Summary
ユニークな組織工学の手法は、軸索の伸長の成長をrecapitulatingで培養中の多数の神経線維を伸長するために開発された、神経は大きくするには身体の成長と一緒に細長いそれによって神経系の成長の形。
Abstract
シナプス前胚発生時に、神経突起の成長円錐を経由して、その目標を達成するために短い距離を通過する。時間が経つにつれて、神経somaの複数形が原因で大きくするには、生物の骨格成長（。。グレー、Hukkanen ら 1992ワイス1941年）に、その軸索末端から分離されています。このメカノトランスダクションには、軸索の継続的な伸びに対応できる神経細胞の成長の二次モード誘導（ブレイ1984; HeidemannとBuxbaum 1994; Heidemann、ラムルーら1995;。フィスター、岩田ら2004。）。
軸索のストレッチの成長（ASG）が考えられる長い神経と大人の神経系の特徴的な白質の器官に短い胚のプロセスの成熟化の中心的な要因である。 in vitroで ASGの勉強に、我々は、ニューロン培養の短い軸索のプロセス（Loverde、Ozoka ら、2011）に張力を適用するバイオリアクターを設計した。ここで、我々は、細部我々はバイオリアクターを準備し、ASGを行うために使用するメソッドを。最初に、バイオリアクターの各ストレッチ車線内で、神経細胞は、マイクロ操作曳航基板上にメッキされています。次に、神経細胞は静止基板上に、成長円錐の拡張によって、それらの軸索のプロセスを再生成する。最後に、ストレッチの成長は、めっきされた細胞体は離れて静止して基板に付着して軸索末端から曳航によって実行されます。成長円錐の拡張子の後に骨格の成長をrecapitulating。
同時に増加した軸索の直径（スミス、Wolf らの結果ながら、2001;;前の仕事は、後根神経節の神経細胞が10cmまでの長さに達し、最高10mm/dayまで前例のない成長率が可能な胚性ラットのASGのことが示されているフィスターを、岩田ら2004;。フィスター、Bonislawski ら2006;。フィスター、岩田ら2006;。スミス2009）。これは、再生、成長円錐の拡張子（機械的刺激の非存在下での）成長率3センチメートル未満の長さに制限が成功再生を伴う平均1mm/day（。。フィスター、ゴードンら 2011 Fuとゴードン1997）への劇的な対照的ですしたがって、ASGのさらなる研究は、機械的刺激のない状態で再生を制限する調節不全成長メカニズムを明らかにするために役立つことがあります。
Protocol
1。軸索のストレッチの成長バイオリアクターシステムの概要
- 二つの支配的なアプローチは、神経細胞への実験的な力を加えるために利用されている。最初のアプローチでは、力が全体のニューロン（。。Chetta、桂ら2010;。。ヴィスト、Liu ら 2010呂、Franze ら、2006）に適用されます。第2のアプローチでは、力が成長円錐に引いて軸索に直接適用されます。伸長のための力のしきい値を識別するために、ガラス針を用いて、この後者のアプローチは、新しい軸索（ラムルー、Heidemann ら2010;オトゥール、ラムルーら2008。ベルナル、Pullarkat ら 2007）のモデルを形成するために使用されていますと撤回（Dennerll、ラムルーら1989;鄭、ラムルーら1991;。。ラムルー、鄭ら 1992）、及び（。Siechen、Yangら 2009）軸索終末で神経伝達物質のクラスタリングを分析する。この方式のユニークな組織工学の拡張子は、大規模な神経を生成するために開発された自動化された軸索のストレッチの成長（ASG）バイオリアクターシステムを（岩田、ブラウンら、2006。。。フィスター、岩田ら、2006）を使用して構築。最近、我々はリアルタイムで顕微鏡的に、ASG勉強するバイオリアクターシステム（Loverde、Ozoka ら、2011）の小型版を開発した。ここで、我々は、細部我々は現在、バイオリアクターを準備し、定期的にASGの実行に使用する9日間のプロトコル（表1）。
