Summary
एक अद्वितीय ऊतक इंजीनियरिंग विधि अक्षतंतु खिंचाव विकास recapitulating द्वारा संस्कृति में कई तंत्रिका तंतुओं को बढ़ाना विकसित किया गया था, जिससे नसों विस्तार शरीर के विकास के साथ संयोजन के रूप में बढ़ाना तंत्रिका तंत्र के विकास के एक फार्म.
Abstract
पूर्व synaptic भ्रूण विकास के दौरान, neuronal प्रक्रियाओं कम दूरी पार विकास शंकु के माध्यम से अपने लक्ष्य तक पहुँचने के लिए. समय के साथ, अपने अक्षतंतु टर्मिनलों से neuronal somata विस्तार जीव के कंकाल विकास (; ग्रे, Hukkanen एट अल 1992 +१,९४१ Weiss) कारण अलग हो रहे हैं. इस mechanotransduction लाती है neuronal अक्षतंतु के लगातार बढ़ाव मिलनसार में सक्षम विकास की एक माध्यमिक मोड (1984 ब्रे, Heidemann और Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux एट अल 1995, Pfister Iwata, एट अल 2004) .
Axon खींचो ग्रोथ (ASG) क़यास लंबे नसों और सफेद बात वयस्क तंत्रिका तंत्र की विशेषता इलाकों में कम भ्रूण प्रक्रियाओं की परिपक्वता में एक केंद्रीय कारक है. इन विट्रो में ASG अध्ययन करने के लिए, हम neuronal संस्कृतियों के छोटे axonal प्रक्रियाओं (Loverde, Ozoka एट अल 2011.) तनाव लागू बायोरिएक्टर इंजीनियर. यहाँ, हम तरीकों हम बायोरिएक्टर तैयार है और ASG आचरण का उपयोग विस्तार. सबसे पहले, bioreactor के प्रत्येक लेन खींच भीतर न्यूरॉन्स एक माइक्रो - चालाकी रस्सा सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है. अगला, न्यूरॉन्स उनके axonal प्रक्रियाओं को पुनर्जीवित, विकास शंकु विस्तार के माध्यम से एक स्थिर सब्सट्रेट. अंत में, खिंचाव विकास रस्सा द्वारा किया जाता है मढ़वाया सेल निकायों दूर स्थिर सब्सट्रेट करने के लिए पालन अक्षतंतु टर्मिनलों से, विकास शंकु विस्तार के बाद कंकाल विकास recapitulating.
पिछले काम दिखाया गया है कि भ्रूण चूहे पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स के ASG 10mm/day अभूतपूर्व वृद्धि दरों में सक्षम हैं, की लंबाई तक पहुँचने 10cm करने के लिए, जबकि समवर्ती वृद्धि हुई axonal व्यास में जिसके परिणामस्वरूप (स्मिथ, वुल्फ एट अल 2001 , Pfister, . Iwata एट अल 2004; Pfister, Bonislawski एट अल 2006, Pfister, Iwata एट अल 2006, स्मिथ 2009). यह पुनर्योजी विकास शंकु विस्तार यांत्रिक उत्तेजनाओं के अभाव में जहां विकास दर सफल 3cm की तुलना में कम लंबाई को सीमित उत्थान के साथ औसत 1mm/day (. Pfister, गॉर्डन एट अल 2011 फू और 1997 गॉर्डन) के एकदम विपरीत में है तदनुसार, ASG के आगे के अध्ययन के लिए dysregulated विकास तंत्र है कि यांत्रिक उत्तेजनाओं के अभाव में उत्थान सीमा प्रकट मदद मिल सकती है.
