Summary
Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar repetitivas
Abstract
Imágenes in vivo utilizando microscopía de dos fotones 1 en ratones que han sido genéticamente modificadas para expresar proteínas fluorescentes en células específicas de los tipos 2.3 ha ampliado significativamente nuestro conocimiento de los procesos fisiológicos y patológicos en numerosos tejidos in vivo 4-7. En los estudios del sistema nervioso central (SNC), ha habido una aplicación amplia de imágenes in vivo en el cerebro, lo cual ha producido una plétora de nuevos hallazgos y muchas veces inesperados sobre el comportamiento de las células como las neuronas, astrocitos, microglia, en condiciones fisiológicas o patológicas 08.17. Sin embargo, las complicaciones técnicas en su mayoría han limitado la implementación de imágenes in vivo en los estudios de la médula espinal de ratón vivo. En particular, la proximidad anatómica de la médula espinal a los pulmones y el corazón genera artefacto de movimiento significativo que hace imágenes de la médula espinal que viven una tarea difícil. Hemos desarrollado un método novedoso que supera las limitaciones inherentes de las imágenes de la médula espinal mediante la estabilización de la columna vertebral, la reducción de las vías respiratorias inducida por los movimientos y facilitando así el uso de la microscopia de dos fotones de la imagen de la médula espinal de ratón in vivo. Esto se logra mediante la combinación de un dispositivo a medida estabilización de la columna con un método de anestesia profunda, lo que resulta en una reducción significativa de las vías respiratorias inducida por los movimientos. Este protocolo de vídeo muestra cómo exponer una pequeña zona de la médula espinal de vida que se puede mantener en condiciones de estabilidad fisiológica durante largos períodos de tiempo manteniendo la lesión tisular y el sangrado al mínimo. Representante imágenes primas adquiridas en detalle vivo en alta resolución, la estrecha relación entre la microglia y la vasculatura. Una secuencia de timelapse muestra el comportamiento dinámico de los procesos microgliales en la médula espinal de ratón vivo. Por otra parte, un análisis continuo de la misma z-marco demostrars de la excelente estabilidad que este método puede lograr la generación de pilas de imágenes y / o películas timelapse que no requieren la alineación de la imagen después de la adquisición. Por último, se muestra cómo este método puede ser utilizado para revisar y crear la imagen de la misma zona de la médula espinal en los puntos de tiempo posteriores, teniendo en cuenta los estudios longitudinales en curso de los procesos fisiológicos o patológicos en vivo.
Protocol
1. La construcción del dispositivo de estabilización de la columna
- Para la misión STS-A Narishige abrazaderas compacto de la médula espinal y el Narishige MA-6N adaptador de cabeza afirmado.
- Diseño personalizado y hacer una placa base de acero inoxidable para mantener las dos partes Narishige en la alineación de modo que la cabeza del animal con el apoyo, mientras que su columna vertebral y la cola se sujetan. Tenga en cuenta que todo el dispositivo debe caber bajo el lente de un microscopio por lo general en una platina del microscopio baja.
2. Cirugía en animales
- Pre-calentar el microscopio de la cámara con un dispositivo de calentamiento de aire y mantener a 37 ° C.
- Pesan los animales y hacer la mezcla anestésica con 100 mg de ketamina, 15 mg y 2,5 xilazina acepromacina mg por kg de peso corporal, diluido en solución de NaCl al 0,9% en condiciones estériles.
- Anestesiar a los animales mediante la inyección de la anestesia mezcla (KXA) por vía intraperitoneal. Pellizcar los pies regularmente se deben realizar para asegurar una anestesia profunda a lo largo deel experimento. Suplemento con la mitad de la dosis original cada hora o cuando sea necesario.
- Use una almohadilla de calefacción animales pequeños como para proporcionar respaldo térmico, mientras que la realización del procedimiento quirúrgico.
- Aplique un ungüento de lágrimas artificiales en los ojos para prevenir la deshidratación y el daño corneal.
- Afeitarse la parte posterior del primer animal con un dispositivo de corte y luego con una cuchilla para eliminar por completo el cabello del área alrededor de la incisión.
- Eliminar el vello rasurado y desinfección de la superficie de la piel afeitada con una gasa con alcohol.
- Realice una pequeña (alrededor de 1,5 cm) incisión longitudinal de la piel sobre el nivel deseado la columna (vértebras torácicas se muestra aquí).
- Exponer la musculatura de la espalda con cuidado retracción del tejido conjuntivo subcutáneo.
