Summary
Уникальный метод тканевой инженерии была разработана, чтобы удлинить многочисленных нервных волокон в культуре сводный роста аксонов растянуть; форма нервной системы, при которой рост нервов удлиненное в сочетании с ростом расширения тела.
Abstract
В пресинаптических эмбрионального развития, нейронные процессы пройти небольшое расстояние для достижения целевых показателей по росту конуса. Со временем, нейронные somata отделены от своих терминалов аксона из-за роста скелета в расширении организма (Weiss 1941;. Грей, Hukkanen и др. 1992). Это механотрансдукции вызывает дополнительный режим нейронных рост, способный принимать постоянное удлинение аксонов (Bray 1984; Heidemann и Буксбаум 1994 года; Heidemann, Ламуре и др., 1995;. Пфистер, Ивата и др. 2004 год.).
Axon Stretch роста (ГАС) является очевидно центральным фактором в становлении короткие эмбриональные процессы в длинный нервы и белые участки вопрос характеристикой взрослого нервной системы. Для изучения ПГС в пробирке, мы инженерии биореакторов применять напряжение на короткий аксонального процессов нейронных культур (Loverde, Ozoka и соавт. 2011). Здесь мы подробно методы мы используем для подготовки и проведения биореакторов ПГС. Во-первых, в каждом растяжении полосу биореактор, нейроны покрыты на микро-манипулируют буксировки подложки. Затем нейроны восстановить свои аксонального процессов, через рост расширение конуса, на стационарном подложки. Наконец, стрейч роста осуществляется путем буксировки покрытием органов ячейки от аксонов терминалов придерживался стационарных подложки; сводный рост скелета после роста расширение конуса.
Предыдущая работа показала, что ПГС эмбриональных нейронов крысы спинной ганглий корень способны беспрецедентные темпы роста до 10mm/day, достигающий длины до 10 см, в то время одновременно в результате чего повышается аксонального диаметров (Смит, Вольф и др., 2001;. Пфистер, Ивата и др., 2004;. Пфистер, Bonislawski и др. 2006;. Пфистер, Ивата и др., 2006;. Smith 2009). Это находится в резком контрасте с регенеративной расширение конуса роста (в отсутствие механических раздражителей), где темпы роста средней 1mm/day с успешной регенерации ограничена длиной менее 3 см (фу и Гордон, 1997;. Пфистер, Гордон и др., 2011). Соответственно, дальнейшее изучение ПГС может помочь выявить дизрегуляции механизмов роста, которые ограничивают регенерации в отсутствии механических раздражителей.
Protocol
1. Обзор Рост Axon система биореактора Stretch
- Два преобладают подходы были использованы для экспериментального применения силы для нейронов. В рамках первого подхода, силы применяется ко всему нейрону (Lu, Franze и др. 2006;. Chetta, Ге и др., 2010;.. Линдквист, Лю и др., 2010). При втором подходе, силы применяются непосредственно к аксону, потянув за роста конуса. Использование стекла иглы, этот последний подход был использован для моделирования формирования новых аксонов (Берналь, Pullarkat и др. 2007;. О'Тул, Ламуре и др. 2008;.. Ламуре, Heidemann и др. 2010), для определения силы пороги для удлинения и втягивание (Dennerll, Ламуре и др., 1989;. Чжэн, Ламуре и др., 1991;.. Ламуре, Чжэн и др. 1992), а также проанализировать нейромедиатора кластеризации в аксонов терминалов (Siechen, Ян и др. 2009 год.). Единственное расширение тканевой инженерии этого метода была разработана с целью получения больших нервов конструкций с использованием автоматизированной Рост Stretch Аксон (ПГС) биореактор система (Iwata, Браун и др., 2006;.. Пфистер, Ивата и др., 2006). Недавно мы разработали миниатюрные версии биореактор система для изучения ПГС микроскопически в реальном времени (Loverde, Ozoka и соавт. 2011). Здесь мы подробно 9-дневной протокол (таблица 1) мы в настоящее время использовать для подготовки биореакторов и выполнять ПГС в установленном порядке.