Protocol
1. Axon खींचो ग्रोथ bioreactor प्रणाली का अवलोकन
- दो प्रमुख दृष्टिकोण के लिए न्यूरॉन्स के लिए प्रयोगात्मक बलों को लागू करने के लिए उपयोग किया गया है. पहले दृष्टिकोण में, बलों को पूरे न्यूरॉन (. Chetta, Kye एट अल 2010;. Lindqvist, लियू एट अल, 2010 लू, Franze एट अल २,००६) के लिए लागू कर रहे हैं. दूसरे दृष्टिकोण में, बलों को सीधे अक्षतंतु विकास शंकु पर खींच कर लागू कर रहे हैं. गिलास सुई का प्रयोग, यह बाद दृष्टिकोण नया अक्षतंतु (; O'Toole, Lamoureux एट अल 2008;. Bernal, Pullarkat एट अल 2007 Lamoureux, Heidemann एट अल, 2010) के मॉडल के गठन के लिए इस्तेमाल किया गया है, बढ़ाव के लिए बल थ्रेसहोल्ड की पहचान और त्याग (Dennerll, Lamoureux एट अल 1989, झेंग, Lamoureux एट अल 1991;. Lamoureux, झेंग एट अल 1992), और अक्षतंतु टर्मिनलों में neurotransmitter है क्लस्टरिंग का विश्लेषण (Siechen, यांग एट अल 2009.) . इस पद्धति का एक अनूठा ऊतक इंजीनियरिंग विस्तार के लिए बड़े तंत्रिका उत्पादन के लिए विकसित किया गया था एक स्वचालित Axon खींचो ग्रोथ (ASG) bioreactor प्रणाली (Iwata, ब्राउन एट अल 2006.. Pfister, Iwata एट अल 2006) का उपयोग constructs. हाल ही में, हम bioreactor प्रणाली के लिए वास्तविक समय में microscopically ASG (Loverde, Ozoka एट अल 2011.) अध्ययन की एक छोटी संस्करण विकसित की है. यहाँ, हम 9 दिन विस्तार प्रोटोकॉल (तालिका 1) हम वर्तमान में बायोरिएक्टर तैयार है और नियमित ASG प्रदर्शन करने के लिए उपयोग.
- कुल मिलाकर ऑपरेशन: ASG bioreactor प्रणाली तीन मुख्य घटकों, 1) स्वतंत्र (लम्बी कुओं) गलियों, जहां न्यूरॉन्स सुसंस्कृत और फैला रहे हैं 2) के साथ एक bioreactor कक्ष एक स्वचालित रेखीय गति करने के लिए खींच बलों और 3) एक कदम मोटर लागू तालिका के शामिल है नियंत्रक के लिए खंड विकास (1 आंकड़ा) नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ ड्राइव.
- संक्षेप में, bioreactor प्रोटोटाइप का निर्माण एक ऊर्ध्वाधर मिलिंग मशीन (ब्रिजपोर्ट, Elmira, NY) का उपयोग कर एक मशीन की दुकान में प्रदर्शन किया गया था. Biocompatibility के लिए, नसबंदी और स्थायित्व की आसानी, आंतरिक bioreactor घटकों 3 / 8 "polyetheretherketone (तिरछी नज़र) से machined थे पारदर्शी polycarbonate lids के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रकाश और संस्कृतियों के माइक्रोस्कोपी देखने के लिए अनुमति देने के संक्षारण प्रतिरोधी 316 स्टेनलेस स्टील स्क्रू और पूरा हार्डवेयर विधानसभा (McMaster Carr, Elmhurst, आईएल).
- bioreactor चैम्बर एक खींच फ्रेम है कि बाहरी हेरफेर (आंकड़ा 2) के लिए 3 गलियों, एक समायोज्य रस्सा ब्लॉक कि manipulates गलियों भर में कोशिकाओं, और उभड़नेवाला रस्सा छड़ रूपों शामिल है. Neuronal संस्कृतियों डिस्पोजेबल Aclar रस्सा संस्कृति रस्सा ब्लॉक (2 और 3 के आंकड़े) द्वारा समर्थित substrates पर चढ़ाया जाता है. एक डिस्पोजेबल coverslip स्थिर सब्सट्रेट खींच फ्रेम के नीचे करने के लिए देता है और सभी तीन गलियों spans. पहले खींच, मढ़वाया न्यूरॉन्स विकास शंकु विस्तार के माध्यम से स्थिर सब्सट्रेट रस्सा सब्सट्रेट से axonal प्रक्रियाओं का विस्तार करना चाहिए. axons की आबादी है कि पुल substrates को बाद में रस्से ब्लॉक के विस्थापन को नियंत्रित द्वारा खिंचाव से गुजरना होगा.
