Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi

Published: January 5, 2012 doi: 10.3791/2760
Automatic Translation
1, 1,2
1Gladstone Institute of Neurological Disease, University of California, San Francisco, 2Department of Neurology, University of California, San Francisco

Summary

Et minimalt invasive protokoll for å stabilisere musen ryggsøylen og utføre repetitive

Abstract

In vivo avbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi 1 i mus som er genmodifisert til å uttrykke fluorescerende proteiner i bestemte celletyper 2-3 har betydelig utvidet vår kunnskap om fysiologiske og patologiske prosesser i en rekke vev in vivo 4-7. I studier av sentralnervesystemet (CNS), har det vært en bred anvendelse av in vivo avbildning i hjernen, som har produsert en mengde nye og ofte uventede funn om oppførselen til cellene som nevroner, astrocytes, microglia, under fysiologiske eller patologiske tilstander 8-17. Imidlertid har det meste tekniske komplikasjoner begrenset gjennomføringen av in vivo avbildning i studier av levende mus ryggmargen. Spesielt genererer anatomiske nærhet av ryggmargen til lungene og hjertet vesentlig bevegelse gjenstand som gjør bildebehandling levende ryggmargen en utfordrende oppgave. Vi utviklet en ny metode som overvinner de iboende begrensningene i ryggmargen bildebehandling ved å stabilisere ryggsøylen, redusere respiratoriske-induserte bevegelser og dermed legge til rette for bruk av to-foton mikroskopi til bildet musen ryggmarg in vivo. Dette oppnås ved å kombinere et tilpasset spinal stabilisering enheten med en metode for dyp anestesi, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av respiratorisk-indusert bevegelser. Denne videoen protokoll viser hvordan å eksponere et lite område av den levende ryggmargen som kan opprettholdes under stabile fysiologiske forhold over lengre tid ved å holde vev skade og blødning til et minimum. Representant rå bilder ervervet in vivo detalj i høy oppløsning det nære forholdet mellom microglia og blodkar. En timelapse sekvens viser den dynamiske oppførselen til microglial prosesser i levende mus ryggmargen. Dessuten en kontinuerlig skanning av samme z-frame demonstrereer den enestående stabiliteten at denne metoden kan oppnå å generere stabler av bilder og / eller timelapse filmer som ikke krever bildejusteringen etter oppkjøpet. Til slutt viser vi hvordan denne metoden kan brukes til å besøke og Reimage samme område i ryggmargen på senere tidspunkter, slik at for longitudinelle studier av pågående fysiologiske eller patologiske prosesser in vivo.

Protocol

1. Bygging av spinal stabilisering enhet

  1. Bestill Narishige STS-A Compact Spinal Cord Klemmer og Narishige MA-6N hodet holder adapter.
  2. Tilpasset design og gjør en rustfri bunnplate å holde de to Narishige deler justering slik at dyrets hode støttes mens ryggsøylen, og halen er festet. Husk at hele enheten skal passe under mikroskopet linsen vanligvis på en senket mikroskop scenen.

2. Animal kirurgi

  1. Forvarm mikroskop kammer med luft oppvarming enhet og opprettholde den ved 37 ° C.
  2. Vei dyret og gjør anestesien miks ved hjelp av 100 mg ketamin, 15 mg xylazin og 2,5 mg acepromazine per kg kroppsvekt, fortynnet i 0,9% NaCl-løsning under sterile forhold.
  3. Anesthetize dyret ved å injisere bedøvelse mix (KXA) intraperitonealt. Regelmessig toe klype bør utføres for å sikre dyp anestesi heleeksperimentet. Supplere med halvparten av opprinnelige dose hver time eller etter behov.
  4. Bruk et lite dyr oppvarming pad for å gi termisk støtte mens du utfører den kirurgiske prosedyren.
  5. Påfør kunstige tårer salve over øynene for å hindre hornhinnen dehydrering og skader.
  6. Shave baksiden av dyret først med en trimming enheten og deretter med en skarp kniv for å fjerne hår fra området rundt snittet.
  7. Fjern barbert hår og desinfiser barbert hudoverflaten med en alkohol pad.
  8. Utfør en liten (~ 1,5 cm) langsgående snitt i huden over det ønskede spinal nivå (thorax vertebrae vist her).
  9. Avdekk ryggmuskulaturen ved forsiktig trekke det subkutane bindevev.
  10. Forsiktig skille paravertebral muskler fra ryggsøylen på ønsket nivå. Utfør færrest mulig incisions å løsne musklene fra begge sider av hver spinous prosess og deretter skrape frittliggende muskleneveien fra laminær overflaten.
  11. Velg lamina som vil bli fjernet og forberede nettstedene til oppføringen for spinal klemmer på hver side av ryggsøylen, umiddelbart rostral og caudal til laminektomi. Nøye fortrenge muskelvev for å lage fire lommer hvor klemmene vil bli satt inn.
  12. Løft ryggsøylen med den rette toothed-tip pinsett til å tillate sikker innsetting av de buede sløv-spiss saks under lamina uten å berøre ryggmargen. Utfør laminektomi ved sakte å kutte beinet på den ene siden og deretter på den andre siden.
  13. Bruk en bomullspinne eller sette precut små gelfoam absorberbare gelatin svamp stykker ved siden av snittene å begrense mindre blødninger. Bruk en liten fartøy cauterizer å kontrollere ytterligere blødning hvis nødvendig. Bruk forvarmet sterile kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) å vaske vev.

3. Stabilisering av ryggsøylen og forberedelse for in vivo avbildning

  1. Plac e dyret på en høyde puten på bunnplaten av spinal stabilisering enheten og sikre hodet i hodet holder adapter.
  2. Plasser spinal klemmer av STS-A enhet langs anterior-posterior aksen av dyret i den pre-forberedt lommer flankerer laminektomi (Figur 1). De to klemmene bør plasseres i en vinkel på ~ 45 ° i forhold til dyrets rostro-caudal aksen for å gi nok plass til å senke et vann nedsenking linse over de eksponerte ryggmargen (Figur 1).
  3. Plasser den tredje klemmen av STS-A enheten ved haleroten, slik at dyrets kropp kan bli suspendert i luften etter fjerning av høyden pad for varigheten av imaging eksperimenter (Figur 1).
  4. Bygg en liten brønn Gelseal (Amersham Biosciences Corp) rundt de utsatte ryggmargen for å lette vedlikehold av ryggmargen i ACSF og nedsenking av mikroskopet objektivet i denne løsningen for in vivo imaging.
jove_title "> 4. In vivo avbildning av musen ryggmargen med to-foton mikroskopi

  1. Transfer dyret på spinal stabilisering enhet inne i forvarmet kammeret som dekker mikroskopet og sikre det på en senket mikroskop scene plassere laminektomi rett under linsen (figur 1).
  2. Lavere vann-immersion objektivet forsiktig inn i ACSF løsningen å sørge for at det ikke berører spinal klemmer eller Gelseal.
  3. Bruk epifluorescence å identifisere område av interesse og fokus på det. Bytt til laser scanning modus og utføre in vivo avbildning ved hjelp av riktig to-foton laser eksitasjon bølgelengde, dichroics og Båndpassdesign filtre for fluorophores stede i avbildes vev.

5. Gjentatte bildebehandling og postoperativ behandling

  1. På slutten av imaging eksperimenter, fjerne musen fra spinal stabilisering enheten og forsiktig tørk Gelseal fra området rundt laminektomi.Rengjør området godt.
  2. Gjenopprette og sutur ryggmuskulaturen over laminektomi.
  3. Gjenopprette og sutur huden over laminektomi, vattpinne med betadine.
  4. Gi en ml laktat Ringesignaler løsning (Baxter Healthcare) som et næringsstoff og hydrering supplement, samt smertestillende behandling subkutant (0,1 mg / kg buprenorfin).
  5. Administrer antiseptisk behandling intraperitonealt (0,03 ml per mus, 2,27% Enrofloxacin injeksjon antibakteriell løsning).
  6. Plasser dyret på en varmeplate til full utvinning fra anestesi og deretter huset det individuelt.
  7. Gjenta antiseptisk administrasjon daglig de første 3-5 dagene etter operasjonen og smertestillende behandling hver 8-12 timer i 2-3 dager postoperativt. Monitor dyr daglig for å sikre normal oppførsel og full restitusjon.
  8. For re-imaging gjennom de samme laminektomi, gjenåpne sutureres hud og muskler og gjenta trinnene som er beskrevet i del 2 - 4.
  9. Re-lokalisere forrigeously fotografert området ved hjelp av blodet blodkar som et kart som tidligere beskrevet 10.

Seks. Representative resultater

Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjer fastsatt av institusjonelle Animal Care og Bruk komiteer ved University of California, San Francisco og er i samsvar med føderale forskrifter. Et bilde av spinal stabilisering enheten og en skjematisk viser plasseringen av en mus på enheten under et mikroskop objektivet er vist i figur 1. Slik at tilstrekkelig plass for pustebevegelser under dyrets kropp sikrer stabil in vivo avbildning i ryggmargen. Figur 2 viser det nære forholdet mellom microglia og blodkar som det var avbildet i vivo i ryggmargen av Cx3cr1 GFP / + transgene mus 18, der microglia er endogent merket med GFP. Figur 3 viser eksempler på repetitivein vivo avbildning slik den ble fremført i samme ryggmargen områder i mus som uttrykker en fluorescerende protein i spinal axoner (YFP-H linje 3) og microglia (i Cx3cr1 GFP / + mus).

Figur 1
Figur 1. Stabilisering av musen ryggsøylen for in vivo avbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi. (A) En custom-made stålplate blir brukt til å støtte og justere STS-A Narishige kompakt ryggmargen skrutvinger og MA-6N Narishige hode holder adapteren som vist her. (B) Riktig plassering av voksne transgene mus bedøvet med en KXA bedøvelse på spinal stabilisering enheten. Innsatsen viser plassering av spinal klemmer umiddelbart rostrally og caudally til laminektomi og den eksponerte ryggmargen vev.

<img alt = "Figur 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" />
Figur 2. In vivo avbildning av høy tetthet microglial celler og blodårer i ryggmargen av bedøvet mus. Forventet men alliansefrie z-stabler av (A) svært tett GFP-positive microglia (grønn) i ryggmargen på en CX3CR1 GFP / + mus i umiddelbar nærhet med blodkar (rød, merket med iv injeksjon av rhodamine dekstran). (B) Høy forstørrelse bilde merket som i (A) av en enkelt microglial celle festet til veggen av et blodkar med prosesser forlenget rundt fartøyet og mot ryggmargen parenkym. Scale barer, 10μm.

Figur 3
Figur 3. Repetitive in vivo avbildning av samme aksonal segmenter og microglia som de ble flyttet og reimaged i ryggmargen av bedøvet mus på ulike dager. (A) YFP-lab eled axons på dag 0 og 5. (B). De samme vaskulære strukturer og microglial celler rundt dem fotografert in vivo i ryggmargen av Cx3cr1 GFP / + mus på dag 0 og 1. Scale barer, 10μm.

Movie 1. Representative timelapse sekvens kjøpt in vivo fra musen ryggmargen. Denne sekvensen viser i detalj fin microglial prosessdynamikken (grønn) og deres interaksjoner med blodkar (rød, merket med iv injeksjon av rhodamine dekstran) over tid innenfor en vev tett befolket med fluorescerende strukturer. Den rå bildene var bare korrigert for bakgrunnsstøy, lysstyrke og kontrast, og timelapse filmen ble bygget av z-projisere sekvensielt kjøpt Bildestakker, uten bildejusteringen, gjennomsnittlig eller z-valg av individuell plan. Blodkar går gjennom en lignende rekke z fly som bilder av microglia. Z plane dybde: 38 mikrometer.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Klikk her for å se filmen.

Movie 2. Timelapse sekvens demonstrere rå stabilitet imaging metode på nivå med en enkelt z-planet. Rask oppkjøpet av samme singel z-planet i ryggmargen av CX3CR1 GFP / + mus plasseres på spinal stabilisering enheten under KXA anestesi, viser minimal image forskyvning mellom påfølgende rammer ved en skanning av en ramme / s som er raskere enn pustefrekvens på musen. Den mindreårige residual forskyvning skyldes sannsynligvis hjerterytme. Klikk her for å se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden er beskrevet her gir stabil og repeterende in vivo avbildning av tettbefolkede fluorescerende cellulære strukturer i ryggmargen av bedøvet mus ved hjelp av to-foton mikroskopi. Den oppnådde stabilitet er et resultat av en skreddersydd spinal stabilisering enheten og en bedøvende regime som reduserer respiratorisk-indusert bevegelse gjenstand. Den spinal stabilisering enheten kan pusterom under musen kroppen og kan bygges ved hjelp av kommersielt tilgjengelige spinal klemmer og hode montering stykke (Fig. 1). Metoden er svært reproduserbare, minimalt invasiv og konsekvent genererer rådata som kan brukes til eksperimentelle analyser uten omfattende image post-prosessering (Fig.2 og Video 1). Denne teknikken kan derfor brukes til studier av celle-celle interaksjoner i overflod av kommersielt tilgjengelige selvlysende mus linjer (figur 1-3 og Video 1). Denne metoden kan løse ikke bare tettbefolkede cellulære strukturer men enLSO raskt forekommende cellulære funksjoner eller responser (Videos 1, 2). For eksempel kan den brukes til å kvantitativt måle microglial prosessdynamikken over tid, samt distanse under kjemotaktisk atferd. Kvantifisering kan utføres som vi tidligere beskrevet for imaging microglial responser i den levende hjernen 8. Dessuten kan den brukes i kombinasjon med andre eksperimentelle tilnærminger slik som bruk av fluorescensmerkede mikrosfærer å måle microglial fagocytose i ryggmargen in vivo.

Evnen til å utføre repetitive in vivo avbildning av nøyaktig samme område i ryggmargen av de samme dyrene på forskjellige dager kan studere utviklingen av biologiske fenomener og disseksjon av rekkefølgen av hendelser som kunne for eksempel være involvert i utviklingen av sykdommen . Vellykket anvendelse av denne metoden for longitudinelle studier er avhengig av tilgjengeligheten av vev landemerker for påliteligdyktig flytte områder som tidligere ble avbildes. Dette må tas hensyn til særlig for ryggmargsskade studier. For eksempel i noen av de oftest brukte ryggmargsskade modeller som ryggmarg kontusjon eller dorsal hemisection den massive nekrotisk lesjon som er generert ved episenteret av skaden forårsaker betydelig aksonal og vaskulær omorganisering som kan hindre flytting av tidligere avbildes området. Dette kan løses enten ved å utføre repetitive in vivo avbildning ved lesjon kanten eller ved å velge en skade modell som fører til en målrettet, mindre lesjon, slik som tynn nål transection modell 19.

Metoden som beskrives her eksponerer et lite segment av ryggmargen, ved å utføre et enkelt laminektomi over målet bildebehandling området. Den underliggende dura Saken har vært intakt der det er mulig. Dette sikrer minimal endringen av de fotografert vevet under hjernehinnene og minimerer skaden pådratttil dyrets ryggraden. Den samlede stabilisering ordningen kan enkelt tilpasses bildet enten gjennom interlaminar plass uten å utføre en laminektomi 20 eller gjennom flere seriell laminectomies hvis et mindre eller et større bildediagnostikk vindu foretrekkes for en gitt studie hhv.

Som er vanlig med de fleste in vivo teknikker, kan resultatene som oppnås ved hjelp av denne in vivo imaging metode i stor grad avhenge av bruk av riktig anestesi. Den KXA bedøvelse mix som er anbefalt her har også blitt brukt i bildebehandling studier av ulike vev før 21-24 og ble valgt utelukkende basert på dens evne til å redusere pustebevegelser. Andre bedøvelse tilnærminger kan gi sammenlignbare resultater til denne KXA mix.

Ryggmargen avbildningsteknikk beskrevet i denne protokollen gir et kraftig verktøy for ryggmargen forskning, siden muligheten til å ta celle-celle interaksjoner i sanntid tIME kan i stor grad forenkle in vivo studier av ryggmargen i fysiologi og patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Multiple Sclerosis Society stipend RG4595A1 / T til DD og NIH / NINDS stipend NS051470, NS052189 og NS066361 til KA Tall og filmer tilpasset og / eller gjengitt fra Davalos et al., J Neurosci metoder. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, med tillatelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhodamine B dextran Invitrogen D1841 70 kDa, diluted in
ACSF (3% w/v)
Ketamine HCl Bioniche Pharma NDC No: 67457-001-10 Injectable, 50mg/ml
Anased Lloyd, Inc. NADA No: 139-236 Xylazine injectable,
20mg/ml
Acepromazine Vedco, Inc. NADA No: 117-531 Injectable,10mg/ml
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. NDC No: 57319-760- 25 Lubricant
Betadine Fisher Scientific 19-061617
McPherson-Westcott Scissors World Precision Instruments, Inc. 555500S Curved, blunt-tipscissors
Straight Forceps World Precision Instruments, Inc. 555047FT Toothed tip forceps
Small vessel cauterize Fine Science Tools 18000-00
Gelfoam Pharmacia Corporation (Pfizer) Mixer Mill MM400
Compact spinal cord clamps Narishige International STS-A
Head holding adaptor Narishige International MA-6N
Gelseal Amersham 80-6421-43
Lactated Ringers Baxter Internationl Inc. 2B8609
Buprenex Reckitt Benckiser NDC No: 12496- 6757-1 Buprenorphine,injectable
Baytril Bayer AG NADA 140-913 Enrofloxacin,
antibacterial injectable
2.27% (20ml)
Heating pad - Large Fine Science Tools 21060-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  2. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  3. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  4. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
  5. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
  6. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
  7. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  8. Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  10. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
  11. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
  12. Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  13. Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
  14. Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
  15. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  17. Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
  18. Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  19. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
  20. Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
  21. Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
  22. Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
  23. Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
  24. Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).

Tags

Nevrovitenskap ryggmarg bildebehandling, aksoner microglia blodårer
<em>In vivo</em> Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davalos, D., Akassoglou, K. In… More

Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (59), e2760, doi:10.3791/2760 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter