Summary
마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서 프로토콜
Abstract
유전자 특정 세포 타입 2-3가 크게 생체내 4-7의 수많은 조직의 생리와 병리 학적 과정을 우리의 지식을 넓혀이에 형광 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다 생쥐 두 - 광자 현미경 하나를 사용하여 생체내 이미징에. 중추 신경계 (CNS)의 연구에서는 소설의 과다 등에 따라 뉴런, astrocytes, microglia로 세포의 행동에 대해 종종 예상치 못한 결과를 생산했다 두뇌의 생체내 이미징의 광범위한 응용 프로그램을 찾고있다 생리적 또는 병적인 상태 8-17. 그러나, 대부분 기술적인 합병증은 살아있는 마우스 척수 연구에서 생체내 이미징의의 구현을 제한합니다. 특히, 폐, 심장에 척수의 해부 가까이 이미징 살아있는 척수 도전 과제 만들어 상당한 운동 유물을 생성합니다. 우리는 척추를 안정화 호흡 유도 동작을 감소시키고 생체내에서 이미지를 마우스 척수를 두 광자 현미경의 사용을 촉진하여 척수 이미징의 고유의 한계를 극복 소설 방법을 개발했습니다. 이것은 호흡 유도 동작을 크게 감소 그 결과, 깊은 마취의 방법으로 사용자 정의 척추 안정화 장치를 결합하여 이루어진다. 이 비디오 프로토콜은 조직 부상을 유지하고 최소한으로 출혈하여 장시간 동안 안정적인 생리 조건 하에서 유지 수있는 살아있는 척수의 작은 영역을 노출하는 방법을 보여줍니다. 대표 원시 이미지는 고해상도의 생체내 자세히 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 인수했다. timelapse 시퀀스가 살아있는 마우스 척수에있는 microglial 프로세스의 역동적인 동작을 보여줍니다. 또한, 같은 Z - 프레임의 연속 스캔이 입증이 방법은 이미지 정렬 후 획득을 필요로하지 않는 이미지 및 / 또는 timelapse 영화 스택을 생성 달성할 수있는 뛰어난 안정성의. 마지막으로, 우리는 생체내에 지속적인 생리적 또는 병적인 프로세스 종단 연구 있으므로이 방법은 나중에 timepoints에서 척수의 동일한 영역을 다시 방문하고 reimage하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. 척추 안정화 장치를 구축
- Narishige STS - A 콤팩트 척수 클램프 및 Narishige MA - 6N 헤드 개최 어댑터를 주문.
- 사용자 정의 디자인과 척추와 꼬리가 고정되어있는 반면 동물의 머리가 지원 있도록 스테인레스 스틸베이스 플레이트는 정렬의 두 Narishige 부품을 개최합니다. 전체 장치가 일반적으로 인하 현미경 무대에서 현미경 렌즈 아래에 적합해야한다는 점에 유의하십시오.
2. 동물 수술
- 미리 열 현미경의 공기 가열 장치와 챔버 37에서 유지 ° C.
- 동물의 무게를 100 MG 케타민을 15 MG xylazine 및 무균 조건 하에서 0.9 % NaCl 용액에 희석 체중 kg 당 2.5 MG의 acepromazine을 사용하여 마취 혼합합니다.
- 마취 혼합 (KXA) intraperitoneally을 주입하여 동물을 마취. 정기 발가락 곤란은 전반에 걸쳐 깊은 마취를 보장하기 위해 수행되어야합니다실험. 시간별 또는 필요에 따라 절반 원래의 복용과 함께 보충.
- 수술을 수행하는 동안 열 지원을 제공하는 작은 동물 가열 패드를 사용합니다.
- 각막 탈수 및 손상을 방지하기 위해 눈 위에 인공 눈물 연고를 적용합니다.
- 트리밍 장치와 그리고 완전히 절개 주변에서 머리카락을 제거하는 날카로운 칼날로 먼저 동물의 다시 쉐이브.
- 면도 머리카락을 제거하고 알코올 패드로 면도 피부 표면을 소독.
- 원하는 척수 수준 (흉부 척추는 여기 참조)을 통해 피부의 작은 (~ 1.5 cm) 세로 절개를 수행합니다.
- 신중하게 retracting 피하 결합 조직을하여 다시 근육을 폭로.
- 조심스럽게 원하는 수준의 척추 칼럼에서 paravertebral 근육을 구분합니다. 각 spinous 과정의 양쪽에서 근육을 분리하고 분리된 근육을 밀고 가장 적은 수 incisions를 수행판상 표면에서 방법입니다.
