Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi

Published: January 5, 2012 doi: 10.3791/2760

Summary

En minimalinvasiv protokoll för att stabilisera musen ryggraden och utföra repetitiva

Abstract

In vivo-avbildning med två-photon mikroskopi 1 i möss som är genetiskt modifierade att uttrycka fluorescerande proteiner i specifika celltyper 2-3 har betydligt breddat vår kunskap om fysiologiska och patologiska processer i många vävnader in vivo 4-7. I studier av det centrala nervsystemet (CNS), har det funnits en bred tillämpning av in vivo imaging i hjärnan, som har producerat en uppsjö av nya och ofta oväntade rön om beteendet av celler som nervceller, astrocyter, mikroglia, under fysiologiska eller patologiska tillstånd 8-17. Har dock mestadels tekniska komplikationer begränsat genomförandet av in vivo imaging i studier av levande mus ryggmärgen. Framför allt genererar de anatomiska närheten av ryggmärgen till lungorna och hjärtat betydande rörelse artefakt som gör bildbehandling levande ryggmärgen en utmanande uppgift. Vi utvecklade en ny metod som överbryggar de inneboende begränsningarna i ryggmärgen avbildning genom att stabilisera ryggraden, minska respiratorisk-inducerade rörelser och på så sätt underlätta användningen av två-photon mikroskopi för att bilden på musen ryggmärgen in vivo. Detta uppnås genom att kombinera en anpassad spinal stabilisering enhet med en metod för djup anestesi, vilket resulterar i en betydande minskning av andnings-inducerad rörelser. Denna video protokoll visar hur man utsätta ett litet område av den levande ryggmärgen som kan underhållas under stabila fysiologiska förhållanden under lång tid genom att hålla vävnadsskada och blödning till ett minimum. Representant råbilder förvärvade in vivo detalj i hög upplösning det nära förhållandet mellan mikroglia och kärlsystemet. En timelapse sekvens visar dynamiska beteende microglial processer i levande mus ryggmärgen. Dessutom en kontinuerlig genomsökning av samma z-ram visarär det enastående stabilitet som denna metod kan åstadkomma för att skapa högar av bilder och / eller filmer timelapse som inte kräver bildjustering efter förvärvet. Slutligen visar vi hur denna metod kan användas för att se över och Reimage samma område av ryggmärgen vid senare tidpunkter, vilket möjliggör longitudinella studier av pågående fysiologiska eller patologiska processer in vivo.

Protocol

1. Bygga spinal stabilisering enhet

  1. Beställ Narishige STS-A Compact ryggmärg skruvtvingar Narishige MA-6N huvudet håller adaptern.
  2. Egen design och göra en rostfri bottenplatta för att hålla två Narishige delar i anpassningen så att djurets huvud stöds medan dess ryggrad och svans är fästa. Tänk på att hela enheten ska passa under mikroskop objektivet oftast på en sänkt mikroskop skede.

2. Animal operation

  1. Förvärmning av mikroskop kammaren med en luft uppvärmningsanordning och bibehålla den vid 37 ° C.
  2. Väg djuret och göra narkos blanda med 100 mg ketamin, 15 mg xylazin och 2,5 mg acepromazin per kg kroppsvikt, utspädd i 0,9% NaCl-lösning under sterila förhållanden.
  3. Bedöva djur genom att injicera bedövningsmedel mix (KXA) intraperitonealt. Regelbundna tå nyper bör utföras för att säkerställa djup anestesi under helaförsöket. Komplettera med hälften av den ursprungliga dosen per timme eller vid behov.
  4. Använd en liten rondell djur värme för att ge värme stöd när de utför det kirurgiska ingreppet.
  5. Ge konstgjord tårar salva över ögonen för att förhindra att hornhinnan uttorkning och skador.
  6. Shave baksidan av djuret först med en trimning enhet och sedan med en vass kniv att helt ta bort hår från området runt snittet.
  7. Ta bort rakat hår och desinficera rakade hudytan med en spritsudd.
  8. Gör en liten (~ 1,5 cm) längsgående snitt i huden över önskad spinal nivå (ryggkotor visas här).
  9. Exponera ryggmuskulaturen genom att försiktigt dra tillbaka subkutan bindväv.
  10. Separera försiktigt paravertebral musklerna från ryggraden på önskad nivå. Utför minsta möjliga snitt för att koppla loss musklerna från båda sidor av varje ryggkotornas process och sedan skrapa loss musklerna envägen från laminärt ytan.
  11. Välj lamina som kommer att tas bort och förbereda platser för inresa för spinal klämmor på varje sida av ryggraden, omedelbart rostralt och caudal till laminektomi. Försiktigt tränga muskelvävnad att göra fyra fickor där klämmorna kommer att införas.
  12. Lyft ryggraden med den raka tandade spets pincett för att möjliggöra säker införandet av den böjda trubbig spets sax under lamina utan att röra ryggmärgen. Utför laminektomi genom att långsamt skära benet på ena sidan och sedan på den andra sidan.
  13. Använd en bomullspinne eller infoga färdigskurna små gelfoam absorberbara gelatin svamp bitar bredvid snitt för att begränsa mindre blödningar. Använd en liten fartyg cauterizer att kontrollera vidare blödning vid behov. Använd förvärmd sterila konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) att tvätta vävnad.