- Separar cuidadosamente los músculos paravertebrales de la columna vertebral en el nivel deseado. Realizar el menor número de incisiones posible separar los músculos de ambos lados de cada apófisis espinosa y luego raspar los músculos separados unoforma de la superficie laminar.
- Elige la lámina que será eliminado y preparar los sitios de entrada de las abrazaderas de la columna a cada lado de la columna vertebral, inmediatamente rostral y caudal a la laminectomía. Con cuidado, desplazar el tejido muscular para hacer cuatro bolsillos en las abrazaderas se inserta.
- Levante la columna vertebral con la recta de dientes con punta de pinza para permitir la inserción segura de la curva puntas romas tijeras bajo la lámina sin tocar la médula espinal. Realizar la laminectomía lentamente cortando el hueso en un lado y luego en el otro lado.
- Use un hisopo de algodón o insertar precortadas pequeñas piezas de espuma de gel absorbible esponja de gelatina al lado de la incisión para reducir el sangrado menor. Use un vaso pequeño cauterizador para controlar el sangrado, si fuera necesario. Use precalentado líquido estéril cefalorraquídeo artificial (ACSF) para lavar los tejidos.
3. La estabilización de la columna vertebral y la preparación de imágenes in vivo
- Plac e el animal sobre una superficie de elevación en la placa base del dispositivo de estabilización espinal y asegurar la cabeza en el adaptador de la cabeza de espera.
- Coloque las abrazaderas de la columna vertebral de la misión STS-un dispositivo a lo largo del eje antero-posterior del animal en los bolsillos ya preparados que flanquean la laminectomía (Figura 1). Las dos pinzas deben ser colocados en un ángulo de 45 º respecto al eje rostro-caudal del animal para permitir el espacio suficiente para bajar una lente de inmersión en agua sobre la médula espinal expuesta (Figura 1).
- Coloque la abrazadera de la tercera parte de la misión STS-Un dispositivo en la base de la cola para el cuerpo del animal puede ser suspendido en el aire después de la eliminación de la plataforma de elevación de la duración de los experimentos de imagen (Figura 1).
- Construir un pequeño pozo de Gelseal (Amersham Biosciences Corp.) que rodea la médula espinal expuesta para facilitar el mantenimiento de la médula espinal en ACSF y la inmersión de la lente de un microscopio en esta solución para imágenes in vivo.
- La transferencia de los animales en el dispositivo de estabilización espinal dentro de la cámara precalentada cubrir el microscopio y seguro que en un escenario reducido microscopio colocando la laminectomía directamente debajo de la lente (Figura 1).
- Inferior de una lente de inmersión en agua con cuidado en la solución ACSF asegurarse de que no toque las abrazaderas de la columna vertebral o Gelseal.
- El uso de epifluorescencia para identificar el área de interés y se centran en ella. Cambiar al modo de escaneo láser y realizar imágenes in vivo utilizando el apropiado de dos fotones de longitud de onda de excitación láser, dicroicos y paso de banda de los filtros de los fluoróforos presentes en el tejido imágenes.
5. Imágenes repetitivas y el cuidado post-operatorio
- Al final de los experimentos de imagen, eliminar el ratón desde el dispositivo de estabilización de la columna y limpie con cuidado la Gelseal del área alrededor de la laminectomía.Limpie bien la zona.
- Restaurar y sutura de los músculos de la espalda durante la laminectomía.
- Restaurar y sutura de la piel sobre la laminectomía, se esponja con betadine.
- Proporcionar una solución de Ringer lactato ml (Baxter Healthcare) como un suplemento de nutrientes y la hidratación, así como el tratamiento analgésico por vía subcutánea (0,1 mg / kg de buprenorfina).
- Administrar por vía intraperitoneal tratamiento antiséptico (0,03 ml por ratón, el 2,27% enrofloxacina inyectable solución antibacteriana).
- Lugar de los animales en un cojín de la calefacción hasta que la recuperación completa de la anestesia y posteriormente se casa de forma individual.
- Repita la administración antiséptico día durante los primeros 3-5 días después de la cirugía y el tratamiento analgésico cada 8-12 horas durante 2-3 días después de la operación. Monitor de animales a diario para garantizar un comportamiento normal y plena recuperación.
- Para re-imágenes a través de la laminectomía mismo, vuelva a abrir la piel y los músculos de sutura y repita los pasos descritos en los apartados 2 a 4.
