (Bottom) se sobrepõem excessivo dos substratos de reboque e estacionária faz com que a ponta do substrato de reboque para enrolar.
Filme 1. Penhora de Substratos Cultura para biorreator Câmara. Clique aqui para assistir ao vídeo
Filme 2. Plating de DRG explantes sobre substratos de reboque. Clique aqui para assistir ao vídeo
Filme 3. SiProgrammer uso. Clique aqui para assistir ao vídeo
Movie 4. Extensão Crescimento Cone em Substrato estacionária. Clique aqui para assistir ao vídeo
Filme 5. Axon Crescimento Stretch. Clique aqui para assistir ao vídeo
| Dia | Passo |
| 1 | Esterilização e Secagem |
| 2 | Colagem e Montagem |
| 4 | Coatings & Plating Cultura Neuronal |
| 9 | Iniciar Crescimento estiramento |
Tabela Schedule Experimento 1..
| Tempo [hr] | Taxa de esticar [mm / dia] | Dwell Time [s] | Comprimento total [mm] | Tempo estiramento total [dias] | |
| Pretensão | 24 | 1 | 172,8 | 0 | 1 |
| Trecho | 24 | 1 | 172,8 | 1 | 2 |
| Trecho | 24 | 2 | 86,4 | 3 | 3 |
| Trecho | 24 | 3 | 57,6 | 6 | 4 |
| Trecho | 24 | 4 | 43,2 | 10 | 5 |
| Trecho | 24 | 5 | 34,6 | 15 | 6 |
Tabela 2. Schedule Taxa de Stretch. Todas as etapas do estiramento são 2 m em deslocamento (10 passos motor de passo = estiramento M 2).
Discussion
Dois passos críticos devem ser observados durante a preparação de biorreatores. Primeiro, uma sobreposição ótima na interface substrato é necessária para garantir que os axônios podem cruzar sobre o substrato estacionário. Aclar que é excessivamente onduladas ou imperfeitos não deve ser utilizado (figura 3). Para otimizar a sobreposição, confirme que o substrato de reboque é lixada uniformemente e em contato com o substrato parado uniformemente sobre uma área de contato 2-3mm de comprimento. A sobreposição deve ser otimizado antes de cada experiência com cuidado de ajustar a altura das pernas de reboque.
Segundo, enquanto que prevê fixação de neurônios, revestimentos substrato sustentar consideráveis forças sheering causada pelo deslocamento da tensão biorreator e contráteis dos axônios (Heidemann e Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Substratos deve ser lavada cuidadosamente com água esterilizada antes e após o revestimento de lisina. Revestimentos devem ser aplicados a partir de alíquotas recém-descongelado e espalhar mais uniformemente possível. Importante, os substratos não deve ser movido ou perturbado durante o período de adesão. Nas etapas subseqüentes, evitar o contato com os substratos durante a galvanização, e pipeta todas as soluções a partir da extremidade mais distante das pistas de distância da interface substrato.
Tolerâncias nas conexões de cada componente biorreator pode se manifestar na forma de folga. Durante o período inicial de ASG, folga no sistema é evidente como o movimento da tabela de movimento automatizado linear ocorre sem movimento do bloco de reboque. Slack pode variar por experiência, mas é tipicamente <1 mm em nossa experiência. Por esta razão, uma "tensão pré-" fase de eliminação de folga 1mm/day, por um dia, precede o cronograma ASG durante o qual as partes biorreator envolver e começar o movimento dos substratos de reboque.
Solução de problemas pode ser necessário se a etapa de deslocamento da tabela de movimento linear automatizado não coincide com o deslocamento do bloco de reboque após a fase de pré-tensão é completa. Assíncrona, deslocamentos imprecisa do bloco de reboque estão associados com 'stiction "ou atrito estático dentro do hardware de reboque e flexão do adaptador. Para evitar esses problemas ocorram, o movimento do bloco de reboque deve ser verificado com a mão, depois da montagem, para o movimento quase sem esforço suave. Se ligação ocorre, o conjunto de reboque deve ser liberado antes da experimentação. Rigidez suficiente de que o adaptador é necessário também assegurar precisos, deslocamentos síncrona não são superados por stiction do hardware de reboque.
Disclosures
O alongamento ex-vivo de células neuronais mecânica é patenteado sob Patentes dos EUA # 6264944 e # 7429267.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela NSF CARREIRA CBET-0747615. Os autores gostariam de agradecer as Dras. Douglas H. Smith e David F. Meaney por sua orientação e apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
References
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