Summary
微创的协议，以稳定脊柱鼠标和执行重复
Abstract
在体内成像已遗传工程小鼠表达荧光蛋白在特定的细胞类型 2-3显著扩大我们的生理和病理过程知识在众多的组织在 体内 4-7使用双光子显微镜 1 。在中枢神经系统（CNS）的研究，已被广泛的应用在体内成像在大脑中，这已经产生了众多新颖的细胞，如神经元，星形胶质细胞，小胶质细胞，在行为往往是意外的结果生理或病理条件下 8-17 。然而，大多是复杂的技术问题，有限的生活小鼠脊髓的研究在体内成像的实施。特别是，对脊髓的解剖毗邻的肺部和心脏产生显著运动伪影，使成像的生活脊髓一项艰巨的任务。 我们开发出一种新的方法，克服了稳定脊柱，减少呼吸道引起的运动，从而促进利用双光子显微镜的图像在体内小鼠脊髓的脊髓造影固有的局限性。这是通过深麻醉方法相结合的一个定制的脊柱稳定装置，导致呼吸道引起的运动的一个显着减少。这个视频协议显示了如何公开一个可以维持稳定的生理条件下过长时间保持组织损伤和出血最低生活脊髓的小面积。具有代表性的原始图像在高分辨率收购体内详细的小胶质细胞和血管之间的密切关系。一个timelapse序列显示了在生活小鼠脊髓小胶质细胞过程的动态行为。此外，一个相同的Z -帧的连续扫描显示S的出色的稳定性，这种方法可以实现图像和/或timelapse电影，不需要图像对齐收购后产生的栈。最后，我们表明这种方法可用于如何重新审视和重新映像在稍后的时间点脊髓同一地区，从而在体内持续的生理或病理过程的纵向研究。
Protocol
1。大厦的脊椎稳定装置
- 订购Narishige STS的紧凑型脊髓夹钳和Narishige马6N头控股适配器。
- 自定义的设计和制造的不锈钢底板举行对齐Narishige的两个部分，使动物的头是支持，而其脊柱和尾巴夹紧。请记住，整个装置应适合在显微镜下的镜头，通常在降低显微镜阶段。
2。动物手术
- 预热空气加热装置的显微镜室，并保持在37 ° C。
- 称量动物和麻醉剂混合使用100毫克氯胺酮，甲苯噻嗪15毫克和2.5毫克每公斤体重acepromazine无菌条件下，在0.9％NaCl溶液稀释。
- 注射麻醉剂混合（KXA）腹腔麻醉动物。应定期脚趾捏执行，以确保深麻醉，整个实验。一半原始剂量每小时或需要补充。
- 使用小动物加热垫，提供热的支持，同时执行外科手术。
- 应用人工泪液对眼睛的药膏，以防止角膜脱水和损害。
- 首先具有剪裁设备，然后用锋利的刀片，从切口周围地区彻底清除头发剃动物背面。
- 删除剃光头发剃去皮肤表面用酒精垫消毒。
- 执行一个小的（〜1.5厘米）的纵行切开皮肤所需的脊髓水平（此处显示胸椎）。
- 揭露仔细缩回皮下结缔组织的背部肌肉。
- 仔细分离脊柱椎旁肌，在理想的水平。执行尽可能少的切口，脱离每个棘突两侧的肌肉，然后刮分离肌肉从层表面的方式。
- 选择将要删除的的椎板和脊柱两侧脊髓夹具准备进入的网站，立即延髓和尾鳍的椎板切除术。仔细取代肌肉组织，使四个夹具将被插入口袋。
- 电梯与直齿尖镊子脊柱，让没有接触的脊髓弯曲的钝头剪刀椎板下安全地插入。慢慢切割一侧的骨，然后和对方进行椎板切除术。
- 使用棉签或预切小明胶海绵吸收明胶海绵片插入切口限制轻微出血。使用一个小的船只cauterizer，如果有必要进一步控制出血。使用预热的无菌人工脑脊液（ACSF）冲洗组织。
3。 在体内成像稳定脊柱和准备
- 的Plac E的动物脊椎稳定装置的底座上海拔垫和安全的头部，在头部控股适配器。
- 将沿侧翼椎板切除术（图1）在事先准备好的口袋里的动物的前后轴的STS - A装置脊髓夹具。两个夹子应放置在一个角〜45 °相对于动物的rostro尾椎轴允许足够的空间，在暴露脊髓（图1）为降低水浸泡镜头。
- 将第三钳在动物的身体，可以使悬浮在空气中海拔垫去除成像实验（图1）的时间后尾基础的STS - A设备。
- 建立一个小Gelseal（Amersham Biosciences公司公司）在外露的脊髓以及在学联脊髓维修方便，在此解决方案中的显微镜镜头浸泡在体内成像。
- 动物的脊椎稳定装置传输覆盖在显微镜内的预热室和安全上降低显微镜配售阶段的椎板切除，直镜头下的（图1）。