- Общее описание: ПГС биореактор система состоит из трех основных компонентов, 1) биореактор камеры с независимой полосы движения (удлиненные скважин), где нейроны культивировались и потянулся, 2) автоматизированных линейной таблицы движения применить растягивающих сил и 3) шагового двигателя контроллер диска с программным обеспечением для управления растянуть роста (рис. 1).
- Короче говоря, изготовление прототипов биореактор был выполнен в механический цех использованием вертикальный фрезерный станок (Бриджпорт, Эльмира, Нью-Йорк). Для биосовместимость, простота стерилизации и долговечность, внутренние компоненты биореактора были изготовлены из 3 / 8 "полиэфирэфиркетона (PEEK). Прозрачный поликарбонат был использован для крышек для обеспечения световой микроскопии и просмотра культур. Коррозионностойкие из нержавеющей стали 316 винтов и аппаратного обеспечения полной собрание (McMaster-Карр, Элмхерст, Иллинойс).
- Камеру биореактора состоит из пялец, что формы 3 полосы движения, регулируемые буксировки блок, который манипулирует клеток через переулки, и выступающие буксировки стержни для внешних манипуляций (рис. 2). Нейронов культуры высевали на одноразовые Aclar культуры субстратов буксировки поддерживается блок буксировки (рис. 2 и 3). Одноразовые покровное стационарных подложки придает нижней части пялец и охватывает все 3 полосы движения. До растяжения, с гальваническим нейроны должны расширить аксонального процессы от буксировки подложки на подложке с помощью стационарных роста расширение конуса. Население аксонов, что мост субстратов впоследствии пройти растянуть, контролируя перемещение буксировки блок.
- Автоматизированных линейной таблицы движения состоит из шагового двигателя (HT23-397, прикладной движения Продукты, Watsonville, CA) и линейные таблицы движения (MIPS-2-10-1.0мм, Servo Systems, Монтевилл, Нью-Джерси), установленный в таблице выравнивание Delrin . Камеру биореактора сидит в таблице параллельно линейной таблицы движения. Буксировки стержней простирается от биореактора камеры крепятся к линейной таблицы движения с помощью адаптера.
- Шаговым двигателем контроллер диска (Si 2035, прикладной Продукты Motion) программируется с помощью входящего в Si программист программного обеспечения для управления манипуляции субстратов буксировки. Аксонального растянуть применяется в поэтапно путем принятия ряда малых шагов перемещения расположенных по времени выдержки (Пфистер, Ивата и др., 2004;.. Пфистер, Ивата и др., 2006). Этот компьютер-управляемая система предоставляет возможность запрограммировать индивидуальные профили для ПГС, и имеет важное значение для непрерывного эксперимента в течение нескольких дней до нескольких недель.
2. Подготовка биореактора палаты
- Подготовка одноразовые буксировки и стационарных культуры субстраты для нейронов культуры:
- Субстратов Буксировка культуры вырезаны из 8,5 "х 11" листов Aclar пленки (33C 2,0 млн., структура Probe, Уэст-Честер, штат Пенсильвания). Используя острый разрезанию подложки примерно 0,5 х 2,5 см, или чуть меньше, чем ширина полосы, чтобы по крайней мере 1-2мм просвет с обеих сторон.
- Слегка песок ниже 1 / 3 от буксировки субстраты культуры с обеих сторон с использованием тонких 1200-наждачной бумагой (McMaster Carr). Шлифование буксировки субстратов способствует росту аксонов от буксировки субстратов на покровное стационарных подложки.
- Вырезать 5 х 7 см кусок Aclar или использовать № 1 покровное стекло в качестве стационарных подложки (# 4865-1, Brain Research Labs, Ньютон, штат Массачусетс).
- Чистая йэлектронная культура подложках с разбавленным раствором Алконокс и тщательно промыть очищенную дН 2 O.
- Стерилизовать культуры субстратов путем погружения в 70% этаноле в течение 30 минут. Разрешить субстратов высохнуть на воздухе в течение стерильной капот культуры ткани.