- स्वचालित रेखीय गति की मेज (HT23 - 397, एप्लाइड मोशन उत्पाद, Watsonville, CA) एक stepper मोटर और रेखीय गति तालिका (एमआइपी-2-10-1.0mm, सर्वो सिस्टम, Monteville, न्यू जर्सी) delrin संरेखण तालिका के लिए मुहिम शुरू होते . bioreactor चैम्बर रेखीय गति तालिका में समानांतर तालिका के भीतर बैठा है. रस्सा bioreactor चैम्बर से विस्तार छड़ रेखीय गति एक अनुकूलक का उपयोग कर तालिका में fastened हैं.
- कदम मोटर ड्राइव नियंत्रक (२०३५ सी, एप्लाइड मोशन उत्पाद) शामिल सी प्रोग्रामर सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए रस्सा substrates के हेरफेर नियंत्रण करने के लिए क्रमादेशित है. Axonal खिंचाव एक stepwise फैशन में छोटे विस्थापन बार ध्यान केन्द्रित करना (. Pfister, Iwata एट अल 2006 Pfister, Iwata एट अल 2004) द्वारा दूरी पर कदम की एक श्रृंखला लेने के द्वारा लागू किया जाता है . इस कंप्यूटर नियंत्रित प्रणाली ASG के लिए अनुकूलित प्रोफाइल कार्यक्रम करने की क्षमता प्रदान करता है, और सप्ताह के लिए कई दिनों से निरंतर प्रयोग के लिए आवश्यक है.
2. Bioreactor चैंबर की तैयारी
- डिस्पोजेबल रस्सा और स्थिर संस्कृति substrates के neuronal संस्कृति के लिए तैयार:
- "X 11" Aclar फिल्म की चादरों (33C 2.0 लाख, संरचना जांच, पश्चिम Chester, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) रस्सा संस्कृति substrates 8.5 से काट रहे हैं. एक तेज ब्लेड का उपयोग लगभग 0.5 2.5cm एक्स के लिए substrates कटौती, या थोड़ा गलियों की चौड़ाई की तुलना में कम करने के लिए दोनों पक्षों पर कम से कम एक 2mm निकासी की अनुमति.
- हल्के से कम 1 / 3 रस्सा संस्कृति substrates पर दोनों पक्षों के ठीक-1200 धैर्य sandpaper (McMaster कार्र) का उपयोग कर की तृतीय रेत. रस्सा substrates के Sanding coverslip स्थिर सब्सट्रेट रस्सा substrates से axons की वृद्धि की सुविधा है.
- Aclar के एक 5 x 7cm टुकड़ा कट या एक नंबर 1 गिलास coverslip का उपयोग करने के लिए स्थिर सब्सट्रेट के रूप में सेवा (# 4865-1, ब्रेन रिसर्च लैब्स, न्यूटन, एमए).
- साफ़ वेंई एक कमजोर Alconox समाधान के साथ संस्कृति substrates और शुद्ध DH 2 ओ के साथ अच्छी तरह कुल्ला
- 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जन द्वारा संस्कृति substrates जीवाणुरहित. Substrates एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के भीतर शुष्क हवा करने की अनुमति दें.
- साफ पतला Alconox और आटोक्लेव के साथ bioreactor कक्ष एक autoclave कंटेनर के भीतर बाँझ. Autoclaving के तुरंत बाद, एक बाँझ हुड के हस्तांतरण और शुष्क हवा की अनुमति.
- बाँझ हुड, गोंद के भीतर सतत bioreactor सिलिकॉन RTV (डॉव 732 # Corning, McMaster कार्र) और बाँझ कपास का उपयोग करने के लिए संस्कृति substrates swabs इत्तला दे दी है (McMaster कार्र):
- अपनी पूरी ईमानदार स्थिति, गोंद रस्सा गैर रेत से भरा भाग में रस्सा ब्लॉक पैरों संस्कृति substrates में रस्सा ब्लॉक पैरों के साथ. रेत से भरा संस्कृति की सतह के साथ संपर्क से बचें.
- गोंद स्थिर संस्कृति bioreactor कक्ष के नीचे सब्सट्रेट.
- धीरे से चिपके substrates के खिलाफ एक सूखी झाड़ू निराशाजनक द्वारा अतिरिक्त गोंद और हवा जेब निकालें.
