Summary
Малоинвазивных протокол для стабилизации позвоночника мыши и выполнять повторяющиеся
Abstract
В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии 1 у мышей, которые были генетически выразить флуоресцентных белков в определенных типах клеток 2-3 значительно расширили наши знания о физиологических и патологических процессов в различных тканях в естественных условиях 4-7. В исследованиях центральной нервной системы (ЦНС), наблюдается широкое применение в естественных изображений в мозге, который выпустил множество новых и часто неожиданные выводы о поведении клеток, таких как нейроны, астроциты, микроглия, под физиологических или патологических состояний 8-17. Тем не менее, в основном технические сложности имеют ограниченные реализации в области обработки изображений естественных условиях в исследованиях живой мыши спинного мозга. В частности, анатомическая близость спинного мозга в легкие и сердце генерирует значительные артефакты движения, что делает изображение живым спинного мозга сложной задачей. Мы разработали новый метод, который позволяет преодолеть ограничения, присущие спинного изображений шнура путем стабилизации позвоночника, уменьшения дыхательных вызванных движениями и тем самым облегчая использование двух-фотонной микроскопии для изображения мыши спинного мозга в естественных условиях. Это достигается путем объединения индивидуальных спинного устройство стабилизации с методом глубокого наркоза, что привело к значительному сокращению дыхательных вызванных движениями. Это видео протоколе показано, как предоставить небольшой участок живой спинного мозга, которые могут быть сохранены в стабильных физиологических условиях в течение длительного периода времени, сохраняя повреждения тканей и кровотечение к минимуму. Представитель сырых изображений, полученных в естественных деталей в высоком разрешении тесную связь между микроглии и сосудов. Timelapse последовательность показывает динамическое поведение микроглии процессов в живой мыши спинного мозга. Кроме того, непрерывное сканирование одного и того же г-кадр продемонстрироватьс выдающейся стабильности, что этот метод может достичь для получения стеков изображений и / или timelapse фильмы, которые не требуют выравнивания изображения после приобретения. Наконец, мы покажем, как этот метод может быть использован для пересмотра и Reimage же участок спинного мозга на более поздних timepoints, что позволяет для продольного исследования текущих физиологических или патологических процессов в живом организме.
Protocol
1. Строительство спинного устройство стабилизации
- Заказ Narishige STS-Компактный спинного мозга и зажимы Narishige MA-6N голову холдинга адаптера.
- Custom спроектировать и изготовить из нержавеющей стали плите провести два Narishige частей в соответствие так, что голова животного поддерживается в то время как позвоночник и хвост зажат. Имейте в виду, что все устройства должны помещаться под микроскопом линзы обычно на снизил столик микроскопа.
2. Животное хирургии
- Разогреть микроскоп камеры с устройством подогрева воздуха и поддерживать его при температуре 37 ° C.
- Взвешивание животных и сделать обезболивающий смеси с использованием 100 мг кетамина, 15 мг ксилазина и 2,5 мг acepromazine на кг массы тела, разводят в 0,9%-ный раствор NaCl в стерильных условиях.
- Анестезию животного путем введения анестетика смеси (KXA) внутрибрюшинно. Регулярные щипать ноги должны быть выполнены для обеспечения глубокого наркоза всейэксперимента. Дополнение с половиной исходной дозы почасовая или по мере необходимости.
- Используйте маленькую грелку животных для обеспечения тепловой поддержку при выполнении хирургического вмешательства.
- Применение искусственного мазь слезы на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы и повреждений.
- Бритье спине животного сначала с отделкой устройство, а затем с острым лезвием, чтобы полностью удалить волосы из области вокруг разреза.
- Удалить бритые волосы и дезинфицировать бритая поверхности кожи с алкоголем площадку.
- Выполните мала (~ 1,5 см) продольный разрез кожи над желаемой спинального уровня (грудных позвонков показано здесь).
- Expose мускулатуры в области спины, тщательно втягивания подкожной ткани соединительной.