- 下一个镜头浸水，小心地将学联的解决方案，确保它不触及脊髓夹具或Gelseal。
- 使用epifluorescence找出感兴趣的领域，专注于IT。切换到激光扫描模式，并使用相应的双光子激光激发波长，dichroics和带通的荧光团的过滤器在成像组织目前在体内成像执行。
5。重复成像和手术后的护理
- 在成像实验结束时，请从脊椎稳定装置鼠标，并仔细擦拭周围椎板切除的面积Gelseal。以及清洁的区域。
- 还原和缝合在椎板切除背部肌肉。
- 还原和缝合皮肤在椎板切除，用优碘棉签。
- 提供1毫升乳酸钠林格作为补充营养和水化溶液（百特医疗用品），以及镇痛治疗皮下注射（0.1毫克/千克丁丙诺啡）。
- 管理防腐处理腹腔（每鼠0.03毫升，2.27％恩诺沙星注射抗菌解决方案）。
- 广场上，直到完全恢复从麻醉中加热垫的动物和随后它单独的房子。
- 每天重复防腐管理，为2-3天，手术后第3-5天，手术后镇痛治疗，每8-12小时。日常监测，以确保正常的行为，并全面复苏。
- 通过相同的椎板切除术的重新成像，重新缝合的皮肤和肌肉，然后重复第2 - 4中所述的步骤。
- 重新定位的先前ously使用地图作为先前所描述的10的血液血管成像区域。
6。代表性的成果
所有动物的程序进行体制在旧金山加利福尼亚大学的动物护理和使用委员会的指引下，按照联邦法规。的脊椎稳定装置的图片和显示设备上的显微镜镜头下的鼠标定位原理图如图1所示。允许动物的身体底下呼吸运动足够的房间，确保稳定， 在体内脊髓成像。 图2显示小胶质细胞和血管之间关系密切因为它是在体内成像在脊髓CX3CR1 GFP / +转基因小鼠18，小胶质细胞是内源性与GFP标记。 图3显示了重复的例子在体内成像，因为它是在执行相同的表达在脊髓轴突荧光蛋白（YFP - H 线 3）和小胶质细胞（CX3CR1 GFP / +小鼠）的小鼠脊髓领域。
图1。小鼠体内成像，利用双光子显微镜的脊柱的稳定。（A）定制的钢底板是用来支持和调整的STS - Narishige紧凑脊髓夹具和MA - 6N Narishige头控股适配器，如下所示（B）与脊椎稳定装置KXA麻醉麻醉的成年转基因小鼠的正确定位。插入显示立即rostrally和尾端的椎板切除术和暴露的脊髓组织脊髓夹具的位置。
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图2在体内的高密度小胶质细胞和麻醉小鼠的脊髓血管成像。 （一）预计，但不结盟Z -叠高度密集的GFP阳性小胶质细胞（绿色）在一个CX3CR1 GFP / +鼠标在接近血管（红色标记，静脉注射罗丹明葡聚糖）的脊髓。 （二）（一）一个单一的小胶质细胞与周围的船只扩展的进程，对脊髓实质血管壁高倍率图像标记。比例尺为10μm。
图3。重复相同的轴突段和小胶质细胞，因为他们在不同的日子里搬迁重新制作映像脊髓麻醉小鼠体内成像。 （一）YFP的实验室 0和5天的ELED轴突。 （二）。相同的血管结构和他们周围的小胶质细胞成像在体内的0和1 天的CX3CR1 GFP / +小鼠的脊髓。比例尺为10μm。
电影1。代表timelapse序列在体内收购从小鼠的脊髓。这个顺序显示在详细细的小胶质细胞的过程动态（绿色）和它们之间的相互作用，超过时间内密集的荧光结构填充组织的血管（红色标记，四罗丹明右旋糖酐注射）。只有纠正原始图像背景噪声，亮度，对比度和timelapse电影Z -投影顺序获得的图像栈构造，没有图像对齐，平均或个别平面的Z -选择。血管经过一个类似的范围内小胶质细胞的图像z平面。 Z平面深度：38微米。oad/2760/Davalos_Movie_1.mov“>点击这里观看影片。
电影2。Timelapse序列，证明在一个单一的z平面水平的成像方法的原始稳定性。快速获取相同的单/ GFP的 CX3CR1 +脊椎稳定装置划归KXA麻醉小鼠的脊髓z平面，演示在1帧/秒的扫描速度比快的连续帧之间的最小图像位移鼠标的呼吸率。轻微的剩余位移可能是由于心跳。 点击这里观看影片。