- सिलिकॉन RTV leaches एसिटिक एसिड है कि न्यूरॉन्स को विषैला होता है के बाद से, bioreactor हुड के भीतर पराबैंगनी प्रकाश के तहत 2 neuronal संस्कृतियों को शुरू करने से पहले पूरा दिन के लिए सूखी छोड़ दिया है.
- रस्सा ब्लॉक पैरों को कम करने के लिए रेत से भरा रस्सा substrates और स्थिर सब्सट्रेट के सुझावों के बीच एक 2-3mm ओवरलैप को प्राप्त करने के लिए. महत्वपूर्ण ध्यान ओवरलैप के आकार के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, अगर यह बहुत बड़ी है, रस्सा substrates के सुझावों स्थिर सब्सट्रेट के बंद से ध्यान हटाने सकता है, axons कि ओवरलैप (आंकड़ा 3) अवधि की संख्या को कम करने.
- रस्सा bioreactor अंदर मुकर छड़ के साथ शुरू करने की स्थिति में रस्सा ब्लॉक, स्थिति. स्थिरीकरण शिकंजा कस रस्सा छड़ के आंदोलन से पहले रोकने के लिए वृद्धि खिंचाव.
3. Neuronal संस्कृति
- 10 μg / एमएल उच्च आणविक भार प्रत्येक गली के सब्सट्रेट इंटरफ़ेस क्षेत्र में सीरम मुक्त मीडिया में पाली-D-lysine (# 354,210 बिल्ली, बी.डी., Bedford, MA) के पूल 1ml. समाधान के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए undisturbed पालन की अनुमति दें. धीरे DH 2 हे, संस्कृति मीडिया के साथ अंतिम कुल्ला द्वारा पीछा के साथ 3x कुल्ला . Pipetting गलियों के पीछे पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, सब्सट्रेट इंटरफ़ेस दूर.
- पृष्ठीय रूट ganglia explants (DRGs) एक E16 पिल्ला चूहे से अलग. एक stereomicroscope का प्रयोग, पेट्री डिश का उपयोग बूंदों में explants पतला. 3-4 explants रेत से भरा रस्सा संस्कृति सब्सट्रेट के किनारे पर एक 100 μL विंदुक और प्लेट का उपयोग कर लीजिए. केयर रस्सा सब्सट्रेट का उपयोग मीडिया के एक छोटे पोखर के किनारे पर explants थाली करने के लिए लिया जाना चाहिए. 1ml लेन प्रति संस्कृति मीडिया के लिए कई घंटे के लिए वाष्पीकरण को रोकने जबकि explants के आंदोलन को सीमित करने के लिए पर्याप्त है. मीडिया तैयार: + 0.5mm (Invitrogen, Carlsbad, CA) एल Glutamine, 1% FBS (Hyclone, Waltham, MA) हाई, 2.5g / एल ग्लूकोज डी (जी 7528, सिग्मा, सेंट B-27 के साथ Neurobasal . लुइस, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) और 20 सुक्ष्ममापी FdU + 20 सुक्ष्ममापी uridine mitotic inhibitors (एफ 0503, U-3003, सिग्मा).
- ढक्कन संलग्न है और एक मशीन के लिए 1 घंटे के लिए या जब तक कोशिकाओं पालन bioreactor हस्तांतरण.
- संस्कृति मीडिया के साथ explants dislodgment से बचने के लिए सब से अधिक दूर बिंदु पर bioreactor भरें. 5 दिनों की एक न्यूनतम के लिए bioreactor सेते हैं जबकि न्यूरॉन्स स्थिर सब्सट्रेट axonal प्रक्रियाओं का विस्तार.
4. Axon खींचो ग्रोथ
- bioreactor एक बाँझ हुड के अंदर अंतिम तैयारी प्रक्रियाओं आए:
- Bioreactor भीतर जलाशयों भरें साथ फॉस्फेट कक्ष और संस्कृति मीडिया की सीमा वाष्पीकरण गीला खारा buffered. हमारी प्रणाली में, hollowed बाड़े की दीवारों जलाशयों के रूप में सेवा करते हैं. वैकल्पिक रूप से, छोटे पेट्री डिश lids संस्कृति गलियों ऊपर रस्सा ब्लॉक के दोनों ओर पर रखा जा सकता है.
