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Neuroscience

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

Published: January 5, 2012 doi: 10.3791/2760

Summary

Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire ripetitivo

Abstract

Imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni 1 nei topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere proteine ​​fluorescenti in specifici tipi cellulari 03/02 ha notevolmente ampliato la nostra conoscenza dei processi fisiologici e patologici in numerosi tessuti in vivo 4-7. Negli studi del sistema nervoso centrale (SNC), c'è stata una vasta applicazione di imaging in vivo del cervello, che ha prodotto una pletora di nuove e spesso inattese scoperte sul comportamento delle cellule come i neuroni, astrociti, microglia, in condizioni fisiologiche o patologiche 8-17. Tuttavia, le complicanze per lo più tecnici hanno limitato l'attuazione di imaging in vivo negli studi del midollo spinale del mouse vivente. In particolare, la vicinanza anatomica del midollo spinale ai polmoni e al cuore genera artefatti significativo movimento che rende l'imaging del midollo spinale che vivono un compito impegnativo. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che supera i limiti intrinseci di imaging del midollo spinale mediante la stabilizzazione della colonna vertebrale, la riduzione delle vie respiratorie indotta da movimenti e facilitando così l'utilizzo della microscopia a due fotoni per l'immagine del midollo spinale del mouse in vivo. Questo si ottiene combinando un dispositivo personalizzato di stabilizzazione vertebrale con un metodo di anestesia profonda, con una conseguente significativa riduzione delle vie respiratorie indotta movimenti. Questo protocollo video mostra come esporre una piccola zona del midollo spinale vivente che può essere mantenuto in condizioni fisiologiche stabili per lunghi periodi di tempo, mantenendo danno tissutale e sanguinamento al minimo. Rappresentante immagini RAW acquisite in dettaglio vivo in alta risoluzione la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione. Una sequenza timelapse mostra il comportamento dinamico dei processi microgliali nel midollo spinale del mouse vivente. Inoltre, una scansione continua della stessa z-frame dimostrares la stabilità eccezionale che questo metodo può raggiungere per generare pile di immagini e / o filmati timelapse che non richiedono l'allineamento dell'immagine post-acquisizione. Infine, ci mostrano come questo metodo può essere usato per rivisitare e re-imaging stessa area del midollo spinale in seguito timepoints, consentendo studi longitudinali in corso di processi fisiologici o patologici in vivo.

Protocol

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1. Costruire il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale

  1. Ordina la STS-A Narishige Morsetti Compact midollo spinale e la MA-6N Narishige adattatore in mano la testa.
  2. Design personalizzato e fare una piastra di base in acciaio inox per tenere le due parti Narishige in allineamento in modo che la testa dell'animale è supportato mentre la sua spina dorsale e la coda sono bloccato. Tenete presente che l'intero dispositivo dovrebbe andare bene sotto la lente microscopio di solito su un palco microscopio abbassato.

2. Animal chirurgia

  1. Pre-riscaldare la camera di microscopio con un dispositivo di riscaldamento ad aria e mantenerla a 37 ° C.
  2. Pesare l'animale ed effettuare il mix di anestetico con 100 mg di ketamina, 15 mg e 2,5 xylazina acepromazina mg per kg di peso corporeo, diluito in soluzione di NaCl 0,9% in condizioni di sterilità.
  3. Anestetizzare l'animale, iniettando l'anestetico mix (KXA) per via intraperitoneale. Pizzicare piedi regolari devono essere eseguiti per garantire l'anestesia profonda in tuttol'esperimento. Supplemento con metà della dose iniziale oraria o, se necessario.
  4. Utilizzare una piccola piastra elettrica animali per fornire supporto termico durante l'esecuzione della procedura chirurgica.
  5. Applicare artificiale unguento lacrime sugli occhi per prevenire la disidratazione della cornea e danni.
  6. Radersi la parte posteriore del primo animale con un dispositivo di taglio e poi con una lama affilata per rimuovere completamente i capelli dalla zona intorno l'incisione.
  7. Rimuovere i capelli rasati e disinfettare la superficie della pelle rasata con un tampone di alcool.
  8. Eseguire un piccolo (~ 1,5 cm) incisione longitudinale della pelle sopra il livello desiderato spinale (vertebre toraciche mostrato qui).
  9. Esporre la muscolatura della schiena ritraendo con cura il tessuto connettivo sottocutaneo.
  10. Separare con attenzione i muscoli paravertebrali dalla colonna vertebrale al livello desiderato. Eseguire il minor numero di incisioni possibile staccare i muscoli da entrambi i lati di ogni processo spinoso e poi raschiare i muscoli staccò unavia dalla superficie laminare.
  11. Scegli la lamina che verrà rimosso e preparare i siti di ingresso per i morsetti spinale su entrambi i lati della colonna vertebrale, immediatamente rostrale e caudale alla laminectomia. Con attenzione spostare tessuto muscolare per fare quattro tasche dove i morsetti verrà inserito.
  12. Sollevare la colonna vertebrale con la dentatura diritta punta pinze per consentire l'inserimento sicuro delle curve punta smussata forbici sotto la lamina senza toccare il midollo spinale. Eseguire la laminectomia lentamente tagliando l'osso da un lato e poi dall'altro lato.
  13. Utilizzare un tampone di cotone o inserire pretagliati piccoli pezzi Gelfoam assorbibile spugna di gelatina accanto al incisioni di limitare sanguinamento minore. Utilizzare un cauterizer piccolo vaso per controllare l'emorragia ulteriormente se necessario. Usa preriscaldato sterile fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per lavare i tessuti.