3. Stabilisering av ryggraden och förberedelse för in vivo imaging

  1. Plac e djuret på en höjd pad på bottenplattan av spinal stabilisering enhet och säkra huvudet i huvudet håller adaptern.
  2. Placera spinal klämmor av STS-En enhet längs den främre-bakre axeln på djur i de tillagade fickor flankerar laminektomi (Figur 1). De två klämmor bör placeras i en vinkel på ~ 45 ° i förhållande till djurets Rostro-caudal axel att ge tillräckligt utrymme för att sänka en lins nedsänkning i vatten över utsatta ryggmärgen (Figur 1).
  3. Placera den tredje klämma av STS-En enhet vid svansroten så att djurets kropp kan vara svävande i luften efter avlägsnande av höjden pad för den tid imaging experiment (figur 1).
  4. Bygg en liten brunn Gelseal (Amersham Biosciences Corp) runt den exponerade ryggmärgen för att underlätta underhållet av ryggmärgen i ACSF och nedsänkning av mikroskopet objektiv i denna lösning för in vivo imaging.
jove_title "> 4. In vivo imaging av musen ryggmärgen med två-foton mikroskopi

  1. Överför djuret på spinal stabilisering enhet inne i förvärmd kammaren täcker mikroskop och säkra den på en sänkt mikroskop skede placera laminektomi rakt under linsen (Figur 1).
  2. Lägre ett vatten-nedsänkning glaset försiktigt i ACSF lösningen att se till att den inte vidrör spinal klämmor eller Gelseal.
  3. Använd epifluorescence att identifiera intresseområde och fokusera på det. Växla till laserskanning läge och utföra in vivo imaging med rätt två-photon våglängd lasern excitation, dichroics och bandpassfilter för fluoroforer finns i avbildas vävnad.

5. Repetitiva avbildning och postoperativ vård

  1. I slutet av imaging experiment, ta bort musen från spinal stabilisering enheten och försiktigt torka Gelseal från området runt laminektomi.Rengör området väl.
  2. Återställ och sutur ryggmuskulaturen över laminektomi.
  3. Återställ och sutur i huden över laminektomi, kompress det med klorhexidinlösning.
  4. Ge 1 ml laktat Ringers lösning (Baxter Healthcare) som näring och släckning komplettera, liksom smärtstillande behandling subkutant (0,1 mg / kg buprenorfin).
  5. Administrera antiseptisk behandling intraperitonealt (0,03 ml per mus, 2,27% enrofloxacin injicerbara antibakteriell lösning).
  6. Placera djur på en värmedyna tills full återhämtning från anestesi och därefter hus det individuellt.
  7. Upprepa antiseptiska administration dagligen under de första 3-5 dagarna efter operationen och smärtstillande behandling var 8-12 timmar 2-3 dagar postoperativt. Övervaka djur dagligen för att säkerställa normal beteende och fullständig återhämtning.
  8. För re-imaging genom samma laminektomi, öppna sys hud och muskler och upprepa stegen som beskrivs i avsnitt 2 - 4.
  9. Re-lokalisera tidigaregare avbildade området genom att använda blod kärlsystemet som en karta som tidigare beskrivits 10.

6. Representativa resultat

Alla animaliska förfarandena har genomförts enligt riktlinjer som fastställts av institutionella Djurvård och kommittéer Använd vid University of California, San Francisco och är i enlighet med federala bestämmelser. En bild av spinal stabilisering enheten och en schematisk visar placering av en mus på enheten under ett mikroskop lins visas i figur 1. Att tillåta tillräckligt utrymme för att andas rörelser under djurets kropp säkerställer stabil in vivo imaging i ryggmärgen. Figur 2 visar det nära sambandet mellan mikroglia och kärlsystemet som det var avbildad in vivo i ryggmärg från Cx3cr1 GFP / + transgena möss 18, där mikroglia är endogent märkta med GFP. Figur 3 visar exempel på repetitivain vivo imaging som utfördes i samma ryggmärgen områden i möss som uttrycker ett fluorescerande protein i spinal axoner (YFP-H linje 3) och mikroglia (i Cx3cr1 GFP / + möss).