- बदलें संस्कृति मीडिया और क्षमता के लिए गलियों को भरने. Pipetting गलियों के पीछे पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, सब्सट्रेट इंटरफ़ेस दूर.
- स्वचालित रेखीय गति तालिका के अंदर bioreactor सीटों. अगर प्रयोग करने के लिए एक मशीन के भीतर चला जा रहा है, यह humidified स्वचालित रेखीय गति तालिका के संभावित जंग के कारण नहीं होना चाहिए.
- रस्सा छड़ रस्सा रॉड एडाप्टर जकड़ना.
- सी प्रोग्रामर रेखीय गति तालिका के मंच सैर रस्सा रॉड एडाप्टर के साथ संरेखित करें और यह मंच पर जकड़ना सॉफ्टवेयर का उपयोग करना. सुविधा के लिए अग्रिम में सी प्रोग्रामर अनुक्रम तैयार क्रम में विशिष्ट वेतन वृद्धि में मंच हेरफेर.
- Bioreactor कक्ष पर स्थिरीकरण शिकंजा ढीला करने के लिए रस्सा ब्लॉक की मुक्त आवाजाही की अनुमति है.
- खींचो एक stepwise फैशन में छोटे विस्थापन बार ध्यान केन्द्रित करना (Pfister, Iwata एट अल 2006.) द्वारा दूरी पर कदम की एक श्रृंखला की शुरुआत से लागू किया जाता है. हमारी प्रतिमान 2 सुक्ष्ममापी कदम हर 172 सेकंड लेने के द्वारा शुरू होता है,24 घंटे से अधिक शुद्ध 1mm खंड में जिसके परिणामस्वरूप. एक दिन के बाद, खिंचाव दर विस्थापन को बढ़ाने या कम समय ध्यान केन्द्रित करना (तालिका 2) द्वारा ramped किया जा सकता है.
- एक बार ASG शुरू की है, मीडिया परिवर्तन आम तौर पर आवश्यक नहीं कर रहे हैं. समय के साथ, तथापि, संस्कृति मीडिया आम तौर पर अम्लीय मुड़ता है और एक पीले रंग में परिवर्तन के द्वारा स्पष्ट है. यदि आगे के प्रयोग की आवश्यकता है, पुराना मीडिया पूरी तरह से, कभी नहीं सूखा है, लेकिन बजाय केवल आंशिक रूप से बदल क्रम में अस्थायी axons को आघात को कम करने.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
Axonal उल्लेखनीय तेजी से और मजबूत खिंचाव विकास प्रक्रियाओं से गुजरना कर सकते हैं. प्रारंभ में, इस प्रक्रिया धीमी (≤ 1mm/day) खींच है कि छोटे, निराला displacements के होते हैं एक अवधि के साथ शुरू होता है. खींच के पहले 24 घंटे के भीतर neuronal विकास के रास्ते की mechanotransduction होता है, जिससे न्यूरॉन्स अक्षतंतु सिलेंडर के अलावा शुरू. निरंतर ASG के 24 घंटे के भीतर, axons एक बढ़ती अधिक से अधिक और अधिक लगातार displacements सहिष्णुता दिखा. सामान्य में, axons खिंचाव 1mm/day हर 12-24 घंटे की दर (; Pfister, Bonislawski एट अल 2006;. Pfister, Iwata एट अल 2006 Pfister, Iwata एट अल 2004) में वृद्धि का सामना कर सकते हैं. खिंचाव की दर बहुत जल्द ही बढ़ाने, तथापि, चयन axons की अधिक तेजी से विकास के लिए नेतृत्व, लेकिन यह भी रोग रोड़ा है कि वियोग का कारण बनता है के लिए नेतृत्व करेंगे हो सकता है.
खींचो - बढ़ रही axons प्रवृत्ति बंडलों फार्म, fascicles की वास्तुकला जैसी है. वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग, केंद्रीय, अक्षतंतु बंडलों के खिंचाव हो हिस्से संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए कोई adhesions है. केवल शुरू पालन खिंचाव से बढ़ रही axons के प्रॉक्सिमल और दूरवर्ती क्षेत्रों संस्कृति substrates से जुड़े रहते हैं. तदनुसार, खिंचाव बड़े axons की मध्य भाग आज़ादी फ्लोट, और से निपटने के लिए कारण व्यवधान के प्रति संवेदनशील हैं.
