Summary
독특한 조직 공학 방법은 축삭 스트레치 성장을 recapitulating하여 문화의 수많은 신경 섬유를 길어지다하기 위해 개발되었다; 신경이 확대 본체의 성장과 함께 길어지다 약자 신경계의 성장의 한 형태.
Abstract
사전 시냅스 배아 발달 동안의 연결 프로세스는 성장 원뿔 통해 목표에 도달하는 짧은 거리를 통과. 시간이 지남에의 연결을 somata 인해 확대의 유기체의 골격 성장 (., 회색, Hukkanen 외 1,992 와이즈 1941)에 자신의 축삭 터미널에서 구분됩니다. 이 mechanotransduction은 축삭의 지속적인 신장을 수용할 수의 연결을 성장의 보조 모드 유도 (브레이 1984을, Heidemann하고 Buxbaum 1994, Heidemann, 라무오 외 1995;. 피스터, 이와타 외 2004.).
액슨 스트레치 증가율 (ASG)는 이대로 긴 신경 및 성인 신경계의 특성 흰색 물질 책자에 짧은 배아 프로세스의 성숙의 중심 요소이다. 체외에서 ASG 공부하기 위해, 우리는 문화의 연결의 짧은 axonal 프로세스 (Loverde, Ozoka 외. 2011)에 장력을 적용 bioreactors를 설계. 여기서는 세부 사항 우리가 bioreactors를 준비하고 ASG를 수행하는 데 사용하는 방법을. 첫째, 생물 반응기의 각 스트레칭 차선 내에서 뉴런은 마이크로 조작 견인 기판에 도금입니다. 다음 뉴런은 고정 기판에, 성장 원추 확장을 통해, 자신의 axonal 프로세스를 재생. 마지막으로, 스트레치 성장이 정지 기판을 준수 축삭 터미널에서 도금 세포 기관 멀리 견인에 의해 수행되며 성장 원뿔 확장 후 골격 성장을 recapitulating.
이전 작업은 10cm에 길이를 도달, 배아 쥐 등의 루트 신경의 뉴런의 ASG가 10mm/day에 전례없는 성장 속도까지 할 수있다 나타났습니다, 동시에 증가 axonal 지름의 결과로 동안 (스미스, 울프 외 2001;. 피스터, 이와타 외 2004;. 피스터, Bonislawski 외 2006;. 피스터, 이와타 외 2006;. 스미스 2009 년). . 이것은 재생 성장 원뿔 확장 (기계 자극의 부재에서) 성장률 3cm 미만의 길이로 제한 성공적으로 재생과 평균 1mm/day (.; 피스터, 고든 외 2,011 푸와 고든 1997)에 극적인 대조에 따라서, ASG의 진학은 기계적 자극의 부재에서 재생을 제한 dysregulated 성장 메커니즘을 공개하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
1. 액슨 스트레치 성장 생물 반응기 시스템의 개요
- 두 개의 주된 방법은 뉴런에 실험 세력을 적용하기 위해 이용되었다. 첫 번째 접근에서, 미군은 전체 신경 세포 (.; 체타, Kye 외 2010;.. Lindqvist, 리우 외 2010 류, Franze 외 2006)에 적용됩니다. 두 번째 접근에서 세력은 성장 원추 당겨 축삭에 직접 적용됩니다. 신장에 대한 강제 임계값을 식별, 유리 바늘을 사용하여,이 후자의 접근 방법은 새로운 축삭 (라무오, Heidemann 외 2010.,, 오툴, 라무오 외 2008.. 버널, Pullarkat 외 2007) 모델 형성하기 위해 사용되었습니다 그리고 철회 (Dennerll, 라무오 외 1989;. 정아, 라무오 외 1991;.. 라무오, 청 외 1992), 그리고 (. Siechen, 양 외 2009) 축삭 터미널에서 신경 전달 물질의 클러스터링을 분석합니다. 이 방법의 독특한 조직 공학 확장 큰 용기를 생산하기 위해 개발된 자동 액슨 스트레치 증가율 (ASG) 생물 반응기 시스템 (이와타, 브라운 외 2006..; 피스터, 이와타 외 2006)를 사용 구성. 최근 우리는 (Loverde, Ozoka 외. 2011) 실시간으로 미세 ASG 공부를 생물 반응기 시스템의 소형 버전을 개발했습니다. 여기, 우리는 자세하게 9 일 프로토콜 (표 1) 현재 bioreactors를 준비하고 일상적 ASG 수행하기 위해 사용합니다.