- 全体的な操作 ：ASGのバイオリアクターシステムは、神経細胞を培養し、引き伸ばされている独立した車線（細長い井戸）、2）バイオリアクターチャンバーストレッチ力、3）ステップモータを適用する自動化された直動テーブルの3つの主要コンポーネントは、1）で構成されていますストレッチの成長（図1）を制御するためのソフトウェアを使用してコントローラを駆動する。
- 簡単に言えば、バイオリアクターのプロトタイプの製作は、縦フライス盤（ブリッジポート、エルマイラ、NY）を用いて機械工場で実施した。生体適合性のために、殺菌および耐久性の容易さ、内部のバイオリアクターのコンポーネントは、3 / 8"ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）から機械加工された。透明ポリカーボネートは、文化の光学顕微鏡と閲覧を可能にするためにふたのために使用された。耐腐食316ステンレス鋼製ねじと完全なハードウェアがアセンブリ（マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州）。
- バイオリアクターチャンバーは、外部操作（図2）は3車線、車線間で細胞を操作する調節可能な曳航ブロック、および突出曳航ロッドを形成するストレッチフレームで構成されています。ニューロン培養は、曳航ブロック（図2＆3）でサポートされている使い捨てACLAR曳航培養基板上にプレーティングされています。使い捨てカバー固定基板は、ストレッチング、フレームの底部にアタッチして、全3車線にまたがる。前のストレッチに、メッキニューロンは、成長円錐の拡張子を介して固定基板上に曳航基板から軸索のプロセスを拡張する必要があります。基板は、その後、曳航ブロックの変位を制御することで、ストレッチを受けることになる橋軸索の人口。
- 自動化された直動テーブルにはデルリンアライメントテーブルに取り付けられたステッピングモータ（HT23 - 397、応用モーション製品、ワトソンヴィル、カリフォルニア州）と直動テーブル（MIPS - 2 - 10〜1.0ミリメートル、サーボシステム、モンテビル、NJ）から構成されています。バイオリアクターチャンバーは直線運動のテーブルと平行にテーブル内に収まっている。バイオリアクターチャンバーから伸びる曳航ロッドは、アダプタを使って直線運動のテーブルに固定されている。
- ステップモータ駆動制御装置は、（Siの2035、応用モーション製品）曳航基板の操作を制御するために含まれているSiのプログラマのソフトウェアを使用してプログラムされます。軸索伸長が（。。;フィスター、岩田ら、2006フィスター、岩田ら 2004）回滞留を隔て小さな変位の一連のステップを取ることによって段階的に適用されます。このコンピュータ制御システムは、ASGのためにカスタマイズされたプロファイルをプログラムする能力を提供し、数日から数週間にわたって継続的な実験のために不可欠です。
2。バイオリアクターチャンバーの準備
- 神経細胞培養のための使い捨ての牽引と静置培養基板を準備します。
- 曳航培養基板はACLARフィルムの"× 11"シート（33C 2.0ミル、構造プローブ、ウエストチェスター、ペンシルバニア州）8.5からカットされています。鋭いブレードを使用すると、約0.5 × 2.5センチメートルに基板をカット、または両側に最低で1 - 2mmのクリアランスを可能にするために車線の幅よりわずかに短い。
- 軽く砂細かい1200番のサンドペーパー（マックマスターカー）を使用して両側に曳航文化の基質の1 / 3より低い回を 。曳航基板の研磨にはカバースリップ静止基板上に曳航基板からの軸索の成長を促進する。
- ACLARの5 × 7センチメートル部分をカットしたり、固定基板（＃4865から1、ブレインリサーチラボ、ニュートン、マサチューセッツ州）として機能する第1のガラスカバースリップを使用してください。
- クリーン目希薄Alconox溶液を持つe培養基質とのdH 2 Oを、精製して、よくすすぐ
- 30分間70％エタノールに浸漬により培養基質を滅菌する。基板は滅菌組織培養フードの中で風乾します。
- 希薄Alconoxとオートクレーブによるバイオリアクターチャンバーはオートクレーブ容器内に消毒清掃してください。直ちにオートクレーブ後、滅菌フードに転送し、空気乾燥することができます。