- Чистая биореактор камеры разбавленной Алконокс и стерилизовать в автоклаве автоклаве контейнер. Сразу же после автоклавирования, трансфер в стерильных капот и дайте высохнуть на воздухе.
- Продолжая в стерильных капот, клей культуры субстратов в биореактор использованием кремния РТВ (Dow Corning # 732, McMaster Carr) и стерильные хлопковые тампоны (McMaster Carr):
- При буксировке ноги блока в полном вертикальном положении, клей культуры буксировки субстратов для буксировки ног блока при не-отшлифовать части. Избегать контакта с отшлифованной поверхностью культуры.
- Клей стационарных субстрат культуры на дно биореактор камеры.
- Удалите излишки клея и воздушные карманы, слегка удручает сухим ватным против склеенных поверхностей.
- Так как силиконовые RTV вымывается уксусной кислоты, которая является токсичным для нейронов, биореактор оставляют сохнуть под ультрафиолетовым светом в течение капотом на 2 полных дня до введения нейронных культур.
- Нижняя буксировки ноги блока для достижения 2-3мм перекрытия между кончиками отшлифовать буксировки субстратов и стационарных подложки. Crucial внимание должно быть обращено на размер перекрываются, если оно слишком большое, кончики субстратов буксировки может отвлечь от стационарных субстрата, снижение числа аксонов, которые охватывают перекрытия (рис. 3).
- Позиция буксировки блок в исходное положение, при буксировке стержней убираться внутрь биореактора. Затяните винты иммобилизации, чтобы предотвратить движение буксировки стержней до растянуть роста.
3. Нейронных культур
- Бассейн 1 мл 10 мкг / мл высоким молекулярным весом поли-D-лизина (кошка # 354210, BD, Бедфорд, штат Массачусетс) в сыворотке крови, свободных средств массовой информации в области подложка каждой полосе. Разрешить решение придерживаться в покое на 1 час при комнатной температуре. Ополоснуть 3x с дН 2 O, а затем окончательное промыть питательных сред. Пипетирование должны быть выполнены в задней части полосы движения, дальний подложка.
- Изолировать Спинной корневой Ganglia эксплантов (ДРГ) от E16 крысят. Использование стереомикроскопа, развести эксплантов в капли использованием чашки Петри. Сбор 3-4 эксплантов использовании 100 мкл пипетки и пластиной на краю отшлифовать буксировки субстрат культуры. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы пластины эксплантов на краю буксировки основание с помощью небольшой луже СМИ. До 1 мл культуральной среды на одну полосу движения достаточно, чтобы предотвратить испарение в течение нескольких часов при ограничении движения эксплантов. СМИ формулировка: Neurobasal с B-27 + 0,5 мм L-глютамин (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 г / л D-глюкозы (G-7528, Sigma, St . Луис, Миссури), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) и 20 мкМ FDU + 20 мкМ уридина митотических ингибиторов (F-0503, U-3003, Sigma).
- Прикрепите крышку и передачи биореактор для инкубатора в течение 1 часа или пока клетки придерживаться.
- Заполните биореактор с питательной среды в точке дальний эксплантов, чтобы избежать смещение. Инкубируйте биореактор для минимум 5 дней в то время как нейроны расширить аксонального процессов на стационарных подложки.
4. Axon Stretch роста
- Биореактор подвергается окончательной процедуры подготовки внутри стерильного капотом:
- Заполните резервуары в биореакторе с фосфатным буферным раствором, чтобы увлажнить камеры и ограничить испарение питательных сред. В нашей системе, выдолбленные стен корпуса служат резервуарами. Кроме того, небольшой чашке Петри крышки могут быть размещены по обе стороны от буксировки блок на вершине культуры переулков.
- Замените культуру средств массовой информации и заполнения полосы до отказа. Пипетирование должны быть выполнены в задней части полосы движения, дальний подложка.
- Сиденье биореактор в автоматизированных линейной таблицы движения. Если эксперимент будет выполняться в инкубатор, она не должна быть увлажненной из-за потенциальной коррозии автоматизированных линейной таблицы движения.