- 즉시 주동이의 및 laminectomy에 꼬리 제거 될 얇은 판을 선택하고 척추 양쪽에있는 척추 클램프에 대한 항목의 사이트를 준비합니다. 조심스럽게 클램프가 삽입됩니다 네 주머니를 만들기 위해 근육 조직을 치환.
- 척수를 건드리지 않고 얇은 판 아래에있는 곡선 야기한 팁 가위 안전 삽입을 허용하기 위해 곧바로 이빨 - 팁 포셉와 척추 기포탑. 천천히 반대편에 다음 한쪽에있는 뼈 절단 및하여 laminectomy을 수행합니다.
- 면봉을 사용하거나 사소한 출혈을 제한 incisions 옆에 precut 작은 gelfoam 흡수성 젤라틴 스폰지 조각을 삽입합니다. 필요한 경우 추가로 출혈을 제어하는 작은 선박 cauterizer을 사용합니다. 조직을 씻어 살균 preheated 인공 뇌척수 (ACSF)를 사용합니다.
3. 생체내 이미징에 대한 열 및 척수 준비 안정화
- Plac E는 척추 안정화 장치의 기본 판에있는 해발 패드에 동물과 머리 들고 어댑터에 머리를 보호할 수 있습니다.
- laminectomy (그림 1) 측면 미리 준비 포켓에있는 동물의 앞쪽에 - 사후 축을 따라 STS - A 장치의 척추 클램프를 놓습니다. 두 클램프는 ~ 45 각도로 배치해야 ° 노출된 척수 (그림 1) 이상의 물을 침지 렌즈를 낮추는 충분한 공간을 허용하기 위해 동물의 때리고 - 꼬리 축에 대한 상대.
- 동물의 시체가 이미징 실험 (그림 1)의 기간 동안 상승 패드의 제거 후 공중에 정지 수 있도록 꼬리의 기지에서 STS - A 장치의 세 번째 클램프를 놓습니다.
- ACSF에서 척수의 유지 보수 및 생체내 이미징에서이 솔루션의 현미경 렌즈의 집중을 촉진하기 위해 노출된 척수 주위 Gelseal (Amersham Biosciences 주식 회사)의 작은 우물을 빌드합니다.
- 현미경을 포함 preheated 챔버 내부의 척추 안정화 장치의 동물을 전송하고 똑바로 렌즈 (그림 1)에서 laminectomy를 배치 낮아 현미경 스테이지에 안전.
- ACSF 솔루션 그것은 척추 겸자 또는 Gelseal을 만지지하지 않도록해야 할로 조심스럽게 물 침지 렌즈를 낮춥니다.
- 관심 영역을 식별하고 그것에 초점을 epifluorescence 사용합니다. 레이저 스캔 모드로 전환하고 fluorophores에 대한 필터가 몇 군데 조직에있는 적절한 두 광자 레이저 여기 파장, dichroics 및 대역 통과를 사용하여 생체내 이미징에서 수행합니다.
5. 반복적인 이미징 및 사후 수술 치료
- 이미징 실험 끝에, 척추 안정화 장치에서 마우스를 제거하고 조심스럽게 laminectomy 주변에서 Gelseal 닦으십시오.지역을 잘 청소하십시오.
- 복원하고 laminectomy 위에 다시 근육을 봉합.
- laminectomy을 통해 피부를 복원하고 봉합, betadine 그것을 면봉.
- 한 ML 영양 및 수화 보충 Lactated Ringers 솔루션 (박스터 헬스케어),뿐만 아니라 subcutaneously 진통 치료를 (0.1 밀리그램 / kg buprenorphine) 제공합니다.
- 살균 처리 intraperitoneally을 (마우스 당 0.03 ML, 2.27 %의 enrofloxacin 주사용 항균 솔루션) 관리할 수 있습니다.
- 장소 마취에서 완전히 회복까지 가열 패드에 동물과 이후 개별적으로 그것을 집.
- 포스트 operatively 2-3 일동안은 수술과 진통제 치료마다 8~12시간 후 첫 3~5일 매일 살균 관리를 반복합니다. 정상적인 동작 및 전체 복구를 위해 매일 동물을 모니터링합니다.
- 같은 laminectomy를 통해 다시 이미징 들어, 봉합 피부와 근육을 열고 섹션 2에서 설명한 단계를 반복 - 4.
- 다시 찾을 수 previously 이전 10 설명된대로지도의 혈액 vasculature를 사용하여 지역을 몇 군데.