- 전체 작업 : ASG 생물 반응기 시스템은 뉴런은 교양과 뻗어 아르 독립 차선 (길쭉한 우물), 2)와 생물 반응기 챔버 스트레칭 세력 및 3) 단계 모터를 적용하는 자동 직선 운동 테이블 세 가지 주요 구성 요소, 1)로 구성되어 있습니다 스트레치 성장 (그림 1)을 제어하는 소프트웨어와 컨트롤러를 운전.
- 간단히, 생물 반응기의 프로토 타입의 제작은 수직 밀링 머신 (브리지, 엘미라, NY)를 사용하여 기계 공장에서 수행되었다. biocompatibility 들어, 살균 및 내구성의 용이성, 내부 생물 반응기의 구성 요소는 3 / 8 "polyetheretherketone (피크)에서 가공되었습니다. 투명 폴리 카보 네이트는 문화의 빛 현미경 및 볼 수 있도록 뚜껑을 위해 사용되었습니다. 내식성 316 스테인리스 나사 완벽한 하드웨어 어셈블리 (맥매스터 - 카, 엘므허스트, IL).
- 생물 반응기 챔버는 외부 조작 (그림 2) 3 차선, 차선에 걸쳐 세포를 조작 조정 견인 차단하고, 튀어나온 견인 봉을 형성하는 스트레칭 프레임으로 구성되어 있습니다. 의 연결을 문화가 견인 블록 (그림 2 및 3)에서 지원하는 일회용 Aclar 견인 문화 기판에 도금입니다. 일회용 coverslip 고정 기판은 스트레칭 프레임의 하단에 부착하고 모든 3 차선을 펼쳐져. 이전 스트레칭으로, 도금 신경 성장 원추 확장을 통해 정지 기판에 견인 기판에서 axonal 프로세스를 확장해야합니다. 다리 기판이 후 견인 제어 블록의 변위에 의해 스트레치를 받게됩니다 axons의 인구.
- 자동 직선 운동 테이블 delrin 정렬 테이블에 탑재 스테퍼 모터 (HT23 - 397, 응용 모션 제품, 와턴스빌, CA) 및 직선 운동 테이블 (MIPS - 2 - 10 - 1.0mm, 서보 시스템, 몬테빌, NJ)로 구성되어 있습니다 . 생물 반응기 챔버는 직선 운동 테이블 병렬 테이블 안에 앉아있다. 생물 반응기 챔버에서 연장 견인 막대는 어댑터를 사용하여 직선 운동 테이블로 고정됩니다.
- 스텝 모터 드라이브 컨트롤러 (시 2,035, 응용 모션 제품)은 견인 기판의 조작을 제어하는 포함된시 프로그래머 소프트웨어를 사용하여 프로그램입니다. Axonal 스트레칭이 (..; 피스터, 이와타 외 2,006 피스터, 이와타 외 2004) 번 머물러하여 간격 작은 변위 일련의 단계를 복용하여 stepwise 방식으로 적용됩니다. 이 컴퓨터 제어 시스템은 ASG에 맞게 프로파일을 프로그램하는 능력을 제공하며, 주 며칠 동안 지속적인 실험을 위해 필수적입니다.
2. 생물 반응기 챔버의 준비
- 의 연결을 문화 일회용 견인 및 고정 문화 기판 준비 :
- 견인 문화 기판은 8.5에서 버렸어요 Aclar 영화 "X 11"시트 (33C 2.0 달러, 구조 프로브, 웨스트 체스터, PA). 날카로운 칼날을 사용하면 약 0.5 X 2.5cm로 기판을 절단, 또는 양쪽에 최소한 1~2밀리미터 통과를 허용하기 위해 차선의 넓이보다 약간 짧아.