कारणों की एक किस्म के लिए, कुछ axons लागू खिंचाव दर पर विकसित नहीं कर सकता. उदाहरण के लिए, दो axonal प्रक्रियाओं के साथ एक DRG न्यूरॉन, जो दोनों के खिंचाव के दौर से गुजर रहे हैं, पर्याप्त प्रोटीन अनुवाद करने के लिए और लागू खिंचाव दर से बढ़ने में सक्षम नहीं किया जा सकता है. Axons कि खिंचाव लागू नहीं समायोजित कर सकते हैं पॉसों प्रभाव के बाद पतली जाएगा. बाद खिंचाव axons का रोड़ा, बाधा विधानसभा के लिए नेतृत्व, रोग वियोग के लिए अग्रणी होगा. axons की बहुमत, तथापि, सफलतापूर्वक एएसजी से गुजरना करने में सक्षम हैं और axons की केवल एक छोटा सा प्रतिशत pruning की तरह इस प्रक्रिया से गुजरना.
चित्रा 1 Axon खींचो ग्रोथ bioreactor सिस्टम (ए) bioreactor संस्कृति कक्ष और स्वचालित रेखीय गति की मेज, (बी) कदम मोटर ड्राइव नियंत्रक और सी प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर .
चित्रा 2. Bioreactor संस्कृति चैंबर. इस कार्टून हटा ढक्कन के साथ ऊपर से bioreactor कक्ष दर्शाया गया है. रस्सा ब्लॉक की स्थिति अक्षतंतु खंड विकास के अंतिम चरण को दर्शाता है. खींचो बड़े हो axons संस्कृति गलियों के भीतर बंडलों में देखा जा सकता है है.
चित्रा 3 संस्कृति सब्सट्रेट चढ़ाना इंटरफ़ेस. इस कार्टून की ओर देखने से bioreactor के प्रत्येक लेन के भीतर रस्सा तंत्र के घटकों को दर्शाया गया है. रस्सा और स्थिर संस्कृति substrates के (ऊपर) सही ओवरलैप. (नीचे) रस्सा और स्थिर substrates के अत्यधिक ओवरलैप रस्सा सब्सट्रेट की नोक कर्ल करने का कारण बनता है.
मूवी 1. Bioreactor चैंबर की संस्कृति Substrates अनुलग्नक. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के
मूवी 2. रस्सा substrates पर Explants DRG के चढ़ाना. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के
मूवी 3. SiProgrammer उपयोग करने के लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के
मूवी 4]. ग्रोथ स्टेशनरी सब्सट्रेट पर शंकु विस्तार करने के लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के
5 मूवी Axon खींचो ग्रोथ. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के
| दिन | चरण |
| 1 | बंध्याकरण और सुखाने |
| 2 | Gluing सभा |
| 4 | कोटिंग्स और Neuronal संस्कृति चढ़ाना |
| 9 | खींचो ग्रोथ शुरू |
टेबल प्रयोग 1. अनुसूची.
| समय [घंटा] | खींचो दर [मिमी / दिन] | समय वास [एस] | कुल लंबाई [मिमी] | कुल खींचो समय [दिनों] | |
| अभिमान | 24 | 1 | 172.8 | 0 | 1 |
| खिंचाव | 24 | 1 | 172.8 | 1 | 2 |
| खिंचाव | 24 | 2 | 86.4 | 3 | 3 |
| खिंचाव | 24 | 3 | 57.6 | 6 | 4 |
| खिंचाव | 24 | 4 | 43.2 | 10 | 5 |
| खिंचाव | 24 | 5 | 34.6 | 15 | 6 |
टेबल खींचो 2 दर अनुसूची. सभी खिंचाव कदम विस्थापन में 2 सुक्ष्ममापी (10 कदम मोटर कदम = 2 सुक्ष्ममापी खिंचाव) कर रहे हैं.