6. 대표 결과
모든 동물의 절차는 캘리포니아, 샌프란 시스코 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회가 정한 지침에 따라 수행 및 연방 규정에 따라 아르되었습니다. 척추 안정화 장치의 사진과 현미경 렌즈 아래에있는 장치에 마우스의 위치를 보여주는 도식은 그림 1에 표시됩니다. 동물의 몸을 아래 호흡 움직임에 대한 충분한 공간을 허용하는 것은 척수의 생체내 이미징의 안정 보장합니다. 그것이 Cx3cr1 GFP / + 형질 전환 마우스 18 척수의 생체내에 몇 군데했습니다 그림 2 microglia와 vasculature 사이의 밀접한 관계를 보여줍니다, 하는 microglia는 endogenously GFP으로 표시됩니다. 그림 3 반복 쇼 예제그것이 형광 척수 axons의 단백질 (YFP - H 라인 3)와 microglia을 (Cx3cr1 GFP / + 생쥐)를 표현 생쥐에서 동일한 척수 영역에서 수행된 같은 생체내 이미징 인치
그림 1. 두 광자 현미경을 사용하여 생체내 이미징에 대한 마우스 척추 안정화. (A) 맞춤 제작 스틸베이스 플레이트는 STS - Narishige 컴팩트 척수 클램프와 MA - 6N Narishige를 지원하고 정렬하는 데 사용됩니다 여기에 그림과 같이 머리 어댑터를 들고. 척추 안정화 장치에 KXA 마취와 anesthetized 성인 유전자 변형 생쥐의 (B) 적절한 위치합니다. 삽입은 즉시 rostrally 및 caudally laminectomy와 노출된 척수 조직에 척추 클램프의 위치를 보여줍니다.
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그림 2. anesthetized 생쥐의 척수에 고밀도 microglial 세포와 혈관의 생체내 이미징에서. 의 예상하지만, 비 정렬 Z - 스택 (A) 혈관과 가까이 CX3CR1 GFP / + 마우스 (빨강, rhodamine dextran의 IV 주입으로 표시)의 척수에 높은 고밀도 GFP 양성 microglia (녹색). (B) 높은 배율 이미지 (A) 선박 주변에 확장 프로세스와 척수의 실질 향해 혈관의 벽에 붙어 하나의 microglial 세포와 같이 표시. 스케일 바, 10μm.
그림 3.들은 다른 일에 대한 이전 및 anesthetized 생쥐의 척수에서 reimaged 것처럼 동일한 axonal 세그먼트와 microglia의 생체내 이미징 반복. (A) YFP - 실험실 일 0과 5 eled axons. (B). 그들 주위 동일한 혈관 구조와 microglial 세포가 일 0과 1 Cx3cr1 GFP / + 마우스의 척수의 생체내에 몇 군데. 스케일 바, 10μm.
영화 1. 대표 timelapse 시퀀스 마우스 척수에서 생체내에 인수했다. 이 시퀀스는 밀도가 높은 형광 구조로 채워진 조직 내에서 시간이 지남에 따라 vasculature (빨강, rhodamine dextran의 IV 주입으로 표시)과 세부 좋은 microglial 공정 역학 (녹색)과 상호 작용에 보여줍니다. RAW 이미지는 배경 노이즈, 밝기 및 대비를 위해 수정되었으며 timelapse 영화는 평균 또는 개별 비행기의 Z - 선택, 이미지 정렬하지 않고, Z - 돌출 순차적으로 획득한 이미지 스택에 의해 건설되었습니다. 혈관이 microglia의 이미지로 Z 비행기의 비슷한 범위로 이동합니다. Z 평면 깊이 : 38 μm의.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov은 "> 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2. Timelapse 시퀀스는 단일 Z - 비행기의 수준에서 이미징 메서드의 원료 안정성을 보여주는. KXA의 마취에서 척수 안정화 장치에 배치 CX3CR1 GFP / + 마우스의 척수에서 동일한 단일 Z - 비행기의 빠른 수집은보다 빠른 1 프레임 / s의 스캔 속도로 연속 프레임 사이의 최소한의 이미지 변위를 보여줍니다 마우스의 호흡 속도. 미성년자 잔여 변위 아마 심장이에 의한 것은. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