- 살짝 모래 벌금 1200 그릿 샌드페이퍼 (맥매스터 카)를 사용하여 양쪽에서 견인 문화 기판의 아래쪽 3분의 1 차 있습니다. 견인 기판 샌딩하면 coverslip 정지 기판에 견인 기판에서 axons의 성장을 용이하게합니다.
- Aclar의 5 X 7cm 부분을 잘라내거나 (# 4865-1, 뇌 연구 연구소, 뉴턴, MA)를 정지 기판 역할을하는 제 1 유리 coverslip을 사용합니다.
- 클린 일전자 문화 희석 Alconox 솔루션으로 기판 및 정화 DH 2 O.로 철저히 씻어
- 30 분 70 % 에탄올에 집중하여 문화 기판을 소독. 기판은 멸균 조직 문화 후드 이내에 건조 공기를 허용합니다.
- 희석 Alconox 및 압력솥과 생물 반응기 챔버가 압력솥 컨테이너 내에 소독 청소. 즉시 autoclaving 후 멸균 후드로 전송하고 건조한 공기 수 있습니다.
- : 멸균 후드, 접착제 내에 계속 실리콘 RTV (다우 코닝 # 732, 맥매스터 카) 및 멸균 면봉을 사용하여 생물 반응기에 문화 기판은 면봉 (맥매스터 카)를 밀고
- 자신의 전체 수직 위치가 아닌 모래를 뿌린 부분에서 견인 블록 다리 접착제 견인 문화 기판의 견인 차단 다리. 모래를 뿌린 문화의 표면과 접촉을 피하십시오.
- 생물 반응기 챔버의 바닥에 접착제가 정지 문화 기판.
- 부드럽게 붙어 기판에 대한 마른 면봉을 누르하여 여분의 접착제 및 공기 주머니를 제거합니다.
- 신경에 독성 실리콘 RTV의 리치스 초산 때문에, 생물 반응기는 이전의 연결을 문화를 소개하는 2 전체 일 동안 후드 내에서 자외선 아래에서 건조 남아 있습니다.
- 모래를 뿌린 견인 기판 및 정지 기판의 도움말 사이 2-3mm 중복을 달성하기 위해 견인 블록 다리를 낮춥니다. 중요한주의 너무 큰 경우, 견인 기판의 도움말을 정지 기판의에서 비켜 수 있습니다 중복의 크기에 지불되어야하며, 중복 (그림 3) 스팬 axons의 수를 감소.
- 견인 막대 생물 반응기 내부의 철회와 함께 시작 위치에서 견인 블록을 위치. 성장을 스트레칭하기 전에 견인 막대의 움직임을 방지하기 위해 고정 나사를 조이십시오.
3. 문화의 연결
- 10 μg / ML 높은 분자량 각 차선의 기판 인터페이스 영역에서 혈청 무료 미디어 폴리 - D - 라이신 (CAT # 354210, BD, 베드 포드, MA)의 풀 1mL. 실온에서 1 시간 동안 그대로 준수하는 솔루션을 허용합니다. 문화 미디어 헹굼 마지막 다음 DH 2 O와 부드럽게 씻어 배. Pipetting는 기판 인터페이스를 먼, 차선의 뒷면에서 수행되어야합니다.
- 강아지 E16 쥐에서 도설 루트 신경의 explants (DRGs)을 분리. stereomicroscope 사용하여 배양 접시를 사용하여 방울로 explants를 희석. 모래를 뿌린 견인 문화 기판의 가장자리에 100 μL 피펫과 플레이트를 사용하여 3-4 explants를 수집합니다. 케어는 접시 미디어의 작은 웅덩이를 사용하여 견인 기판의 가장자리에 explants를 이동해야합니다. 최대 차선 당 문화 미디어 1mL하기 위해서 explants의 움직임을 제한하면서 몇 시간 동안 증발을 방지하기 위해 충분하다. 미디어 제제 : B - 27 + 0.5mM L - 글루타민 (Invitrogen, 칼스 배드, CA), 1 % FBS - HI (Hyclone, 월섬, MA), 2.5G / L D - 포도당 (G - 7528, 시그마, 세인트로 Neurobasal . 루이스, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) 및 20 μm의 FdU + 20 μm의 제품 유리딘의 mitotic 억제제 (F - 0503, U - 3003, 시그마).
- 뚜껑을 부착하고 세포가 준수 때까지 1 시간 동안이나 인큐베이터로 생물 반응기를 전송합니다.
- explants가 dislodgment을 피하기 위해 먼 지점에서 문화 매체와 생물 반응기를 입력합니다. 뉴런은 정지 기판에 axonal 프로세스를 확장하는 동안 오일 최소 생물 반응기를 품어.
4. 액슨 스트레치 성장
- 생물 반응기는 살균 후드 내부의 최종 준비 절차를 겪습 :
- 인산염은 챔버 문화 미디어의 제한 증발을 ...을 축이다을 살린 버퍼와 생물 반응기 내에서 저수지를 입력합니다. 시스템에서 빈 인클로저 벽 저수지 역할을합니다. 또는, 작은 페트리 접시의 뚜껑은 문화 차선 위에 견인 블록의 양쪽에 게재될 수 있습니다.
- 문화 미디어를 교체하고 용량 차선을 입력합니다. Pipetting는 기판 인터페이스를 먼, 차선의 뒷면에서 수행되어야합니다.
- 자동 직선 운동 테이블 내의 좌석 생물 반응기합니다. 실험 인큐베이터 내에서 실행되어야하는 경우, 그것은 자동 직선 운동 테이블의 잠재적인 부식으로 인해 humidified해서는 안됩니다.
- 견인 막대에 견인 막대 어댑터를 고정.
- 견인 막대 어댑터와 일치하고 무대에 고정하기 위해 직선 운동 테이블의 단계를 조깅시 프로그래머 소프트웨어를 사용합니다. 편의를 위해, 특정 단위로 무대를 조작하기 위해 사전에시 프로그래머 시퀀스를 준비합니다.
- 견인 블록의 자유 운동을 허용하는 생물 반응기 챔버에있는 고정 나사를 풀어.
- 스트레치는 (피스터, 이와타 외. 2006) 시간을 머물러하여 간격 작은 변위 일련의 단계를 시작하여 stepwise 방식으로 적용됩니다. 우리의 패러다임은, 2 μm의 단계마다 172초를 취하여 시작24시간 이상 NET 1mm 스트레치의 결과. 일일 후, 스트레치 속도는 변위를 증가하거나 면만 시간 (표 2)를 줄임으로써 ramped 수 있습니다.
- 일단 ASG가 시작되어 미디어의 변화는 일반적으로 필요하지 않습니다. 시간이 지남에 그러나, 문화, 미디어는 일반적으로 산성 전환과 컬러의 노란 변경으로 분명하다. 추가 실험이 필요한 경우 이전 미디어 부동 axons에 외상을 최소화하기 위해 완전히 탈진 상태 없지만, 대신에 부분적으로만 변경 않습니다.
5. 대표 결과 :
Axonal 프로세스는 매우 신속하고 강력한 스트레치 성장을 받아야 수 있습니다. 처음에는 프로세스가 작고, 드문 변위로 구성되어 그 (≤ 1mm/day) 느린 운동의 기간 시작됩니다. 스트레칭의 첫 24 시간 이내의 연결을 성장 경로의 mechanotransduction가 발생, 약자 뉴런이 축삭 실린더에 추가를 시작합니다. 연속 ASG 24 시간 이내에, axons는 더 크고 더 자주 변위에 증가하고 관용을 보여줍니다. 일반적으로 axons은 1mm/day 모든 12-24시간의 스트레치 속도 (.; 피스터, Bonislawski 외 2006;.. 피스터, 이와타 외 2,006 피스터, 이와타 외 2004)의 증가를 견딜 수 있습니다. 너무 빨리 스트레치 속도를 증가하지만, 선택 axons 더 빠른 성장으로 이어질 수 있습니다뿐만 아니라 분리의 원인이 병적인 폐색으로 이어질 것입니다.