3. Stabilizzazione della colonna vertebrale e la preparazione per imaging in vivo

  1. Plac e l'animale su una base di elevazione sulla piastra di base del dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e fissare la testa l'adattatore capo azienda.
  2. Posizionare i morsetti spinale della STS-Un dispositivo lungo la asse anteriore-posteriore dell'animale nel pre-preparati tasche che fiancheggiano il laminectomia (Figura 1). I due morsetti deve essere posizionato con un angolo di circa 45 ° rispetto alla dell'animale asse rostro-caudale per consentire spazio sufficiente per abbassare una lente immersione in acqua oltre il midollo spinale esposti (Figura 1).
  3. Posizionare il morsetto terzo della STS-Un dispositivo alla base della coda così corpo dell'animale possono essere sospesi in aria dopo la rimozione del tampone elevazione per tutta la durata degli esperimenti di imaging (Figura 1).
  4. Costruire un piccolo pozzo di Gelseal (Amersham Biosciences Corp.) intorno al midollo spinale esposti a facilitare il mantenimento del midollo spinale in ACSF e l'immersione della lente microscopio in questa soluzione per imaging in vivo.
jove_title "> 4. Nel imaging in vivo del midollo spinale di topo con la microscopia a due fotoni

  1. Trasferire l'animale sul dispositivo di stabilizzazione spinale all'interno della camera preriscaldato che copre il microscopio e fissarlo su un palco microscopio abbassato posizionando il laminectomia direttamente sotto la lente (Figura 1).
  2. Inferiore ad acqua immersione lente con attenzione nella soluzione ACSF facendo attenzione che non tocchi i morsetti spinale o il Gelseal.
  3. Usa epifluorescenza per identificare l'area di interesse e concentrarsi su di esso. Passa alla modalità di scansione laser e di eseguire imaging in vivo utilizzando l'apposito a due fotoni laser a lunghezza d'onda di eccitazione, dicroici e filtri passa-banda per la fluorofori presenti nel tessuto fotografato.

5. Immagini ripetitive e assistenza post-operatoria

  1. Alla fine degli esperimenti di imaging, togliere il mouse dal dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e asciugare con cura il Gelseal dalla zona intorno alla laminectomia.Pulire bene la zona.
  2. Ripristinare e suturare i muscoli della schiena sopra la laminectomia.
  3. Ripristinare e suturare la pelle sopra la laminectomia, è tampone con Betadine.
  4. Fornire 1 ml di soluzione lattato Ringers (Baxter Healthcare) come supplemento nutritivo e l'idratazione, così come il trattamento analgesico per via sottocutanea (0,1 mg / kg di buprenorfina).
  5. Somministrare per via intraperitoneale antisettico trattamento (0,03 ml per il mouse, 2,27% soluzione iniettabile enrofloxacina antibatterici).
  6. Animale posto su una piastra elettrica fino a pieno recupero dall'anestesia e successivamente casa individualmente.
  7. Ripetere la somministrazione antisettico giorno per i primi 3-5 giorni dopo l'intervento chirurgico e un trattamento analgesico ogni 8-12 ore per 2-3 giorni dopo l'intervento. Monitoraggio animali al giorno per garantire un comportamento normale e pieno recupero.
  8. Per re-imaging attraverso la laminectomia stesso, riaprire la pelle suturata e muscoli e ripetere i passaggi descritti nelle sezioni 2 - 4.
  9. Ri-localizzare la preceously ripreso zona utilizzando i vasi sanguigni come una mappa come descritto in precedenza 10.