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Discussion
这里介绍的方法， 可以在体内成像人口稠密荧光灯在使用双光子显微镜的麻醉小鼠的脊髓细胞结构稳定和重复性。所取得的稳定，是一个特制的脊椎稳定装置和麻醉方案，减少呼吸道引起的运动伪影的结果。脊椎稳定装置允许下的鼠体呼吸的空间，可使用市售的脊髓夹具和头部安装片（图1）。高重现性好，微创的方法是，始终没有广泛的图像后处理（图和视频1），可用于实验分析产生的原始数据。因此，这种技术可以用于在市售的荧光鼠标线（图1-3和视频1）丰富的细胞间的相互作用的研究。这种方法可以解决，不仅人口稠密的细胞结构，但LSO迅速发生细胞功能或反应（视频1，2）。例如，它可以使用量随着时间的推移，以及距离旅行期间的趋化行为的小胶质细胞过程的动态。可以进行量化，因为我们以前小胶质细胞的反应成像在活脑8。此外，它可以组合使用，与其他实验方法，如使用荧光标记的微球在体内脊髓小胶质细胞的吞噬功能来衡量。
重复执行的确切同一地区在不同的日子相同的动物的脊髓体内成像的能力允许研究生物现象和事件的顺序，例如与疾病的发展涉及的解剖进展。这种纵向研究方法的成功应用依赖于可靠的可用性组织的地标干练搬迁以前成像领域。这需要采取特别考虑到为脊髓损伤的研究。例如，在一些常用的脊髓损伤模型，如脊髓挫伤或背侧半切，在震中的伤害产生大量的坏死性病变，导致显著性轴索和血管的重排，可能会阻碍搬迁以前的成像面积。这是可以克服的，要么执行重复体内成像在病灶边缘或通过选择损伤模型，导致有针对性的，较小的病变，如细 针横断模型 19 。
这里所描述的方法暴露了一小部分，通过执行对目标成像面积的单椎板切除脊髓。完好的地方，底层的硬脑膜此事已经离开。这将确保最小扰动下方的脑膜成像组织，并最大限度地减少发生的伤害动物的脊椎。全面稳定计划可以很容易地适应图像通过层间空间不进行椎板切除术20或多个串行laminectomies通过一个较小或较大的成像窗口分别为一个给定的研究的首选。
大部分在体内的技术，通过在体内成像方法得到的结果可能在很大程度上取决于使用适当的麻醉。这里建议KXA麻醉剂混合也被用来在不同组织的成像研究之前 21-24完全被选为根据其能力显著减少呼吸运动。其他麻醉方法可能会产生比较的结果，这KXA组合。
本议定书中所描述的脊髓造影技术提供了一个脊髓研究的有力工具，因为能够记录真实吨细胞间的相互作用IME可以极大地方便在体内脊髓的生理和病理研究。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
支持这项工作是由国家多发性硬化症协会授予RG4595A1 / T DD和美国国立卫生研究院/ NINDS补助NS051470，NS052189和NS066361 KA图和电影改编和/或重印达瓦洛斯等人 ，J神经科学方法。 2008年03月30日; 169（1）:1 - 7版权所有2008年从爱思唯尔的权限，。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubricant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Curved, blunt-tipscissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps | Narishige International | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorphine,injectable |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad - Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
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