스트레치 성장 axons는 경향이 fascicles의 구조를 닮은, 번들을 형성해야합니다. 현재 프로토콜을 활용, 축삭 번들의 중심, 스트레치 자란 부분은 문화 기판 할 adhesions가 없습니다. 신장 성장 axons만이 처음 준수, 근위 및 말초 구간 문화 기판에 붙어 남아 있습니다. 따라서, 스트레치 재배 axons의 중심 부분은 자유롭게 부유하고, 처리에 의한 방해에 민감합니다.
여러 가지 이유로 들어, 일부 axons은 적용 스트레치 속도로 성장할 수 없습니다. 예를 들어, 두 axonal 프로세스와 DRG의 신경 세포는 스트레치를 겪고 둘 중, 충분한 단백질을 번역하고 적용 스트레치 속도로 성장하지 못할 수 있습니다. 적용 스트레칭을 수용할 수없는 Axons는 포이슨의 효과가 다음과 같은 얇은 것입니다. 이후 스트레칭은 병적인 단절로 이어지는, axons, 억제 어셈블리의 폐색으로 이어질 것입니다. axons의 대다수는, 그러나 성공적으로 ASG 받아야 수 있으며, axons만을 작은 비율이 가지치기와 같은 프로세스를 받고있다.
그림 1. 액슨 스트레치 성장 생물 반응기 시스템. (A) 생물 반응기 배양 챔버 & 자동 직선 운동 테이블, (B) 단계 모터 드라이브 컨트롤러와시 프로그래밍 소프트웨어.
그림 2. 생물 반응기 문화 상공 회의소. 이 만화는 제거 뚜껑과 상단에서 생물 반응기 챔버를 묘사. 견인 블록의 위치는 축삭 스트레치 성장의 마지막 단계를 반영합니다. 스트레치 성장 axons은 문화 차선 이내에 번들로 볼 수 있습니다.
그림 3. 문화 기판 도금 인터페이스를 제공합니다. 이 만화는 측면보기에서 생물 반응기의 각 레인 내에서 견인 장치의 구성 요소를 묘사. 견인 및 정지 문화 기판 (위) 정정 중복됩니다. (아래) 견인 및 정지 기판의 과도한 중복은 견인 기판의 끝부분이 곱슬 곱슬하게됩니다.
영화 1. 생물 반응기 상공 회의소에 문화 기판의 첨부 파일. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
영화 2. 견인 기판에 Explants을 DRG의 도금이. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
영화 3. SiProgrammer 사용가. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
영화 4. 고정 기판에 성장 콘 확장. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
영화 5. 액슨 스트레치 성장. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
| 일 | 단계 |
| 1 | 살균 및 건조 |
| 2 | Gluing & 어셈블리 |
| 4 | 코팅 &의 연결을 문화 도금 |
| 9 | 스트레치 성장 시작 |
표 1. 실험 일정.
| 시간 [시간] | 스트레치 속도 [mm / 일] | 시간 면만 [S] | 총 길이 [mm] | 총 스트레치 시간 [일] | |
| 겉치레 | 24 | 1 | 172.8 | 0 | 1 |
| 스트레치 | 24 | 1 | 172.8 | 1 | 2 |
| 스트레치 | 24 | 2 | 86.4 | 3 | 3 |
| 스트레치 | 24 | 3 | 57.6 | 6 | 4 |
| 스트레치 | 24 | 4 | 43.2 | 10 | 5 |
| 스트레치 | 24 | 5 | 34.6 | 15 | 6 |
표 2. 스트레치 평가 일정. 모든 스트레치 단계 변위 2 μm의 (10 스텝 모터 단계 = 2 μm의 스트레치)입니다.