Figur 1
Figur 1. Stabilisering av musen ryggraden för in vivo-avbildning med två-photon mikroskopi. (A) En skräddarsydd stål bottenplatta används för att stödja och anpassa STS-A Narishige kompakt ryggmärgen klämmor och MA-6N Narishige huvudet håller adaptern som visas här. (B) korrekt placering av vuxna transgena möss bedövas med en KXA bedövningsmedel på spinal stabilisering enhet. Insatsen visar placeringen av spinal klämmor omedelbart rostrally och caudally till laminektomi och den exponerade ryggmärg.

<img alt = "Bild 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" />
Figur 2. In vivo avbildning av hög densitet mikrogliacellerna och blodkärl i ryggmärgen på sövda möss. Projected men alliansfria z-stackar av (A) mycket tät GFP-positiva mikroglia (grön) i ryggmärgen på en CX3CR1 GFP / + mus i närheten med blodkärl (röd, märkt med intravenös injektion av Rhodamine dextran). (B) Hög förstoring bild märkta som i (A) av en enda microglial cell fäst på väggen i ett blodkärl med processer förlängd runt fartyget och mot ryggmärgen parenkymet. Skala barer, 10μm.

Figur 3
Figur 3. Repetitiva in vivo imaging av samma axonal segment och mikroglia som de flyttades och reimaged i ryggmärgen på sövda möss på olika dagar. (A) YFP-lab eLED axoner dag 0 och 5. (B). Samma vaskulära strukturer och mikrogliacellerna runt dem avbildas in vivo i ryggmärg från Cx3cr1 GFP / Möss dag 0 och 1. Skala barer, 10μm.

Film 1. Representant timelapse sekvens som förvärvats in vivo från musen ryggmärgen. Denna sekvens visar i detalj fina microglial processen dynamik (grön) och deras interaktion med kärlsystemet (röd, märkt med intravenös injektion av Rhodamine dextran) över tiden inom en vävnad tätbefolkat med fluorescerande strukturer. Den råa bilderna var bara korrigerat för bakgrundsljud, ljusstyrka och kontrast och timelapse film byggdes av z-projicera sekventiellt förvärvade bild stackar, utan bildjustering, utjämning eller z-urval av enskilda flygplan. Blodkärl gå igenom ett liknande utbud av z plan som bilder av mikroglia. Z-planet djup: 38 ìm.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Klicka här för att se filmen.

Film 2. Timelapse sekvens som visar den råa stabilitet avbildningsmetod i nivå med ett enda z-plan. Snabb förvärv av samma enda z-plan i ryggmärg från CX3CR1 GFP / + möss som släpps ut på spinal stabilisering enhet under KXA anestesi, visar minimal bild förskjutning mellan två bildrutor i en skanning hastighet av 1 bild / s som är snabbare än andningsfrekvens av musen. Den mindre kvarstående förskjutning beror sannolikt på hjärtslag. Klicka här för att se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs här tillåter stabila och repetitiva in vivo avbildning av tätbefolkade fluorescerande cellulära strukturer i ryggmärgen hos sövda möss med två-photon mikroskopi. Den stabila är ett resultat av en skräddarsydd spinal stabilisering enhet och en anestesimetod som minskar andningsfrekvensen-inducerad rörelse artefakt. Spinal stabilisering Enheten tillåter andrum under musen kroppen och kan byggas med kommersiellt tillgängliga spinal klämmor och huvudet montering bit (Fig. 1). Metoden är mycket reproducerbar, minimalt invasiva och konsekvent genererar rådata som kan användas för experimentella analyser utan omfattande bild efterbehandling (Fig.2 och Video 1). Denna teknik kan därför användas för studier av cell-cell interaktioner i överflöd av kommersiellt tillgängliga fluorescerande mus linjer (bild 1-3 och Video 1). Denna metod kan lösa inte bara tätbefolkade cellstrukturer utan enLSO sker snabbt cellulära funktioner eller svar (Videos 1, 2). Till exempel kan den användas för att kvantitativt mäta microglial processen dynamik över tiden samt sträcka som tillryggalagts under kemotaxi beteende. Kvantifiering kan utföras som vi tidigare beskrivits för avbildning microglial svar i den levande hjärnan 8. Dessutom kan det användas i kombination med andra experimentella metoder såsom användning av fluorescerande mikrosfärer att mäta microglial fagocytos i ryggmärgen in vivo.