- 、無菌フード内で継続してシリコンRTVを用いたバイオリアクターへの接着培養用基質（ダウコーニング＃732、マクマスターカー）と滅菌綿（マクマスターカー）綿棒をひっくり返した。
- 彼らの完全な直立位置、非砂地の部分で曳航ブロックの足に接着曳航培養基板の曳航ブロックの脚を持つ。砂地の文化の表面との接触を避ける。
- バイオリアクターチャンバーの底部に接着剤は、静置培養の基質。
- 軽く接着基質に対する乾いた綿棒を押すことによって過剰な接着剤とエアポケットを取り外します。
- ニューロンに対して毒性が強いシリコーンRTVの浸出酢酸ので、バイオリアクターは前ニューロン培養を導入〜2日間フルのためにフード内にUV光下で乾燥さに委ねられている。
- すり曳航基板と固定基板の先端の間に2〜3ミリメートルのオーバーラップを達成するために曳航ブロックの足を下ろします。重要な注意はそれが大きすぎると、曳航基板の先端が固定基板のオフ逸らすことが、オーバーラップの大きさに注意する必要があります。重なり（図3）にまたがる軸索の数を減らす。
- 曳航ロッドバイオリアクターの内部に収納されて、開始位置に曳航ブロックを置きます。成長を伸ばす前に曳航ロッドの動きを防ぐために、固定ネジを締めます。
3。ニューロン培養
- 各レーンの基板との界面領域での無血清培地で10μg/ mLの高分子量ポリ- D -リジン（猫＃354210、BD、ベッドフォード、MA）のプールを1mLの。溶液を室温で1時間邪魔されずに付着することができます。培地ですすぎ、最終的に続いてのdH 2 O、と3倍軽くすすいでください。ピペッティングは、基板のインタフェースを最も遠い、車線の後ろで実行する必要があります。
- 子犬E16ラットから後根神経節の外植片（DRGS）を分離する。実体顕微鏡を使用して、ペトリ皿を用いて滴に外植片を希釈する。すり曳航培養基質のエッジに100μLピペットとプレートを使用して3から4片を収集する。ケアは、メディアの小さな水溜りを使用して曳航基板の端部プレートに植片を払う必要があります。最大レーンあたり培地1mLのに外植片の動きを制限しながら数時間のために、蒸発を防ぐために十分である。メディアの製剤：B - 27 + 0.5のL -グルタミン（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）、1％FBS - HI（Hyclone、ウォルサム、MA）、2.5グラム/ L D -グルコース（G - 7528、シグマ、サンとのNeurobasal 。ルイ、MO）、20ng/mL NGF（13290から010、Invitrogen社）と20μMFDU +20μMのウリジンの有糸分裂阻害剤（F - 0503、U - 3003、Sigma社）。
- 蓋を取り付け、細胞が付着するまで1時間またはインキュベーターにバイオリアクターを転送する。
- dislodgmentを避けるために、外植片を最も離れた点で培地をバイオリアクターを埋める。ニューロンが静止して基板上に軸索プロセスを拡張しながら5日間の最小のためのバイオリアクターをインキュベートする。
4。軸索のストレッチの成長
- バイオリアクターは、無菌フード内、最終的な準備手順を経る。
- リン酸塩は、チャンバーと培地の制限の蒸発を加湿するために緩衝生理食塩水とバイオリアクター内の貯水池を埋める。私たちのシステムでは、中空の筐体の壁はリザーバーとして機能する。また、小さなペトリ皿の蓋は、文化の車線の上曳航ブロックのどちら側に配置されることがあります。
- 培地を交換して、容量に車線を埋める。ピペッティングは、基板のインタフェースを最も遠い、車線の後ろで実行する必要があります。
- 自動化されたリニアモーションテーブル内の席バイオリアクターを。実験は、インキュベーター内で実行する場合、それは自動化されたリニアモーションテーブルの潜在的な腐食による加湿であってはならない。
- 曳航ロッドに曳航ロッドアダプターを固定します。
- けん引棒のアダプタに合わせてステージに固定する直動テーブルの段階をジョグシリコンプログラマーのソフトウェアを使用する。利便性のために、特定の単位でのステージを操作するために事前にSiのプログラマのシーケンスを準備する。