6. Rappresentante risultati

Tutte le procedure di animali sono state effettuate in base agli orientamenti fissati dal Animal Care istituzionali e dei Comitati Usa presso la University of California, San Francisco e sono conformi alle normative federali. Una foto del dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e uno schema che mostra il posizionamento del mouse sul dispositivo sotto una lente microscopio è mostrato in Figura 1. Lasciando spazio sufficiente per i movimenti respiratori sotto il corpo dell'animale assicura stabile imaging in vivo nel midollo spinale. La figura 2 mostra la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione come è stato ripreso in vivo nel midollo spinale di CX3CR1 GFP / + topi transgenici 18, microglia, in cui sono endogenamente etichettati con GFP. Figura 3 mostra alcuni esempi di ripetitivoimaging in vivo come è stato eseguito nelle stesse aree del midollo spinale nei topi che esprimono una proteina fluorescente negli assoni spinali (YFP-H linea 3) e microglia (nel CX3CR1 GFP / + topi).

Figura 1
Figura 1. Stabilizzazione della colonna vertebrale del mouse per imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni. (A) Una misura piastra di base in acciaio viene utilizzata per supportare e allineare la STS-A Narishige morsetti compatti del midollo spinale e la MA-6N Narishige testa in possesso di adattatore come mostrato qui. (B) Il corretto posizionamento di topi transgenici adulti anestetizzati con un anestetico KXA sul dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale. L'inserto viene illustrata la posizione dei morsetti spinale immediatamente rostralmente e caudalmente alla laminectomia e il tessuto esposto midollo spinale.

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Figura 2. Imaging in vivo ad alta densità di cellule microgliali e dei vasi sanguigni nel midollo spinale di topi anestetizzati. Proiezione ma non allineati z-pile di (A) ad alta densità GFP-positive microglia (verde) nel midollo spinale di una GFP CX3CR1 / mouse + in stretta vicinanza con i vasi sanguigni (rosso, marcato con l'iniezione endovenosa di rodamina destrano). (B) ingrandimento dell'immagine ad alta etichettato come in (A) di una singola cellula della microglia attaccato alla parete di un vaso sanguigno con i processi esteso intorno alla nave e verso il parenchima del midollo spinale. Barre di scala, 10μm.

Figura 3
Figura 3. Ripetuti negli imaging in vivo dei segmenti stessi assonale e microglia come sono stati trasferiti e re-imaging nel midollo spinale di topi anestetizzati in giorni diversi. (A) YFP-lab assoni forme ai giorni 0 e 5. (B). Le stesse strutture vascolari e cellule della microglia che li circonda ripreso in vivo nel midollo spinale di CX3CR1 GFP / mice + ai giorni 0 e 1. Barre di scala, 10μm.

Movie 1. Sequenza Timelapse rappresentante acquisito in vivo dal midollo spinale di topo. Questa sequenza mostra in dettaglio la dinamica sottile processo di microglia (verde) e le loro interazioni con il sistema vascolare (rosso, marcato con rodamina iv iniezione di destrano) nel tempo all'interno di un tessuto densamente popolato con strutture fluorescenti. Le immagini RAW sono stati solo corretti per il rumore di fondo, la luminosità e il contrasto e il film timelapse è stato costruito da z-stack proiettando immagini in sequenza acquisita, senza allineamento dell'immagine, con una media o z-selezione di piani individuali. I vasi sanguigni passare attraverso una serie simile di aerei z come le immagini della microglia. Z profondità aereo: 38 micron.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Clicca qui per guardare il film.

Movie 2. Sequenza Timelapse dimostrare la stabilità prime del metodo di imaging a livello di un singolo piano z. Rapida acquisizione dello stesso singolo piano z nel midollo spinale di topi GFP CX3CR1 / + immessi sul dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale in anestesia KXA, dimostra cilindrata minima immagine tra fotogrammi consecutivi ad una velocità di scansione di 1 frame / s che è più veloce della frequenza respiratoria del mouse. La cilindrata minore residuo è probabilmente dovuto al battito cardiaco. Clicca qui per guardare il film.

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Discussion

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Il metodo qui descritto consente di stabile e ripetitivo nel imaging in vivo di densamente popolate strutture fluorescenti cellulari nel midollo spinale di topi anestetizzati utilizzando la microscopia a due fotoni. La stabilità raggiunta è il risultato di un dispositivo su misura di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico che riduce respiratoria indotta artefatto movimento. Il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale permette di respiro sotto il corpo del mouse e possono essere costruiti utilizzando fascette spinale disponibili in commercio e pezzo testa di montaggio (Fig. 1). Il metodo è altamente riproducibile, minimamente invasiva e genera costantemente i dati grezzi che possono essere utilizzati per le analisi sperimentali senza immagine vasto post-processing (Fig.2 e Video 1). Questa tecnica può quindi essere utilizzati per studi di interazioni cellula-cellula nel abbondanza di linee disponibili in commercio del mouse fluorescenti (Fig. 1-3 e Video 1). Questo metodo può risolvere non solo le strutture cellulari densamente popolate, ma unLSO rapidamente si verificano funzioni cellulari o risposte (Video 1, 2). Per esempio, può essere utilizzato per misurare quantitativamente le dinamiche di processo della microglia nel tempo e distanza percorsa durante il comportamento chemiotattica. Quantificazione può essere eseguita come abbiamo precedentemente descritto per le risposte di imaging microglia nel cervello vivente 8. Inoltre, può essere utilizzato in combinazione con altri approcci sperimentali, come l'uso di microsfere fluorescente per misurare la fagocitosi microglia nel midollo spinale in vivo.