- Re-localizar el Previously imágenes área mediante el uso de los vasos sanguíneos como un mapa de lo descrito previamente 10.
6. Los resultados representativos
Todos los animales procedimientos fueron realizados bajo los lineamientos establecidos por Cuidado de Animales institucional y los Comités de Uso de la Universidad de California, San Francisco y están de acuerdo con las regulaciones federales. Una imagen del dispositivo de estabilización de la columna y un esquema que muestra la posición del ratón en el dispositivo a una lente de un microscopio se muestra en la Figura 1. Dejando espacio suficiente para los movimientos de la respiración debajo del cuerpo del animal asegura estable de imágenes in vivo en la médula espinal. La figura 2 muestra la estrecha relación entre la microglia y la vasculatura, ya que fue fotografiada en vivo en la médula espinal de CX3CR1 GFP / + ratones transgénicos 18, en el que la microglía son endógenamente marcado con GFP. Figura 3 muestra ejemplos de repeticiónimágenes in vivo, ya que se llevó a cabo en las áreas de la médula espinal misma en ratones que expresan una proteína fluorescente en los axones espinales (YFP-H línea 3) y microglia (en el CX3CR1 GFP / + ratones).
Figura 1. Estabilización de la columna espinal de ratón de imágenes in vivo utilizando microscopía de dos fotones. (A) Una placa de acero a medida base se utiliza para apoyar y alinear la misión STS-A Narishige compacto abrazaderas de la médula espinal y la MA-6N Narishige sosteniendo la cabeza de adaptador como se muestra aquí. (B) La posición correcta de los adultos ratones transgénicos anestesiados con anestesia KXA en el dispositivo de estabilización de la columna. El inserto muestra la ubicación de las abrazaderas de la columna vertebral inmediatamente rostral y caudalmente a la laminectomía y el tejido expuesto de la médula espinal.
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Figura 2. En imágenes in vivo de las células microgliales de alta densidad y los vasos sanguíneos en la médula espinal de ratones anestesiados. Proyectado, pero no alineados z-pilas de (A) de alta densidad GFP-positivas microglia (verde) en la médula espinal de un CX3CR1 GFP / + ratón en estrecha proximidad con los vasos sanguíneos (rojo, marcado con la inyección intravenosa de rodamina dextrano). (B) Ampliación de imagen en alta como en la etiqueta (A) de una sola célula microglial pegado a la pared de un vaso sanguíneo con los procesos se extendía alrededor de la nave y hacia el parénquima de la médula espinal. Las barras de escala, 10μm.
Figura 3. Repetitivos de imágenes in vivo de los mismos segmentos axonal y microglia, ya que fueron reubicados y reimaged en la médula espinal de ratones anestesiados en diferentes días. (A) YFP-lab axones ELED en los días 0 y 5. (B). Las mismas estructuras vasculares y células microgliales rodean imágenes en vivo en la médula espinal de CX3CR1 GFP / + ratones en los días 0 y 1. Las barras de escala, 10μm.
Movie 1. Secuencia timelapse Representante adquiridos en vivo de la médula espinal de ratón. Esta secuencia muestra con gran detalle la dinámica del proceso microglial (verde) y sus interacciones con el sistema vascular (rojo, marcado con inyección intravenosa de rodamina dextrano) a través del tiempo dentro de un tejido densamente poblado con estructuras fluorescentes. Las imágenes en bruto se han corregido sólo por el ruido de fondo, el brillo y el contraste y la película timelapse fue construido por la z-proyección de imagen de las pilas de forma secuencial adquirida, sin alineación de la imagen, con un promedio o z-selección de los planos individuales. Los vasos sanguíneos pasan por una serie similar de aviones z como las imágenes de la microglía. Z profundidad de avión: 38 micras.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Haga clic aquí para ver la película.
Movie 2. Timelapse secuencia que demuestra la estabilidad de la prima el método de imagen a nivel de un único plano-z. Rápida adquisición de la misma y única plano z en la médula espinal de los ratones CX3CR1 GFP / + colocado en el dispositivo de estabilización de la columna vertebral bajo anestesia KXA, demuestra un mínimo desplazamiento de la imagen entre imágenes consecutivas a una velocidad de barrido de un cuadro / s que es más rápido que el la frecuencia respiratoria del ratón. El desplazamiento residual menor de edad se debe probablemente al latido del corazón. Haga clic aquí para ver la película.