- Аккуратно отделите от паравертебральных мышц позвоночника на желаемом уровне. Выполните как можно меньше разрезов, чтобы отделить мышц с обеих сторон каждого остистого отростка, а затем очистить отдельные мышцыпуть от ламинарного поверхности.
- Выберите пластинки, которые будут удалены и подготовить участки запись для спинного зажимы с каждой стороны позвоночника, сразу ростральной, а также каудально ламинэктомия. Тщательно перемещать мышечной ткани, чтобы сделать четыре кармана, где зажимы будет вставлен.
- Поднимите позвоночника с прямым зубчатым наконечником щипцы для безопасного вставки изогнутыми тупыми ножницами кончик под пластинки, не прикасаясь к спинному мозгу. Выполните ламинэктомии медленным резки костей с одной стороны, а затем на другой стороне.
- Используйте ватный тампон или вставить нарезанные небольшие gelfoam рассасывающиеся желатин части губки рядом с разрезами для ограничения незначительных кровотечений. Используйте маленькую cauterizer судно контролировать дальнейшее кровотечение, если это необходимо. Использование предварительно нагретую стерильной искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) мыть ткани.
3. Стабилизация позвоночника и подготовки для прижизненного изображения
- Plac электронной животное на высоте накладка на опорную плиту спинного устройств стабилизации и безопасности головы в голову проведение адаптера.
- Место спинного зажимы STS-устройства вдоль передне-задней оси животных в заранее подготовленные карманы фланговые ламинэктомия (рис. 1). Два зажима должен быть помещен под углом ~ 45 ° по отношению к rostro-каудальной оси животного, чтобы обеспечить достаточное пространство для снижения объектив погружения в воду над открытыми для спинного мозга (рис. 1).
- Место третий зажим STS-устройства на базе хвост так, тела животного может быть приостановлено в воздухе после удаления высоты площадки для продолжительности визуализации экспериментов (рис. 1).
- Построить небольшой яме Gelseal (Amersham Biosciences Corporation) вокруг подвергаются спинного мозга для облегчения обслуживания спинного мозга в ACSF и погружение микроскопа линзы в этом решение для визуализации в естественных условиях.
- Передача животных на спинной устройство стабилизации в разогретой камере покрытие микроскопа и закрепите ее на столик микроскопа снизил размещение ламинэктомии прямо под объективом (рис. 1).
- Нижняя воды погружения линз тщательно в раствор ACSF убедившись, что он не касается спинного зажимов или Gelseal.
- Используйте epifluorescence определить сферу интересов и сосредоточиться на нем. Переключение в режим лазерного сканирования и выполнять в визуализации естественных используя соответствующие двухфотонного лазерного возбуждения длины волны, dichroics и полосовой фильтры для флуорофоров присутствует в отображаемого ткани.
5. Повторные обработки изображений и послеоперационного ухода
- В конце эксперимента изображения, удалять мышь от спинного устройств стабилизации и тщательно протрите Gelseal из области вокруг ламинэктомия.Очистите место должно быть хорошо.
- Восстановление и шовный мышцы спины более ламинэктомия.
- Восстановление и шовный кожа над ламинэктомии, тампоном его с бетадин.
- Предоставление 1 мл лактата Рингера раствор (Baxter Healthcare) в качестве дополнения питательных веществ и гидратации, а также болеутоляющее лечение подкожно (0,1 мг / кг бупренорфина).
- Администрирование антисептическим внутрибрюшинно лечения (0,03 мл на мышь, 2,27% энрофлоксацина инъекционный антибактериальный раствор).
- Место животное на грелку до полного восстановления после анестезии, а затем дом его индивидуально.
- Повторите антисептическим администрации в день в течение первых 3-5 дней после операции и обезболивающее лечение каждые 8-12 часов в течение 2-3 дней после операции. Монитор животных ежедневно, чтобы обеспечить нормальное поведение и полное выздоровление.
- Для повторного изображения через те же ламинэктомии, возобновить зашивается кожу и мышцы и повторите действия, описанные в разделах 2 - 4.
- Повторно найти previously отображаемого области с помощью крови сосудистую как карту, как описано выше 10.