La possibilità di effettuare ripetute imaging in vivo della zona esattamente lo stesso nel midollo spinale degli animali stessi in giorni diversi permette di studiare la progressione dei fenomeni biologici e la dissezione della sequenza di eventi che potrebbero per esempio essere coinvolti con lo sviluppo della malattia . Applicazione di successo di questo metodo per gli studi longitudinali si basa sulla disponibilità di punti di riferimento del tessuto per affidabilitàabilmente spostando le aree che in precedenza erano immaginato. Questo deve essere preso in considerazione, in particolare per gli studi di lesione al midollo spinale. Per esempio in alcuni dei modelli comunemente usati midollo spinale pregiudizio, come la contusione del midollo spinale o emisezione dorsale della lesione enorme necrotico che viene generato all'epicentro della lesione provoca significativo riassetto assonale e vascolari che potrebbero ostacolare la delocalizzazione dell'area precedentemente immaginato. Questo può essere colpito da ripetuti eseguire imaging in vivo ai margini della lesione o selezionando un modello di lesione che causa una mirata, lesione più piccola, come il modello sottile transezione ago 19.

Il metodo descritto qui espone un piccolo segmento del midollo spinale, effettuando una laminectomia solo sopra l'area di imaging di destinazione. La questione di fondo dura è stata lasciata intatta, se possibile. Questo assicura perturbazione minima del tessuto ripreso sotto le meningi e minimizza l'infortunio sostenutealla colonna vertebrale dell'animale. Il sistema di stabilizzazione complessiva può essere facilmente adattato per l'immagine sia attraverso lo spazio interlaminare senza eseguire una laminectomia 20 o attraverso molteplici laminectomia seriale se una rispettivamente più piccola o una finestra di imaging più grande è preferito per un dato studio.

Come è comune con la maggior parte delle tecniche in vivo, i risultati ottenuti utilizzando questo metodo di imaging in vivo può dipendono fortemente l'utilizzo di un'anestesia corretta. Il mix KXA anestetico che si raccomanda qui è stato utilizzato anche in studi di imaging di tessuti diversi prima 21-24 e stato scelto esclusivamente in base alla sua capacità di ridurre in modo significativo i movimenti respiratori. Altri approcci anestetico può produrre risultati comparabili a questo mix KXA.

La tecnica di imaging del midollo spinale descritto in questo protocollo fornisce un potente strumento per la ricerca del midollo spinale, dal momento che la possibilità di registrare interazioni cellula-cellula in t realeime può facilitare notevolmente studi in vivo del midollo spinale in fisiologia e patologia.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Multiple Sclerosis Society concedere RG4595A1 / T per DD e il NIH / NINDS concede NS051470, NS052189 e NS066361 alle figure KA e film adattato e / o ristampati da Davalos et al., J Metodi Neurosci. Mar 2008 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, con il permesso di Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhodamine B dextran Invitrogen D1841 70 kDa, diluted in
ACSF (3% w/v)
Ketamine HCl Bioniche Pharma NDC No: 67457-001-10 Injectable, 50mg/ml
Anased Lloyd, Inc. NADA No: 139-236 Xylazine injectable,
20mg/ml
Acepromazine Vedco, Inc. NADA No: 117-531 Injectable,10mg/ml
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. NDC No: 57319-760- 25 Lubricant
Betadine Fisher Scientific 19-061617
McPherson-Westcott Scissors World Precision Instruments, Inc. 555500S Curved, blunt-tipscissors
Straight Forceps World Precision Instruments, Inc. 555047FT Toothed tip forceps
Small vessel cauterize Fine Science Tools 18000-00
Gelfoam Pharmacia Corporation (Pfizer) Mixer Mill MM400
Compact spinal cord clamps Narishige International STS-A
Head holding adaptor Narishige International MA-6N
Gelseal Amersham 80-6421-43
Lactated Ringers Baxter Internationl Inc. 2B8609
Buprenex Reckitt Benckiser NDC No: 12496- 6757-1 Buprenorphine,injectable
Baytril Bayer AG NADA 140-913 Enrofloxacin,
antibacterial injectable
2.27% (20ml)
Heating pad - Large Fine Science Tools 21060-10

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References

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Imaging <em>in vivo</em> del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia
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Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (59), e2760, doi:10.3791/2760 (2012).More

Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (59), e2760, doi:10.3791/2760 (2012).

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