- Закрепите адаптер буксировки стержня в случае буксировки стержней.
- Использование Si программист пробежку этап линейной таблицы движения для согласования с адаптером стержень буксировки и закрепите ее на сцену. Для удобства подготовки последовательности Si программист заранее для того, чтобы манипулировать этап в конкретные приращения.
- Ослабьте винты на иммобилизацию биореактор камеру, чтобы свободное перемещение блока буксировки.
- Стретч применяется в поэтапно, начав серию маленьких шагов перемещения расположенных по времени выдержки (Пфистер, Ивата и соавт. 2006). Наша парадигма начинает принимать 2 шага мкм каждый 172 секунд,в результате чего чистая растянуть 1 мм в течение 24 часов. После одного дня, растянуть ставка может быть увеличили за счет увеличения или уменьшения перемещений время выдержки (таблица 2).
- Как только начинается ПГС, средства массовой информации изменения, как правило, не требуется. Со временем, однако, культура СМИ в целом оказывается кислым и видно по желтовато изменения цвета. Если дальнейшие эксперименты не требуется, старые СМИ никогда не бывает полностью истощены, но вместо этого лишь частично изменен для того, чтобы свести к минимуму травмы плавающей аксонов.
5. Представитель Результаты:
Аксонального процессы могут проходить удивительно быстрый и надежный растянуть роста. Первоначально процесс начинается с периодом медленного растяжения (≤ 1mm/day), который состоит из небольших, редко перемещений. В течение первых 24 часов после растяжения, механотрансдукции нейронных путей рост происходит, в результате чего нейроны начинают дополнение к аксону цилиндра. В течение 24 часов непрерывной ПГС, аксоны показывают повышение толерантности к более и более частыми перемещениями. В общем, аксоны могут выдержать увеличение растянуть скорость 1mm/day каждые 12-24 часов (Пфистер, Ивата и др., 2004;. Пфистер, Bonislawski и др. 2006;.. Пфистер, Ивата и др., 2006). Увеличение растянуть ставку на слишком скоро, однако, может привести к более быстрому росту аксонов выбрать, но и привести к патологическим окклюзии, которая вызывает отключение.
Стретч растущие аксоны имеют тенденцию к образованию пучки, напоминающие архитектуру пучки. Используя текущие протоколы, центральных, стрейч выросла часть аксонов пучки не имеют спайки с культурой субстрата. Только сначала придерживался, проксимальных и дистальных сегментов натяжных растущих аксонов остаются прикрепленными к культуре субстратов. Соответственно, центральная часть растянуть выросли аксонов в свободное плавание, и чувствительны к нарушению из-за обращения.
По разным причинам некоторые аксоны не могут расти на протяжении применяются ставки. Например, нейрон DRG с двумя аксонального процессов, оба из которых проходят стрейч, возможно, не в состоянии перевести достаточное белка и расти на протяжении применяются ставки. Аксоны, который не может применяться будет растянуть тонкую следующий эффект Пуассона. Последующие растянуть приведет к закупорке аксонов, подавляя сборки, что приводит к патологическим отключения. Большинство аксонов, однако, способны пройти ПГС успешно, и только небольшой процент аксоны проходят это упрощение, как процесс.
Рисунок 1. Axon Stretch Рост биореактора системы. () Биореактор камере культуры и автоматизированных линейной таблицы движения, (B) Шаг привода контроллера и Si Программирование программного обеспечения.
Рисунок 2. Биореактор культуры палаты. Этот мультфильм показывает биореактор камеры сверху с снятой крышкой. Положение блока буксировки отражает конце стадии роста растянуть аксона. Стретч выросли аксонов можно увидеть в расслоения в культуре переулков.
Рисунок 3. Культуры Субстрат Покрытие интерфейс. Этот мультфильм показывает компоненты буксировки механизма в каждой полосой из биореактора вид сбоку. (Топ) Правильный перекрытия буксировки и стационарных субстраты культуры. (Внизу) Чрезмерное перекрытия буксировки и стационарных субстратов причины кончик буксировки подложки виться.