Discussion
दो महत्वपूर्ण कदम बायोरिएक्टर की तैयारी के दौरान मनाया जाना चाहिए. सबसे पहले, सब्सट्रेट इंटरफेस में एक इष्टतम ओवरलैप करने के लिए सुनिश्चित करें कि axons स्थिर सब्सट्रेट पार कर सकते हैं की जरूरत है. Aclar है कि जरूरत से ज्यादा या कर्ल करवाने अन्यथा अपूर्ण है (3 आंकड़ा) नहीं किया जाना चाहिए. अनुकूलन ओवरलैप की पुष्टि, कि रस्सा सब्सट्रेट समान रूप से रेत से भरा है और संपर्कों एक 2-3mm लंबे संपर्क पैच पर स्थिर सब्सट्रेट समान. ओवरलैप ध्यान से रस्सा पैर की ऊंचाई का समायोजन करके पहले एक प्रयोग करने के लिए अनुकूलित करना चाहिए.
दूसरा, न्यूरॉन्स की कुर्की के लिए प्रदान करते हुए, सब्सट्रेट कोटिंग्स काफी sheering axons (Pfister, Iwata एट अल, 2004;. Loverde, Ozoka एट अल 2011 Heidemann और 1990 Buxbaum) के bioreactor और सिकुड़ा तनाव के विस्थापन के कारण बलों बनाए . Substrates निष्फल पानी के साथ अच्छी तरह से किया जाना चाहिए दोनों से पहले और बाद lysine कोटिंग rinsed. कोटिंग्स हौसले thawed aliquots से लागू किया जाना चाहिए और संभव के रूप में समान रूप से फैला. महत्वपूर्ण बात है, substrates हो या आसंजन अवधि के दौरान नहीं करना चाहिए ले जाया अन्यथा परेशान है. बाद के चरणों में, चढ़ाना दौरान substrates के साथ संपर्क से बचने, और सब्सट्रेट अंतरफलक से दूर गलियों के अंत तक से सभी समाधान pipet.
प्रत्येक bioreactor घटक के कनेक्शन में tolerances सुस्त के रूप में प्रकट कर सकते हैं. ASG की प्रारंभिक अवधि के दौरान, सिस्टम में सुस्त स्पष्ट है के रूप में स्वचालित रेखीय गति तालिका के आंदोलन रस्सा ब्लॉक के आंदोलन के बिना होता है. प्रति सुस्त प्रयोग भिन्न कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर हमारे अनुभव में <1mm है. इस कारण के लिए, एक "पूर्व तनाव" 1mm/day की सुस्त उन्मूलन के चरण, एक दिन के लिए, ASG अनुसूची के दौरान जो bioreactor भागों संलग्न और रस्सा substrates के आंदोलन शुरू पछाड़ दिया.
समस्या निवारण यदि स्वचालित रेखीय गति तालिका के विस्थापन कदम पूर्व तनाव चरण के बाद रस्सा ब्लॉक के विस्थापन से मेल नहीं खाती है के लिए आवश्यक हो सकता है है पूरा हो गया है. रस्सा ब्लॉक के अतुल्यकालिक, गलत displacements 'stiction' या स्थैतिक घर्षण के भीतर रस्सा हार्डवेयर और एडाप्टर के ठोके के साथ जुड़े रहे हैं. घटनेवाला से इन मुद्दों को रोकने के लिए, हाथ से रस्सा ब्लॉक के आंदोलन की जाँच की जानी चाहिए और चिकनी आंदोलन के पास उदासीन के लिए एसेंबली के बाद,. यदि बाइंडिंग होता है, रस्सा विधानसभा प्रयोग करने से पहले मुक्त होना चाहिए. एडाप्टर के पर्याप्त कठोरता भी आवश्यक है सटीक, तुल्यकालिक displacements रस्सा हार्डवेयर के stiction के द्वारा पर काबू पाने नहीं कर रहे हैं आश्वासन देता हूं.
Disclosures
पूर्व vivo neuronal कोशिकाओं के यांत्रिक बढ़ाव अमेरिकी # 6264944 और # 7429267 पेटेंट के तहत पेटेंट कराया है.
Acknowledgments
यह काम NSF कैरियर CBET 0747615 द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों के लिए डीआरएस का शुक्रिया अदा करना होगा. डगलस एच. स्मिथ और उनकी सदस्यता और समर्थन के लिए डेविड एफ Meaney.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