- 曳航ブロックの自由な移動を可能にするバイオリアクターチャンバー上に固定ネジを緩めます。
- ストレッチは（フィスター、岩田ら 2006）回滞留を隔て小排気量の一連の手順を開始することによって、段階的に適用されます。私たちのパラダイムは、2μm以下のステップごとに172秒を取ることによって開始されます24時間以上ネットを1mmストレッチでその結果。 1日後、伸び率は、変位を大きくするか、滞留時間（表2）を減少させることによって上昇することができる。
- ASGが開始されると、メディアの変更は通常は不要です。時間が経つにつれて、しかし、文化メディアは、一般的に酸性になり、色の黄色変化によって明らかである。さらなる実験が必要な場合は、古いメディアは、浮動軸索への外傷を最小限に抑えるために、完全に消耗していませんが、代わりに部分的にしか変更されません。
5。代表的な結果：
軸索のプロセスは非常に迅速かつ堅牢なストレッチの伸びを受けることができる。最初に、プロセスは小さい、まれな変位で構成されてストレッチ遅いの期間（≤1mm/day）から始まります。ストレッチングの最初の24時間以内に、神経細胞の成長経路のメカノトランスダクションが発生する、それによって神経細胞は軸索のシリンダーに加えて開始する。連続ASGの24時間以内に、軸索は大きく、より頻繁な変位の増加寛容さを見せる。一般的には、軸索は1mm/dayごとに12〜24時間の伸び率（。。フィスター、Bonislawski ら2006;。。フィスター、岩田ら、2006フィスター、岩田ら 2004）の増加に耐えることができます。伸び率を大きくすると、あまりにも早く、しかし、選択軸索のより急速な成長につながる可能性がありますでなく、断線の原因となる病的な閉塞につながります。
ストレッチ栽培軸索は束のアーキテクチャに似て、バンドルを形成する傾向を持っている。現在のプロトコルを利用して、軸索の束の中央、ストレッチ成長部分は、培養基質への癒着がない。だけ最初に付着した、ストレッチに成長している軸索の近位および遠位のセグメントは、文化の基板に接続されたまま。したがって、ストレッチ成長軸索の中央部分は自由に浮く、および取り扱いに起因する混乱に敏感です。
様々な理由から、いくつかの軸索は、適用される伸び率で成長することはできません。例えば、二つの軸索のプロセスとDRGのニューロンは、ストレッチを受けていますどちらも、十分な蛋白質を翻訳して適用される伸び率で成長することができない場合があります。ストレッチを適用に対応できないの軸索は、ポアソン効果が続く薄くなります。その後のストレッチは、病理学的切断に至る、軸索、阻害するアセンブリの閉塞につながる。軸索の大多数は、しかし、成功したASGの受けることができますし、軸索のわずかな割合はこの剪定のようなプロセスを経る。
図1。軸索のストレッチの成長バイオリアクターシステム。（A）バイオリアクターの培養チャンバー＆自動化された直動テーブル、（B）ステップモータ駆動制御装置とSiのプログラミングソフトウェア。
図2バイオリアクター文化会所。この漫画は、削除された蓋付きのトップからのバイオリアクターチャンバーを示しています。曳航のブロックの位置は、軸索伸張の成長の最後の段階を反映している。ストレッチ成長軸索は、文化のレーン内でバンドルで見ることができます。
図3。培養基板のメッキインタフェース。この漫画は、側面図からのバイオリアクターの各車線内でけん引しているメカニズムの構成要素を示しています。曳航と静置培養基板の（トップ）正しい重なる。 （ボトム）曳航及び固定基板の過度の重複が曳航基板の先端がカールします。
映画は1。リアクターチャンバーに培養基質の添付ファイルは。 ビデオを見るにはここをクリック
けん引基板上に外植片をDRGの動画2。めっき。 ビデオを見るためにここをクリック
動画3。SiProgrammerの使用法。 ビデオを見るにはここをクリック
映画は4。据置基板上に成長円錐の拡張は。 ビデオを見るにはここをクリック
映画（5）軸索のストレッチの成長は。 ビデオを見るにはここをクリック
| 一日 | ステップ |
| 1 | 殺菌＆乾燥 |
| 2 | 接着＆組み立て |