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Discussion
El método aquí descrito permite estable y repetitiva de imágenes in vivo de la densamente poblada estructuras fluorescentes celular en la médula espinal de ratones anestesiados utilizando microscopía de dos fotones. La estabilidad alcanzada es el resultado de un dispositivo de estabilización a medida la columna vertebral y un régimen anestésico que reduce las vías respiratorias inducida por el artefacto de movimiento. El dispositivo de estabilización de la columna permite el espacio para respirar debajo del cuerpo del ratón y se puede construir utilizando pinzas espinal disponibles en el mercado y la pieza de montaje de la cabeza (Fig. 1). El método es altamente reproducible, mínimamente invasiva y siempre genera los datos en bruto que puede ser utilizado para el análisis experimental sin imagen amplia de post-procesamiento (Fig. 2 y Video 1). Por lo tanto, esta técnica puede ser utilizada para el estudio de las interacciones célula-célula en la abundancia de líneas de ratón comercialmente disponible fluorescentes (Figs. 1-3 y Video 1). Este método se puede resolver no sólo densamente pobladas estructuras celulares, sino unlso que ocurren rápidamente las funciones celulares o respuestas (Videos 1, 2). Por ejemplo, se puede utilizar para medir cuantitativamente la dinámica de la microglia proceso en el tiempo, así como la distancia recorrida durante el comportamiento quimiotáctico. La cuantificación se puede realizar como se ha descrito anteriormente para las respuestas de imagen de la microglia en el cerebro vivo 8. Por otra parte, se puede utilizar en combinación con otros métodos experimentales como el uso de la etiqueta fluorescente microesferas para medir la fagocitosis microglial en la médula espinal en vivo.
La capacidad de realizar repetitiva de imágenes in vivo de la zona exacta en la médula espinal de los mismos animales en diferentes días permite estudiar la evolución de los fenómenos biológicos y la disección de la secuencia de eventos que podrían, por ejemplo, estar involucrados con el desarrollo de la enfermedad . La aplicación exitosa de este método para los estudios longitudinales se basa en la disponibilidad de puntos de referencia para el tejido relihábilmente la reubicación de las áreas que fueron estudiados previamente. Esto debe ser tenido en cuenta en particular de la columna vertebral estudios de lesión de la médula. Por ejemplo, en algunos de los modelos comúnmente utilizados lesión medular, tales como contusión de la médula espinal o hemisección dorsal de la lesión necrótica masiva que se genera en el epicentro de la lesión hace una reordenación significativa axonal y vascular que podría dificultar la reubicación de la zona anteriormente reflejados. Esto puede ser superado por cualquiera de las repetitivas realizar imágenes in vivo en el borde de la lesión o mediante la selección de un modelo de lesión que provoque una lesión diana, más pequeños, como el modelo de aguja fina sección transversal 19.
El método descrito aquí expone un pequeño segmento de la médula espinal, mediante la realización de una laminectomía sola en el área de imagen de destino. La cuestión subyacente dura se ha dejado intacto en lo posible. Esto asegura un mínimo de perturbación del tejido fotografiado por debajo de las meninges y minimiza la lesión sufridaa la columna vertebral del animal. El plan de estabilización general se pueden adaptar fácilmente a la imagen ya sea a través del espacio interlaminar sin realizar una laminectomía 20 o a través de múltiples laminectomies serie si un menor, respectivamente, o una ventana de imagen más grande es el preferido para un estudio determinado.
Como es común con la mayoría de técnicas in vivo, los resultados obtenidos mediante el uso de este método de imagen en vivo en gran medida puede depender del uso de la anestesia adecuada. La mezcla KXA anestésico que se recomienda aquí también se ha utilizado en estudios de imagen de los diferentes tejidos antes de 21-24 y fue seleccionado exclusivamente en función de su capacidad para reducir significativamente los movimientos respiratorios. Otros métodos anestésicos pueden producir resultados comparables a esta mezcla KXA.
La técnica de la médula espinal de imágenes descritos en este protocolo proporciona una poderosa herramienta para la investigación de la médula espinal, ya que la capacidad de grabar interacciones célula-célula en t realesime puede facilitar enormemente los estudios in vivo de la médula espinal en la fisiología y la patología.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple conceder RG4595A1 / T para DD y las subvenciones del NIH / NINDS NS051470, NS052189 y NS066361 a las figuras KA y películas adaptadas y / o reimpresión de Dávalos et al., J Métodos Neurosci. 2008 Mar 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, con permiso de Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubricant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Curved, blunt-tipscissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps | Narishige International | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorphine,injectable |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad - Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
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