Фильм 1. Приложение культуры Подложки для биореактора палаты. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Фильм 2. Покрытие из DRG эксплантов на Буксировка субстратов. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Фильм 3. SiProgrammer использования. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Фильм 4. Конус роста расширение на стационарные основания. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
Фильм 5. Axon Stretch роста. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
| День | Шаг |
| 1 | Стерилизация и сушки |
| 2 | Склеивание и Ассамблеи |
| 4 | Покрытия и нейронов Покрытие культуры |
| 9 | Начало Stretch роста |
Таблица 1. Эксперимент по расписанию.
| Время [ч] | Стретч Оценить [мм / день] | Время задержки [с] | Общая длина [мм] | Всего Time Stretch [дней] | |
| Претенциозность | 24 | 1 | 172,8 | 0 | 1 |
| Растягивать | 24 | 1 | 172,8 | 1 | 2 |
| Растягивать | 24 | 2 | 86,4 | 3 | 3 |
| Растягивать | 24 | 3 | 57,6 | 6 | 4 |
| Растягивать | 24 | 4 | 43,2 | 10 | 5 |
| Растягивать | 24 | 5 | 34,6 | 15 | 6 |
Таблица 2. Stretch Оценить расписание. Все стрейч шаги 2 мкм в смещении (10 шагов шагового двигателя = 2 мкм стрейч).
Discussion
Две важные шаги должны быть соблюдены при подготовке биореакторов. Во-первых, оптимальное перекрываются подложка необходима для обеспечения того, чтобы аксоны могут пересечь на стационарном подложки. Aclar быть чрезмерно скручена или иначе несовершенные не должны быть использованы (рис. 3). Для оптимизации перекрытия, убедитесь, что подложка буксировки равномерно отшлифовать и контакты стационарных субстрат равномерно по 2-3мм долго пятна контакта. Перекрытия должны быть оптимизированы перед каждым экспериментом, тщательно регулировки высоты буксировки ноги.
Во-вторых, обеспечивая при этом для крепления нейронов, подложки покрытий выдержать значительные Шееринг силы, вызванные смещением биореактор и сократительной натяжение аксонов (Heidemann и Буксбаум 1990; Пфистер, Ивата и др., 2004;.. Loverde, Ozoka и др. 2011). Подложки должны быть тщательно промыть стерилизованной воды до и после лизина покрытия. Покрытия должны применяться из свежей талой аликвоты и распространять как можно более равномерно. Важно отметить, что основания не должны быть перемещены или иным образом нарушенных при адгезии период. В последующие шаги, избегайте контакта с подложки во время покрытия, и пипетки все решения из дальнего конца полосы от подложка.
Допуски в связи каждого биореактор компонент может проявляться в форме вяло. В начальный период ПГС, слабину в системе видно, как движение автоматизированных линейной таблицы движение происходит без движения буксировки блок. Натяжные могут варьироваться в зависимости от эксперимента, но, как правило, <1 мм в нашем опыте. По этой причине, "до-напряжение" слабину фазу устранения 1mm/day, на один день, предшествующий ПГС графику в течение которого биореактор части привлечения и начать движение буксировки субстратов.
Устранение неполадок может потребоваться, если перемещение шаг автоматизированных линейной таблицы движения не соответствует смещению буксировки блока после предварительного напряжения фаза будет завершена. Асинхронный, неточные перемещения блока буксировки, связанные с "stiction» или трения покоя в течение буксировки оборудования и сгибание адаптера. Чтобы предотвратить эти проблемы не появлялась, движение блок буксировки должны быть проверены вручную, после сборки, для гладких почти легким движением. Если связывание происходит, буксировки сборки должны быть освобождены до экспериментов. Достаточная жесткость адаптер также необходимо для обеспечения точного, синхронного перемещения не преодолены stiction от буксировки оборудования.
Disclosures
Экс-естественных условиях механического растяжения нервных клеток запатентована под патентами США # 6264944 и # 7429267.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NSF КАРЬЕРА конбет-0747615. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Дуглас Смит и Дэвид Ф. Мини их наставничества и поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