| 4 | コーティング＆神経文化メッキ |
| 9 | ストレッチ成長スタート |
表1。実験スケジュール。
| 時間[時間] | 伸び率[mm /日] | ドウェル時間[s] | 合計長さ[mm] | 合計タイムストレッチは、[日] | |
| プリテンション | 24 | 1 | 172.8 | 0 | 1 |
| ストレッチ | 24 | 1 | 172.8 | 1 | 2 |
| ストレッチ | 24 | 2 | 86.4 | 3 | 3 |
| ストレッチ | 24 | 3 | 57.6 | 6 | 4 |
| ストレッチ | 24 | 4 | 43.2 | 10 | 5 |
| ストレッチ | 24 | 5 | 34.6 | 15 | 6 |
表2。伸び率のスケジュール。すべてのストレッチの手順では、変位は2μm（10ステップモータのステップ= 2μmのストレッチ）です。
Discussion
二つの重要なステップは、バイオリアクターの製造中に観察する必要があります。最初に、基板界面での最適なオーバーラップは、軸索が静止基板上に交差することができることを保証するために必要です。過度にカールしたり、そうでなければ不完全さACLARは（図3）は使用しないでください。オーバーラップを最適化するために、曳航基板が2〜3ミリメートル長い接触パッチに均一に固定基板を均一にサンディングし、コンタクトしていることを確認します。オーバーラップは、慎重に曳航脚の高さを調整することによって、前に、各実験に最適化する必要があります。
第二に、神経細胞の付着のために提供しながら、基板のコーティングは、バイオリアクターの変位と軸索の収縮張力（;フィスター、岩田ら2004;。。Loverde、Ozokaら 2011 HeidemannとBuxbaum 1990）によって引き起こされるかなりのシェアーリング力を維持する。基板は、前のリジンコーティングすると後の両方の滅菌水で十分に洗い流してください。コーティングはたての融解アリコートから適用し、できるだけ均等に分散させる必要があります。接着期間中に重要なことは、基板を移動されるべきではない、あるいは乱れ。以降の手順では、メッキ中に基板に触れないように注意してください、と離れて基板界面からの車線の遠端からピペットすべてのソリューションを。
各バイオリアクターのコンポーネントの接続の公差は、緩みの形で現れます。自動化されたリニアモーションテーブルの動きが牽引、ブロックの動きなしに発生するようにASGの初期期間中は、システム内の緩みは明らかです。スラックは、実験ごとに異なりますが、我々の経験では一般的に<1 mmですできます。このような理由から、"プリテンション"1mm/dayのたるみ除去の段階では、一日のために、バイオリアクターの部品が牽引基質の動きを引きつけ、開始、その間ASGスケジュールの前に。
プリテンションのフェーズが完了した後に自動直動テーブルの変位ステップが牽引、ブロックの変位と一致しない場合のトラブルシューティングが必要な場合があります。曳航ブロックの非同期、不正確な変位は、アダプタの曳航ハードウェアと屈曲内で"静止摩擦"や静止摩擦に関連付けられています。発生からこれらの問題を防ぐために、曳航ブロックの動きがスムーズに近い楽な動きのために、組み立て後に、手作業でチェックする必要があります。バインディングが発生した場合、曳航アセンブリは、実験の前に解放されるべきです。アダプタの十分な剛性も曳航ハードウェアの静止摩擦によって克服されていない正確な、同期変位を確保する必要があります。
Disclosures
神経細胞の ex - vivoで機械的な伸びは、米国特許＃6264944と＃7429267の下に特許を取得しています。
Acknowledgments
この作品は、NSF CAREER CBET - 0747615によって賄われていた。著者は、博士に感謝します。彼らの指導と支援のためのダグラスH.スミスとデビッドF.ミーニー。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
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