Discussion
두 중요한 단계는 bioreactors의 준비 기간 동안 관찰해야합니다. 첫째, 기판 인터페이스에서 최적의 중복이 axons은 정지 기판에 간 수 있도록 필요합니다. 지나치게 드러하거나 불완전한 것입니다 Aclar은 (그림 3) 사용해서는 안됩니다. 중복을 최적화하려면, 견인 기판이 2-3mm 긴 연락처 패치를 통해 균일하게 정지 기판을 균일하게 모래를 뿌려 장식 및 연락처 있는지 확인합니다. 중복은 조심스럽게 견인 다리의 높이를 조정하여 사전에 각 실험을 최적화해야합니다.
둘째, 뉴런의 첨부 파일 제공함과 동시에, 기판 코팅 axons (; 피스터, 이와타 외 2004;.. Loverde, Ozoka 외 2,011 Heidemann 및 Buxbaum 1990)의 생물 반응기 및 수축성 긴장의 변위로 인한 상당한 쉬어링 세력을 유지. 기판 전에 리신 코팅하고, 이후 두 소독 물로 깨끗이 씻어서해야합니다. 코팅은 갓 해동 aliquots의 적용으로 고르게 가능한 보급하여야한다. 부착 기간 동안 중요한 기판은 이동하지 않아야하거나 방해. 이후 단계에서는 도금하는 동안 기판과의 접촉되지 않도록하고, 멀리 기판 인터페이스에서 차선의 맨 끝에서 pipet 모든 솔루션을.
각각의 생물 반응기 구성 요소의 연결에 허용 오차는 게으름의 형태로 매니 페스트 수 있습니다. 자동 직선 운동 테이블의 운동이 견인 블록의 움직임없이 발생으로 ASG의 초기 기간 동안 시스템에 이완은 분명하다. 슬랙 실험마다 다를 수 있지만, 우리의 경험에서 일반적으로 <1mm입니다 수 있습니다. 이러한 이유로 들어, "사전 긴장감"1mm/day의 게으름 반감기는 하루, 생물 반응기 부품이 견인 기판의 움직임을 참여하고 시작하는 동안 ASG 일정을 앞에.
자동 직선 운동 테이블의 변위 단계 미리 장력 단계 후 견인 블록의 변위와 일치하지 않는 경우 문제 해결이 필요한 수하면 완료됩니다. 견인 블록의 비동기, 정확 변위는 'stiction'또는 정적 마찰이 견인 하드웨어 이내에 어댑터의 flexing과 연결되어 있습니다. 발생하는 이러한 문제를 방지하기 위해 견인 블록의 움직임이 원활하게 가까운 손쉽게 운동을 위해, 조립 후 수동으로 확인하여야한다. 바인딩이 발생하면 견인 조립은 실험하기 전에 해제되어야합니다. 어댑터의 충분한 강성도 견인 하드웨어의 stiction에 의해 극복되지 않은 정확한 동기 변위를 보장하기 위해 필요합니다.
Disclosures
의 연결을 세포의 전 생체내 기계 신장은 미국 특허 # 6,264,944 및 # 7,429,267에 따라 특허입니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF 경력 CBET - 0747615에 의해 투자되었다. 저자 DRS 감사하고 싶습니다. 그들의 비열한 짓들을 및 지원에 대한 더글러스 H. 스미스와 데이비드 F. 미니.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyEtherEtherKetone (PEEK) | McMaster-Carr | 8504K69 | Custom made bioreactor chamber |
| Polycarbonate | McMaster-Carr | 8574K28 | Custom made bioreactor chamber lid |
| Stepper motor | Applied Motion Products, Watsonville, CA | HT23-397 | |
| Linear motion table | Servo Systems, Montville, NJ | MIPS-2-10-1.0mm | |
| Step motor drive controller | Applied Motion Products, Watsonville, CA | Si2035 | |
| Aclar | Structure Probe Inc., West Chester, PA | 1859 | Towing culture substrates |
| No. 1 coverslip | Brain Research Labs, Newton, MA | 4865-1 | Stationary culture substrate |
| Silicon RTV | McMaster-Carr | 7587A37 | |
| Cotton-tipped swabs | McMaster-Carr | 7074T62 | |
| Poly-D-Lysine | BD Biosciences | 354210 |
References
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