6. Представитель результаты
Все животные процедуры проводились под руководящих принципов, установленных институциональных уходу и использованию животных комитетов в Университете Калифорнии, Сан-Франциско и в соответствии с Федеральным нормам. Картину спинного устройств стабилизации и схематическое расположение мыши на устройство под микроскопом линзы показано на рисунке 1. Разрешение достаточно места для дыхания движений под тело животного обеспечивает стабильность в естественных изображений в спинной мозг. На рисунке 2 показана тесная связь между микроглии и сосудистая сеть, как это было отображается в естественных условиях в спинной мозг Cx3cr1 GFP / + трансгенных мышей, 18, , в которой микроглия являются эндогенно помечены GFP. На рисунке 3 показаны примеры повторяющихсяв естественных изображений, как она была исполнена в той же области спинного мозга в мышей, экспрессирующих флуоресцентного белка в спинномозговой аксонов (YFP-H строка 3) и микроглии (в Cx3cr1 GFP / + мышей).
Рисунок 1. Стабилизация мыши позвоночника для прижизненного изображения с помощью двух-фотонной микроскопии. (А) на заказ стальной опорной плитой используется для поддержки и выровнять STS-Narishige компактные зажимы спинного мозга и MA-6N Narishige глава холдинга адаптера, как показано здесь. (В) Правильное расположение взрослых трансгенных мышей анестезировали KXA анестетика на спинной устройство стабилизации. Вставке показаны размещения спинного зажимы сразу рострально и каудально к ламинэктомии и подвергаются ткани спинного мозга.
<IMG ALT = "Рисунок 2" SRC = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" />
Рисунок 2. В естественных изображений с высокой плотностью клеток микроглии и кровеносные сосуды в спинной мозг мышей под наркозом. Прогнозируемые но неприсоединившиеся Z-стеки (А) высокой плотности GFP-положительных микроглии (зеленый) в спинной мозг CX3CR1 GFP / + мышь в непосредственной близости с кровеносными сосудами (красные, помечены внутривенного введения родамина декстран). (Б) Высокая увеличения изображения помечены как в () одного микроглии клетка прикрепляется к стене из кровеносного сосуда с процессами расширенного вокруг судна и в сторону спинного паренхимы мозга. Шкала баров, 10 мкм.
Рисунок 3. Повторяющиеся в естественных изображений одного и того же аксонального сегментов и микроглии, как они были переселены и reimaged в спинной мозг мышей под наркозом в разные дни. (А) YFP-лабораторию eled аксонов на 0 и 5. (B). Же сосудистых структур и клеток микроглии вокруг них отображается в естественных условиях в спинной мозг Cx3cr1 GFP / + мышей на 0 и 1. Шкала баров, 10 мкм.
Фильм 1. Представителю timelapse последовательность приобретенные в естественных условиях от спинного мозга мыши. Эта последовательность показывает, подробно штраф микроглии динамику процесса (зеленый) и их взаимодействие с сосудистой (красный, помечены внутривенного введения родамина декстрана) с течением времени в ткани густонаселенных с люминесцентными структур. Необработанных изображений только с поправкой на фоновый шум, яркость и контрастность и timelapse фильм был построен на г-проектирование последовательно приобрела стеков изображения, без выравнивания изображения, в среднем или Z-выбор отдельных плоскостях. Кровеносные сосуды проходят через подобный спектр плоскостей г как образы микроглии. Z плоскости глубина: 38 мкм.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.