방법은 여기서 설명하는 것은 허용에 대한 안정적이고 두 광자 현미경을 사용하여 anesthetized 생쥐의 척수에서 인구 밀도가 높은 형광 세포 구조의 생체내 이미징의 반복. 달성 안정성은 맞춤 제작 척추 안정화 장치와 호흡 유발 운동 유물을 감소 마취 처방의 결과입니다. 척추 안정화 장치는 마우스 본체 아래 호흡 공간을 허용하고 상용 척추 클램프 및 헤드 장착 부분 (그림 1)를 사용하여 만들 수 있습니다. 방법은 법으로서, 높은 재현성이고 지속적으로 광범위한 이미지 후처리 (Fig.2와 비디오 1)하지 않고 실험 분석에 사용할 수있는 원시 데이터를 생성합니다. 이 기술은 따라서 상용 형광 마우스 라인 (Figs. 1-3 및 비디오 1)의 풍부 세포 세포 상호 작용 연구에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 인구 밀도가 높은 세포 구조지만,뿐만 아니라 문제를 해결할 수LSO는 빠른 속도로 세포 기능이나 반응 (비디오 1, 2)를 발생. 예를 들면, 그것은 양적 시간이 지남에 따라뿐만 아니라 거리 chemotactic 동작 중에 여행 microglial 공정 역학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 이전에 살아있는 뇌 8 이미징 microglial 응답 설명된대로 부량을 수행할 수 있습니다. 또한, 그것은 이러한 생체내에서 척수의 microglial phagocytosis를 측정하기위한 찬란 레이블 microspheres의 사용과 같은 다른 실험 방식와 함께 사용할 수 있습니다.
다른 요일에 같은 동물의 척수에있는 동일한 지역의 생체내 이미징 반복 수행할 수있는 능력은 생물 학적 현상의 진행과 예를 들어 질병의 개발에 참여할 수있는 이벤트의 순서의 절개를 공부하고 있습니다 . 종단 연구를위한이 방법의 성공적인 응용 프로그램 reli에 대한 조직 랜드마크의 가용성에 의존유 능하게 이전에 몇 군데 있던 영역을 재배치. 이것은 척수 부상 연구를 위해 특히 고려되어야합니다. 이러한 부상의 중심지에서 생성되는 대규모 괴사성 병변은 이전에 몇 군데 지역의 이전을 방해 수도 있습니다 중요한 axonal 및 혈관 다시 정리하기의 원인 척수의 타박상이나 지느러미 hemisection로 일반적으로 사용되는 척수 손상 모델의 일부 예를 들면. 이것은 병변 가장자리 생체내 이미징의 공연 중 반복하거나 같은 얇은 바늘 절개 모델 19로, 타겟, 작은 병변의 원인이 부상 모델을 선택하여 극복할 수 있습니다.
여기에서 설명한 방법은 대상 이미징 영역 단일 laminectomy를 수행하여, 척수의 작은 세그먼트를 제공합니다. 기본 경질 물질은 가능한 어디에 그대로 남아있다. 이것은 meninges 아래 몇 군데 조직의 최소한의 섭동를 보장하고 발생하는 피해를 최소화동물의 척추합니다. 전반적인 안정화 계획은 쉽게 laminectomy 20 수행하지 않고 또는 작은 또는 큰 이미지 창이 주어진 공부하는 것이 좋습니다 경우 각각 여러 직렬 laminectomies 통해 interlaminar 공간을 통해서 이미지를 적용할 수 있습니다.
생체내 기술의 대부분 일반적이므로 생체내 이미징 방식에서 이것을 사용하여 얻은 결과는 크게 적절한 마취의 사용에 따라 달라질 수 있습니다. 여기 권장합니다 KXA 마취 혼합 21-24 전에 다른 조직의 이미징 연구에도 사용되고 있으며, 크게 호흡 운동을 줄이기 위해 자사의 능력에 따라 독점적으로 선정되었습니다. 다른 마취 방법이 KXA 믹스 비교 결과를 얻을 수 있습니다.
능력이 진짜 t에서 세포 세포 상호 작용을 기록 때문에이 프로토콜에 설명된 척수 이미징 기술은, 척수 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다IME는 크게 생리와 병리에 척수의 생체내 연구에 용이하실 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 국립 다중 경화증에 의해 지원되었다 부여 사회 적응 및 / 또는 Davalos 외., J Neurosci 방법에서 reprinted KA 피규어와 영화 DD와 NIH / NINDS 보조금 NS051470, NS052189 및 NS066361에 RG4595A1 / T. 2008 3월 30일, Elsevier의 허가를 169 (1) :1 - 7 2,008 저작권.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubricant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Curved, blunt-tipscissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps | Narishige International | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorphine,injectable |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad - Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
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