Förmågan att utföra repetitiva in vivo imaging av exakt samma område i ryggmärgen på samma djur på olika dagar kan studera utvecklingen av biologiska fenomen och dissektion av det händelseförlopp som skulle till exempel vara med utveckling av sjukdomen . Framgångsrik tillämpning av denna metod för longitudinella studier beroende på tillgången av vävnad landmärken för tillförlitligskickligt flytta områden som tidigare var avbildade. Detta måste beaktas särskilt för spinal studier sladd skada. Till exempel i några av de vanligaste ryggraden modeller ryggmärgsskada som ryggmärgen kontusion eller rygg hemisection de massiva nekrotiska lesionen som genereras i centrum för den skada som orsakar betydande axonal och vaskulär ombildning som kan hindra omlokalisering av tidigare avbildade området. Detta problem kan lösas genom att antingen utföra repetitiva in vivo imaging vid lesionen kanten eller genom att välja en skada modell som ger en riktad, mindre skada, exempelvis tunn nål transection modell 19.

Den metod som beskrivs här exponerar ett litet segment av ryggmärgen, genom att utföra en enda laminektomi över målet avbildning området. Den underliggande dura ärendet har lämnats intakt där så är möjligt. Detta garanterar minimal störning av de avbildade vävnaden under hjärnhinnorna och minimerar skadan uppståtttill djurets ryggrad. Den allmänna stabiliseringen systemet kan enkelt anpassas för att bilden antingen genom interlaminar utrymme utan att göra en laminektomi 20 eller via flera seriella laminectomies om en mindre eller en större avbildning fönster är att föredra för en given studie respektive.

Som vanligt med de flesta in vivo tekniker, kan de resultat som uppnåtts med hjälp av denna in vivo imaging metod beror mycket på användningen av lämpliga anestesi. Den KXA bedövning mix som rekommenderas här har också använts inom avbildning studier av olika vävnader innan 21-24 och valdes som uteslutande bygger på dess förmåga att avsevärt minska andningsrörelser. Andra anestesi metoder kan producera jämförbara resultat till denna KXA mix.

Ryggmärgen bildteknik som beskrivs i detta protokoll ger ett kraftfullt verktyg för ryggmärgen forskning, eftersom möjligheten att spela in cell-cell interaktioner i realtid tIME kan underlätta in vivo-studier av ryggmärgen i fysiologi och patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society bevilja RG4595A1 / T för att DD och NIH / NINDS bidrag NS051470, NS052189 och NS066361 till KA Siffror och filmer anpassas och / eller omtryckt från Davalos et al., J Neurosci metoder. 2008 Mar 30, 169 (1) :1-7 Copyright 2008, med tillstånd från Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhodamine B dextran Invitrogen D1841 70 kDa, diluted in
ACSF (3% w/v)
Ketamine HCl Bioniche Pharma NDC No: 67457-001-10 Injectable, 50mg/ml
Anased Lloyd, Inc. NADA No: 139-236 Xylazine injectable,
20mg/ml
Acepromazine Vedco, Inc. NADA No: 117-531 Injectable,10mg/ml
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. NDC No: 57319-760- 25 Lubricant
Betadine Fisher Scientific 19-061617
McPherson-Westcott Scissors World Precision Instruments, Inc. 555500S Curved, blunt-tipscissors
Straight Forceps World Precision Instruments, Inc. 555047FT Toothed tip forceps
Small vessel cauterize Fine Science Tools 18000-00
Gelfoam Pharmacia Corporation (Pfizer) Mixer Mill MM400
Compact spinal cord clamps Narishige International STS-A
Head holding adaptor Narishige International MA-6N
Gelseal Amersham 80-6421-43
Lactated Ringers Baxter Internationl Inc. 2B8609
Buprenex Reckitt Benckiser NDC No: 12496- 6757-1 Buprenorphine,injectable
Baytril Bayer AG NADA 140-913 Enrofloxacin,
antibacterial injectable
2.27% (20ml)
Heating pad - Large Fine Science Tools 21060-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  2. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  3. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  4. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
  5. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
  6. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
  7. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  8. Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  10. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
  11. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
  12. Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  13. Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
  14. Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
  15. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  17. Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
  18. Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  19. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
  20. Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
  21. Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
  22. Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
  23. Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
  24. Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).

Tags

Neurovetenskap ryggmärg bildhantering, axoner mikroglia blodkärl
<em>In vivo</em> avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davalos, D., Akassoglou, K. InMore

Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (59), e2760, doi:10.3791/2760 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter