Summary
Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar repetitivos
Abstract
In vivo de imagens usando microscopia de dois fótons 1 em ratos que foram geneticamente modificados para expressar proteínas fluorescentes em células específicas 2-3 tipos ampliou significativamente o nosso conhecimento dos processos fisiológicos e patológicos em tecidos diversos in vivo 4-7. Em estudos do sistema nervoso central (CNS), tem havido uma ampla aplicação de imagem in vivo em no cérebro, que produziu uma infinidade de novas descobertas e muitas vezes inesperadas sobre o comportamento das células, como neurônios, astrócitos, microglia, sob condições fisiológicas ou patológicas 17/08. No entanto, complicações na sua maioria técnicos limitaram a implementação de imagem in vivo em estudos da medula espinhal de rato vivo. Em particular, a proximidade anatômica da medula espinhal para os pulmões eo coração gera movimento significativo artefato que faz imagens do cordão espinhal vivendo uma tarefa desafiadora. Nós desenvolvemos um novo método que supera as limitações inerentes a imagem da medula espinhal através da estabilização da coluna vertebral, reduzindo respiratória induzida por movimentos e facilitando o uso de microscopia de dois fótons para a imagem do cordão espinhal de rato in vivo. Isto é conseguido através da combinação de um dispositivo de estabilização da coluna vertebral personalizado com um método de anestesia profunda, resultando em uma redução significativa do respiratória induzida por movimentos. Este protocolo vídeo mostra como expor uma pequena área da medula espinhal que viver pode ser mantida sob condições fisiológicas estáveis durante longos períodos de tempo, mantendo a lesão tecidual e sangramento ao mínimo. Representante imagens brutas adquiridas em detalhe vivo em alta resolução a estreita relação entre microglia e da vasculatura. Uma seqüência timelapse mostra o comportamento dinâmico de processos microglia na medula espinhal de rato vivo. Além disso, uma varredura contínua do mesmo z-frame demonstrars a estabilidade excepcional que este método pode conseguir para gerar pilhas de imagens e / ou filmes timelapse que não exigem o alinhamento da imagem pós-aquisição. Por fim, mostramos como esse método pode ser usado para rever e recriar a mesma área da medula espinhal em intervalo de tempo mais tarde, permitindo estudos longitudinais de curso processos fisiológicos ou patológicos in vivo.
Protocol
1. Construção do dispositivo de estabilização da coluna vertebral
- Ordem do Narishige STS-A Compact Grampos da Medula Espinhal e os Narishige MA-6N adaptador segurando a cabeça.
- Design personalizado e fazer uma placa base de aço inoxidável para segurar as duas partes Narishige em alinhamento de modo que a cabeça do animal é suportado quando a sua coluna vertebral e da cauda são pinçadas. Tenha em mente que todo o dispositivo deve caber sob a lente do microscópio geralmente em um estágio do microscópio baixou.
2. Cirurgia de animais
- Pré-aquecer a câmara de microscópio com um dispositivo de aquecimento de ar e mantê-la a 37 ° C.
- Pesar o animal e fazer a mistura anestésico usando 100 mg de cetamina, xilazina 15 mg e 2,5 mg acepromazina por kg de peso corporal, diluída em solução de NaCl 0,9% em condições estéreis.
- Anestesiar o animal através da injeção do anestésico mix por via intraperitoneal (KXA). Beliscar toe regulares devem ser realizados para assegurar a anestesia profunda em todoo experimento. Suplemento com metade da dose original por hora ou conforme necessário.
- Use uma almofada de aquecimento de pequenos animais para fornecer suporte térmico durante a realização do procedimento cirúrgico.
- Aplicar pomada lágrimas artificiais sobre os olhos para evitar a desidratação da córnea e danos.
- Raspar o dorso do animal pela primeira vez com um dispositivo de corte e, em seguida, com uma lâmina afiada para remover completamente o cabelo da área ao redor da incisão.
- Remover os cabelos raspados e desinfetar a superfície da pele raspada com uma compressa embebida em álcool.
- Realizar uma incisão (~ 1,5 cm) pequena longitudinal da pele sobre o nível desejado da coluna vertebral (vértebras torácicas mostrado aqui).
- Expor a musculatura volta com cuidado retração do tecido conjuntivo subcutâneo.
- Separe cuidadosamente a musculatura paravertebral da coluna vertebral no nível desejado. Realizar o menor número de incisões possível destacar os músculos de ambos os lados de cada processo espinhoso e, em seguida, raspar os músculos destacada umaforma da superfície laminar.
- Escolha a lâmina que serão removidos e preparar os locais de entrada para os grampos da coluna em cada lado da coluna vertebral, imediatamente rostral e caudal à laminectomia. Cuidadosamente deslocar tecido muscular para fazer quatro bolsos onde os grampos será inserido.
- Levante a coluna vertebral com a ponta reta de dentes forceps para permitir a inserção segura da curva de ponta romba tesoura sob a lâmina sem tocar na medula espinhal. Executar a laminectomia por lentamente cortando o osso de um lado e, em seguida, do outro lado.
- Use um cotonete ou inserir precut pequenos pedaços de esponja absorvível gelfoam gelatina ao lado do incisões para limitar a pequenos sangramentos. Use um cauterizador de pequenos vasos para controlar o sangramento, se necessário. Use pré-aquecido estéril líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) para lavar tecidos.
3. Estabilização da coluna vertebral e preparação para in vivo de imagens
- Plac e animal em uma almofada de elevação na placa de base do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e segura a cabeça no adaptador de cabeça exploração.
- Coloque os grampos espinhal do STS-Um dispositivo ao longo do eixo ântero-posterior do animal nos bolsos pré-preparados que flanqueiam a laminectomia (Figura 1). Os dois grampos deve ser colocado em um ângulo de aproximadamente 45 ° em relação ao eixo do animal rostro-caudal para permitir espaço suficiente para diminuir uma lente de imersão em água sobre a medula espinal exposta (Figura 1).
- Coloque o clamp terço da STS-Um dispositivo na base da cauda para o corpo do animal podem ser suspensas no ar após a remoção da almofada de elevação para a duração dos experimentos de imagem (Figura 1).
- Construir um pequeno poço de Gelseal (Amersham Biosciences Corp) ao redor da medula espinal exposta para facilitar a manutenção da medula espinhal em ACSF e imersão da lente do microscópio nesta solução no de imagem in vivo.
- Transferência do animal sobre o dispositivo de estabilização da coluna vertebral dentro da câmara de pré-aquecido cobrindo o microscópio e fixá-lo em um palco microscópio abaixou colocando a laminectomia reta sob a lente (Figura 1).
- Menor uma lente de imersão em água com cuidado para a solução ACSF certificando-se que ele não toque os grampos espinhal ou o Gelseal.
- Use epifluorescência para identificar a área de interesse e se concentrar nele. Mudar para o modo de varredura a laser e executar em imagem in vivo usando o apropriado de dois fótons de comprimento de onda de excitação laser, dichroics e bandpass filtros para os fluoróforos presentes no tecido com imagens.
5. Imagens repetitivas e cuidados pós-operatórios
- No final de experimentos com imagens, remova o mouse a partir do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e limpe cuidadosamente o Gelseal da área ao redor da laminectomia.Limpe bem a área.
- Restaurar e sutura os músculos das costas sobre a laminectomia.
- Restaurar e sutura da pele sobre a laminectomia, cotonete com betadine.
- Fornecer uma solução de Ringer Lactato ml (Baxter Healthcare) como um suplemento de nutrientes e hidratação, bem como tratamento analgésico por via subcutânea (0,1 mg de buprenorfina / kg).
- Administrar por via intraperitoneal tratamento anti-séptico (0,03 ml por mouse, 2,27% enrofloxacina solução injetável antibacteriano).
- Coloque o animal em uma almofada de aquecimento até a recuperação completa da anestesia e, posteriormente, abrigá-lo individualmente.
- Repita a administração anti-séptico dia durante os primeiros 3-5 dias após a cirurgia e tratamento analgésico a cada 8-12 horas por 2-3 dias pós-operatório. Monitorar animais diariamente para garantir um comportamento normal e plena recuperação.
- Para re-imagem através da laminectomia mesmo, reabrir a pele suturada e os músculos e repita os passos descritos nas secções 2-4.
- Re-localizar a PREVIpreviamente imaginado área usando a vascularização de sangue como um mapa, como descrito anteriormente 10.
6. Resultados representativos
Todos os procedimentos com animais foram realizados sob as diretrizes estabelecidas pelo Animal Care institucional e Comitês Use na Universidade da Califórnia, San Francisco e estão em conformidade com os regulamentos Federal. A imagem do dispositivo de estabilização da coluna vertebral e um diagrama esquemático mostrando o posicionamento de um rato no dispositivo sob uma lente de microscópio é mostrado na Figura 1. Permitindo espaço suficiente para os movimentos de respiração debaixo do corpo do animal garante estabilidade in vivo de imagens na medula espinhal. Figura 2 mostra a relação estreita entre microglia e na vasculatura como foi fotografado in vivo na medula espinhal de CX3CR1 GFP / mice + transgênicos 18, em que microglia são marcadas com GFP endogenamente. Figura 3 mostra exemplos de repetitivona imagem in vivo, uma vez que foi realizada no mesmo áreas da medula espinhal em camundongos expressando uma proteína fluorescente nos axônios da coluna vertebral (YFP-H linha 3) e microglia (no CX3CR1 GFP / + ratos).
Figura 1. Estabilização da coluna vertebral do mouse na imagem in vivo usando microscopia de dois fótons. (A) A custom-made placa base de aço é usada para apoiar e alinhar a STS-A Narishige compacto grampos medula espinhal ea MA-6N Narishige cabeça segurando adaptador como mostrado aqui. (B) posicionamento adequado dos adultos camundongos transgênicos anestesiados com uma anestesia KXA no dispositivo de estabilização da coluna vertebral. O encarte mostra a colocação dos grampos espinhais imediatamente rostral e caudalmente à laminectomia e tecido da medula espinhal expostos.
<img alt = "Figura 2" src = "files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg /" />
Figura 2. Na imagem in vivo de células de alta densidade da microglia e os vasos sanguíneos da medula espinhal de ratos anestesiados. Projeção, mas não-alinhados z-pilhas de (A) alta densidade GFP positivas microglia (verde) na medula espinhal de um rato CX3CR1 GFP + / em estreita proximidade com os vasos sanguíneos (vermelho, marcado com iv injeção de rodamina dextran). (B) a ampliação de imagem de alta rotulados como em (A) de uma única célula microglial preso à parede de um vaso sanguíneo com processos estendida ao redor do navio e para o parênquima da medula espinhal. Barra de escala 10μm.
Figura 3. Repetitivos nos de imagem in vivo dos mesmos segmentos axonal e microglia como eles foram realocados e reimaged na medula espinhal de ratos anestesiados em dias diferentes. (A) YFP-laboratório axônios modelada nos dias 0 e 5. (B). As mesmas estruturas vasculares e células da microglia em torno deles com imagens in vivo na medula espinhal de CX3CR1 GFP / mice + nos dias 0 e 1. Barra de escala 10μm.
Movie 1. Seqüência timelapse Representante adquiridos in vivo da medula espinhal de rato. Esta seqüência mostra em detalhes a dinâmica do processo da microglia (verde) e suas interações com a vasculatura (vermelho, marcado com iv injeção de rodamina dextran) ao longo do tempo dentro de um tecido densamente povoadas com estruturas fluorescentes. As imagens só foram corrigidos primas para o brilho do ruído de fundo e contraste eo filme timelapse foi construído por z-projetando pilhas de imagens adquiridas em seqüência, sem alinhamento da imagem, com uma média ou z-selecção de planos individuais. Vasos sanguíneos passam por uma série similar de aviões z como as imagens da microglia. Z profundidade avião: 38 mM.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Clique aqui para assistir o filme.