Фильм 2. Timelapse последовательность демонстрации сырья стабильность изображения методом на уровне одного г-плоскости. Быстрый захват одного и того же одной плоскости г, в спинном мозге CX3CR1 GFP / + мышей помещается на спинной устройство стабилизации под наркозом KXA, демонстрирует минимальное смещение изображения между последовательными кадрами при сканировании со скоростью 1 кадр / с, что быстрее, чем частота дыхания мыши. Незначительных остаточное смещение связано, вероятно, сердцебиение. Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь сохраняется стабильная и повторяющихся в естественных изображений густонаселенных флуоресцентные клеточных структур в спинной мозг мышей под наркозом с помощью двух-фотонной микроскопии. Достигнутая стабильность является результатом заказ спинного устройств стабилизации и режим анестезии, которая уменьшает дыхательную вызванной движением артефакт. Спинного устройство стабилизации позволяет передышку под корпусе мыши и могут быть построены с использованием коммерчески доступных спинного зажимы и глава крепежный элемент (рис. 1). Метод очень воспроизводимые, минимально-инвазивной и последовательно формирует исходные данные, которые можно использовать для экспериментального анализа изображений без широкого пост-обработки (рис. 2 и видео 1). Эта техника может быть использована для изучения межклеточных взаимодействий в изобилии имеющиеся в продаже люминесцентные линии мыши (рис. 1-3 и видео 1). Этот метод может решить не только густонаселенных клеточных структур, ноРБП быстро возникающие клеточных функций и ответы (Видео 1, 2). Например, она может быть использована для количественного измерения микроглии динамику процесса во времени, а также пройденное расстояние во время хемотаксиса поведения. Количественное может быть выполнена как описано выше для работы с изображениями микроглии реакции в живой мозг 8. Более того, он может быть использован в комбинации с другими экспериментальные подходы, такие как использование флуоресцентно меченных микросфер для измерения микроглии фагоцитоза в спинном мозге, в естественных условиях.
Способность выполнять повторяющиеся в естественных изображений точно такой же площади в спинной мозг тех же животных в разные дни позволяет изучать прогрессию биологических явлений и рассечение последовательность событий, которые могли бы быть, например, связанные с развитием болезни . Успешное применение этого метода для продольных исследованиях опирается на наличие тканей ориентиры для надежностиумело перемещение в районы, ранее образа. Это должно быть принято во внимание, в частности для исследования спинного травмы. Например, в некоторых из наиболее часто используемых травмы спинного мозга таких моделей, как ушиб спинного мозга или спинного гемисекция массивные некротические поражения, который создается в эпицентре травмы вызывает значительные аксонального и сосудистой перестройкой которые могли бы препятствовать переселению ранее отображаемого района. Эту проблему можно решить либо выполнение повторяющихся изображений в естественных условиях на краю поражения или выбрав травмы модель, которая вызывает целевые, небольшие повреждения, такие как тонкая модель перерезки иглы 19.
Метод, описанный здесь выставляет небольшой сегмент спинного мозга, выполняя одну ламинэктомии по области изображения цели. Основной вопрос длительности был оставлен нетронутым, где это возможно. Это гарантирует минимальное возмущение отображаемого ткани под мозговые оболочки и минимизирует вред, причиненныйдля позвоночника животного. Общая схема стабилизации может быть легко адаптирована для изображения либо через межслойной пространство без выполнения ламинэктомии 20 или через несколько серийных laminectomies если меньшее или большее изображение окна является предпочтительным для данного исследования соответственно.
Как и большинство в естественных условиях методы, результаты, полученные с помощью этого метода визуализации в естественных условиях может сильно зависеть от использования надлежащей анестезии. Смесь KXA анестезии, которая рекомендуется здесь также используется в визуализации исследований различных тканей до 21-24 и был выбран исключительно на основании его способность значительно уменьшить дыхательные движения. Другие подходы анестетика может привести сопоставимые результаты в эту смесь KXA.
Метод визуализации спинного шнур, описанные в этом протокол предоставляет мощный инструмент для исследования спинного мозга, с возможностью записи межклеточных взаимодействий в реальном тIME могут существенно облегчить в естественных условиях исследования спинного мозга в области физиологии и патологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального общества рассеянного склероза грант RG4595A1 / T с РД и NIH / NINDS гранты NS051470, NS052189 и NS066361 К. А. Рисунки и фильмы адаптированы и / или перепечатана из Давалос и соавт., J Neurosci методы. 30 марта 2008; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, с разрешения Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubricant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Curved, blunt-tipscissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps | Narishige International | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorphine,injectable |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad - Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