Filme seqüência Timelapse 2. Demonstrar a estabilidade primas do método de imagem ao nível de um único plano-z. Aquisição rápida do mesmo e único plano-z na medula espinhal de camundongos GFP CX3CR1 / + colocado no dispositivo de estabilização da coluna vertebral sob anestesia KXA, demonstra o deslocamento de imagem mínima entre quadros consecutivos a uma taxa de varredura de 1 frame / s que é mais rápido do que o taxa de respiração do mouse. O deslocamento menor residual é provavelmente devido ao batimento cardíaco. Clique aqui para assistir o filme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método descrito aqui permite estável e repetitivo in vivo de imagem de densamente povoadas fluorescentes estruturas celulares na medula espinhal de ratos anestesiados com microscopia de dois fótons. A estabilidade alcançada é resultado de um dispositivo de estabilização custom-made espinhal e um regime anestésico que reduz respiratória induzida pelo artefato movimento. O dispositivo de estabilização da coluna vertebral permite espaço para respirar embaixo do corpo do rato e pode ser construído usando comercialmente disponíveis grampos espinhal e parte da cabeça de montagem (Fig. 1). O método é altamente reprodutível, minimamente invasiva e consistente gera dados brutos que podem ser usados para análises experimentais sem imagem extensa pós-processamento (Fig.2 e Vídeo 1). Esta técnica pode ser utilizada para estudos de interações célula-célula na abundância de produtos comercialmente disponíveis linhas de rato fluorescentes (Figs. 1-3 e Vídeo 1). Este método pode resolver não só densamente povoadas estruturas celulares, mas umalso ocorrendo rapidamente as funções celulares ou respostas (Vídeos 1, 2). Por exemplo, ele pode ser usado para medir quantitativamente dinâmica do processo microglial ao longo do tempo, bem como a distância percorrida durante o comportamento quimiotáticos. Quantificação pode ser realizada como descrito anteriormente para as respostas microglial imagem no cérebro de vida 8. Além disso, ele pode ser usado em combinação com outras abordagens experimentais, tais como o uso de microesferas fluorescentes marcados para medir a fagocitose da microglia na medula espinhal in vivo.
A capacidade de executar repetitivas em imagens in vivo da área de exatas mesmo na medula espinhal dos animais mesmo em dias diferentes permite estudar a progressão dos fenômenos biológicos e dissecção da seqüência de eventos que poderiam, por exemplo, estar envolvido com o desenvolvimento da doença . Sucesso da aplicação deste método para estudos longitudinais depende da disponibilidade dos marcos de tecido para relihabilmente realocar as áreas que foram previamente imaginado. Isso precisa ser levado em conta, nomeadamente para estudos de lesão medular. Por exemplo, em alguns dos modelos usados lesão medular, como contusão da medula espinhal ou hemissecção dorsal da lesão maciça necrótico que é gerado no epicentro da lesão axonal e reorganização causas vascular significativa que possa dificultar deslocalização da área previamente imaginado. Isso pode ser superado por qualquer repetitivos no desempenho de imagem in vivo na borda da lesão ou selecionando um modelo de lesão que causa uma lesão, alvo menor, como o modelo de thin agulha transecção 19.
O método descrito aqui expõe um pequeno segmento da medula espinhal, através da realização de uma laminectomia única sobre a área de imagem alvo. A dura-máter subjacente foi deixado intacto, sempre que possível. Isso garante o mínimo de perturbação do tecido fotografada debaixo da meninges e minimiza a lesão sofridaa coluna vertebral do animal. O esquema de estabilização global pode ser facilmente adaptado para a imagem, quer através do espaço interlaminar sem realizar uma laminectomia 20 ou através de múltiplas laminectomias série, respectivamente, se um menor ou uma maior janela de imagem é o preferido para um determinado estudo.
Como é comum com a maioria das técnicas in vivo, os resultados obtidos através deste método de imagem in vivo pode depender muito do uso de anestesia adequada. O mix KXA anestésico que é recomendado aqui também tem sido utilizado em estudos de imagens de tecidos diferentes, antes de 21-24 e foi selecionada exclusivamente com base na sua capacidade de reduzir significativamente os movimentos respiratórios. Outras abordagens anestésicas podem produzir resultados comparáveis a esta mistura KXA.
A técnica de imagem da medula espinhal descritos neste protocolo fornece uma poderosa ferramenta de pesquisa da medula espinhal, uma vez que a capacidade de gravar interações célula-célula em reais time pode facilitar muito os estudos in vivo da medula espinhal na fisiologia e patologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Multiple Sclerosis Society conceder RG4595A1 / T para DD e os subsídios NIH / NINDS NS051470, NS052189 NS066361 e as Figuras KA e filmes adaptados e / ou reimpressão do Davalos et al. Métodos J Neurosci. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, com permissão da Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubricant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Curved, blunt-tipscissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps | Narishige International | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorphine,injectable |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad - Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
