Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi

Published: January 5, 2012 doi: 10.3791/2760
Automatic Translation
1, 1,2
1Gladstone Institute of Neurological Disease, University of California, San Francisco, 2Department of Neurology, University of California, San Francisco

Summary

Et minimalt invasiv protokol til at stabilisere musen rygsøjlen og udføre gentagne

Abstract

In vivo imaging ved hjælp af to-foton mikroskopi 1 i mus, der er genetisk manipuleret til at udtrykke fluorescerende proteiner i bestemte celletyper 2-3 er blevet væsentligt udvidet vores viden om fysiologiske og patologiske processer i talrige væv in vivo 4-7. I studier af det centrale nervesystem (CNS), har der været en bred anvendelse af in vivo imaging i hjernen, som har produceret et væld af nye og ofte uventede resultater om opførslen af celler som neuroner, astrocytes, mikroglia, under fysiologiske eller patologiske tilstande 8-17. Imidlertid har det meste tekniske komplikationer begrænsede gennemførelse af in vivo billeddannelse i studier af den levende mus rygmarven. I særdeleshed genererer anatomiske nærhed af rygmarven til lungerne og hjertet betydelig bevægelse artefakt, der gør billedbehandling den levende rygmarven en udfordrende opgave. Vi har udviklet en ny metode, der overvinder de iboende begrænsninger i rygmarven imaging ved at stabilisere rygsøjlen, reducere luftvejs-inducerede bevægelser og dermed fremme brugen af to-foton mikroskopi til billede musen rygmarven in vivo. Dette opnås ved at kombinere en skræddersyet spinal stabilisering enhed med en metode til dyb anæstesi, hvilket resulterer i en betydelig reduktion af luftvejs-induceret bevægelser. Denne video-protokollen viser, hvordan du kan udsætte et lille område af den levende rygmarven, der kan vedligeholdes under stabile fysiologiske forhold over længere perioder ved at holde vævsskade og blødning til et minimum. Repræsentant rå billeder erhvervet in vivo detaljer i høj opløsning den tætte sammenhæng mellem mikroglia og kar. En timelapse sekvens viser den dynamiske adfærd microglial processer i levende mus rygmarven. Desuden en kontinuerlig scanning af samme z-frame demonstreres enestående stabilitet, at denne metode kan nå at generere stakke af billeder og / eller timelapse film, der ikke kræver billede styremærket-købet. Endelig vil vi vise, hvordan denne metode kan bruges til at vende tilbage til og Reimage det samme område af rygmarven på senere tidspunkter, der giver mulighed for longitudinelle studier af igangværende fysiologiske eller patologiske processer in vivo.

Protocol

1. Opbygning af spinal stabilisering enhed

  1. Bestil Narishige STS-A Compact Rygmarv Klemmer og Narishige MA-6N hovedet holder adapter.
  2. Brugerdefineret design og gøre en rustfri stål base plade til at holde de to Narishige dele i tilpasningen, således at dyrets hoved er understøttet, mens dens rygsøjlen og hale er fastspændt. Husk, at hele enheden skal passe under lup linsen som regel på en sænket mikroskop scene.

2. Animal kirurgi

  1. Pre-varme mikroskopet kammeret med en luftopvarmning enhed og fastholde den ved 37 ° C.
  2. Vejer dyret og gøre bedøvelse miks med 100 mg ketamin, 15 mg xylazin og 2,5 mg acepromazin per kg legemsvægt, fortyndes i 0,9% NaCl-opløsning under sterile forhold.
  3. Bedøver dyret ved at indsprøjte bedøvelsesmiddel mix (KXA) intraperitonealt. Regelmæssig tå klemme bør udføres for at sikre en dyb anæstesi heleeksperimentet. Supplere med halvdelen af ​​den oprindelige dosis time eller efter behov.
  4. Brug en lille dyr varmepude til at give termiske støtte, mens de udfører den kirurgiske procedure.
  5. Anvend kunstige tårer salve over øjnene for at forhindre hornhindens dehydrering og skader.
  6. Barbere ryggen af ​​dyret først med en trimning enhed og derefter med en skarp kniv til at helt at fjerne hår fra området omkring snittet.
  7. Fjern barberet hår og desinficere det barberede hudoverfladen med en alkohol pad.
  8. Udfør en lille (~ 1,5 cm) langsgående indsnit i huden over det ønskede spinal niveau (brysthvirvel vist her).
  9. Udsæt rygmuskulaturen ved omhyggeligt tilbagetrækningskraften det subkutane bindevæv.
  10. Adskil forsigtigt paravertebral muskler fra rygsøjlen på det ønskede niveau. Udfør færrest mulige snit til at løsne musklerne fra begge sider af hver spinosus proces og derefter skrabe de løsrevne musklerne envejen fra laminar overfladen.
  11. Vælg den lamina, der vil blive fjernet, og forberede lokaliteter til indrejse for spinal klemmer på hver side af rygsøjlen, straks rostralt og caudal til laminektomi. Omhyggeligt fortrænge muskelvæv til at gøre fire lommer, hvor klemmerne vil blive indsat.
  12. Løft rygsøjlen med fortandet-spids pincet til at tillade sikker indsættelse af den buede stump-spids saks under lamina uden at røre rygmarven. Udfør laminektomi ved langsomt at skære til benet på den ene side og så på den anden side.
  13. Brug en vatpind eller indsæt forud skårne lille gelfoam resorberbare gelatine svamp stykker ved siden af ​​indsnit at begrænse mindre blødning. Brug en lille fartøj cauterizer at kontrollere yderligere blødning, hvis det er nødvendigt. Brug forvarmet sterile kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) at vaske væv.

3. Stabilisering af rygsøjlen og forberedelse til in vivo imaging

  1. Plac e dyret på en højde pad på bundpladen af ​​spinal stabilisering enheden og sikre hovedet i hovedet at holde adapter.
  2. Placer spinal klemmer af STS-En enhed langs den anterior-posterior akse af dyret i den forberedte lommer ledsager laminektomi (Figur 1). De to klemmer bør anbringes i en vinkel på ~ 45 ° i forhold til dyrets Rostro-caudale aksen til at give tilstrækkelig plads til at sænke en vand nedsænkning linse i løbet af de udsatte rygmarven (Figur 1).
  3. Placer den tredje klemme af STS-A enheden ved haleroden, så dyrets krop kan suspenderes i luften efter fjernelse af elevation pad for varigheden af ​​billedbehandling eksperimenter (Figur 1).
  4. Byg en lille brønd Gelseal (Amersham Biosciences Corp) omkring de udsatte rygmarven for at lette vedligeholdelse af rygmarven i ACSF og fordybelse af mikroskopet linse i denne løsning for in vivo billeddannelse.
jove_title "> 4. In vivo imaging af musen rygmarven med to-foton mikroskopi

  1. Transfer dyret på spinal stabilisering enhed inde i forvarmet kammeret dækker mikroskopet og sikre det på en sænket mikroskop stadium placere laminektomi lige under linsen (Figur 1).
  2. Lavere en vand-nedsænkning linsen forsigtigt ind i ACSF løsning, og sørg for, at det ikke rører spinal klemmer eller Gelseal.
  3. Brug epifluorescence at identificere område af interesse og fokus på det. Skift til laserscanning tilstand og udføre in vivo imaging ved hjælp af relevante to-foton laser excitation bølgelængde, dichroics og bandpass filtre til fluorophores stede i filmede væv.

5. Gentagne billedbehandling og postoperativ pleje

  1. I slutningen af ​​imaging eksperimenter, skal du fjerne musen fra spinal stabilisering enheden og forsigtigt tørre Gelseal fra området omkring laminektomi.Rens området godt.
  2. Genoprette og sutur af rygmuskler over laminektomi.
  3. Genoprette og sutur i huden over laminektomi, vatpind det med betadine.
  4. Give 1 ml Ringer opløsning (Baxter Healthcare) som et næringsstof og hydrering supplere, samt smertestillende behandling subkutant (0,1 mg / kg buprenorphin).
  5. Administrere antiseptisk behandling intraperitonealt (0,03 ml pr mus, 2,27% enrofloxacin injicerbar antibakterielle løsning).
  6. Placer dyr på en varmepude indtil fuld genopretning af bedøvelse og efterfølgende hus det individuelt.
  7. Gentag antiseptisk administration dagligt i de første 3-5 dage efter operationen og smertestillende behandling hver 8-12 timer i 2-3 dage postoperativt. Overvåg dyret dagligt for at sikre normal adfærd og fuld helbredelse.
  8. For re-imaging gennem den samme laminektomi, genåbne sutureres hud og muskler, og gentag trinene beskrevet i § § 2 - 4.
  9. Re-lokalisere det foregående regnskabsårgere filmede område ved hjælp af blod kar så et kort, som tidligere beskrevet 10.

6. Repræsentative resultater

Alle animalske procedurer blev udført under de retningslinjer, som institutionelle Animal Care og Brug udvalg ved University of California, San Francisco og er i overensstemmelse med føderale regler. Et billede af spinal stabilisering enhed og en skematisk viser placeringen af ​​en mus på enheden under et mikroskop linse er vist i figur 1. Tillade tilstrækkelig plads til at trække vejret bevægelser under dyrets krop sikrer en stabil in vivo imaging i rygmarven. Figur 2 viser det tætte forhold mellem mikroglia og kar, som det var afbildet in vivo i rygmarv fra Cx3cr1 GFP / + transgene mus 18, hvor mikroglia er endogent mærket med GFP. Figur 3 viser eksempler på gentagnein vivo imaging, som det blev udført i samme rygmarven områder i mus udtrykker et fluorescerende protein i spinal axoner (YFP-H linje 3) og mikroglia (i Cx3cr1 GFP / + mus).

Figur 1
Figur 1. Stabilisering af musen rygsøjlen til in vivo imaging ved hjælp af to-foton mikroskopi. (A) en custom-made stål grundplade bruges til at støtte og tilpasse STS-A Narishige kompakt rygmarven skruetvinger og MA-6N Narishige hoved at holde adapteren som vist her. (B) Korrekt positionering af voksne transgene mus bedøvet med en KXA bedøvelse på spinal stabilisering enhed. Indsatsen viser placeringen af ​​spinal klemmer straks rostrally og caudally til laminektomi de udsatte rygmarven væv.

<img alt = "Figur 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" />
Figur 2. In vivo imaging af high density microglial celler og blodkar i rygmarven på bedøvede mus. Forventede men alliancefri z-stakke af (A) meget tæt GFP-positive mikroglia (grøn) i rygmarven af en CX3CR1 GFP / + mus i tæt nærhed med blodkar (røde, mærket med iv injektion af rhodamine dextran). (B) Høj forstørrelse billede mærket som i (A) af en enkelt microglial celle fastgjort til væggen i et blodkar med processer forlænget rundt om skibet og mod rygmarven parenkym. Skala barer, 10μm.

Figur 3
Figur 3. Gentagne in vivo imaging af samme axonal segmenter og mikroglia som de var flyttet og reimaged i rygmarven på bedøvede mus på forskellige dage. (A) YFP-lab drejes frem og tilbage axoner på dag 0 og 5. (B). Det samme vaskulære strukturer og microglial celler omkring dem filmede in vivo i rygmarv fra Cx3cr1 GFP / + mus på dag 0 og 1. Skala barer, 10μm.

Movie 1. Repræsentant timelapse-sekvens erhvervet in vivo fra musen rygmarven. Denne sekvens viser i detaljer fine microglial proces dynamik (grøn) og deres interaktion med vaskulaturen (rød, mærket med iv injektion af rhodamine dextran) over tid inden for en vævet tæt befolket med fluorescerende strukturer. De rå billeder blev der kun korrigeret for baggrundsstøj, lysstyrke og kontrast, og timelapse filmen blev bygget af Z-projicere sekventielt erhvervet Billedstakke, uden at billedet justering, prisudligning eller z-udvælgelse af de enkelte fly. Blodkar gå igennem en lignende række af z planer som billeder af mikroglia. Z fly dybde: 38 μm.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Klik her for at se filmen.

Movie 2. Timelapse sekvens viser den rå stabilitet billeddiagnostiske metode på niveau med en enkelt z-plan. Hurtig overtagelse af den samme enkelte z-fly i rygmarv fra CX3CR1 GFP / + mus placeres på spinal stabilisering enheden under KXA anæstesi, viser minimal billedet forskydning mellem hinanden følgende frames med en scanning hastighed på 1 frame / s, der er hurtigere end den vejrtrækning med musen. De mindre resterende forskydning skyldes formentlig, at hjerteslag. Klik her for at se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her giver mulighed for stabile og gentagne in vivo billeddannelse af tætbefolkede fluorescerende cellulære strukturer i rygmarv fra bedøvet mus ved hjælp af to-foton mikroskopi. Den opnåede stabilitet er et resultat af et skræddersyet spinal stabilisering enhed og anæstesiregimet, som reducerer åndedræts-induceret bevægelse artefakt. Det spinal stabilisering enhed giver pusterum under musen kroppen og kan opbygges ved hjælp af kommercielt tilgængelige spinal klemmer og hoved montering stykke (fig. 1). Metoden er meget reproducerbar, minimalt invasive og konsekvent genererer rådata, der kan bruges til forsøg analyser uden omfattende billede efterbehandling (Fig.2 og video 1). Denne teknik kan derfor bruges til undersøgelser af celle-celle interaktioner i den overflod af kommercielt tilgængelige fluorescerende mus linier (Fig. 1-3 og Video 1). Denne metode kan løse ikke kun tætbefolkede cellulære strukturer, men enLSO hurtigt forekommende cellulære funktioner eller reaktioner (Videoer 1, 2). For eksempel kan det bruges til at måler kvantitativt microglial proces dynamik over tid samt distance under kemotaktiske adfærd. Kvantificering kan udføres som vi tidligere har beskrevet for billeddannelse microglial reaktioner i den levende hjerne 8. Desuden kan det bruges i kombination med andre eksperimentelle metoder såsom anvendelse af fluorescens-mærkede mikrosfærer at måle microglial fagocytose i rygmarven in vivo.

Evnen til at udføre gentagne in vivo billeddannelse af nøjagtig samme område i rygmarven af de samme dyr på forskellige dage kan studere udviklingen af biologiske fænomener og dissektion af den sekvens af begivenheder, der kan for eksempel være involveret i udviklingen af sygdom . Succesfuld anvendelse af denne metode til forløbsundersøgelser afhængig af tilgængeligheden af ​​væv pejlemærker for pålideligedygtigt flytter de områder, der tidligere var afbildet. Dette skal tages i betragtning ved især for rygmarvsskader studier. For eksempel i nogle af de almindeligt anvendte rygmarvsskade modeller som rygmarven kontusion eller dorsal hemisection den massive nekrotisk læsion, som bliver genereret i epicentret af årsager til skade betydelig aksonal og vaskulære omlægning, der kan hæmme flytningen af ​​den tidligere filmede området. Dette kan løses ved enten at udføre gentagne in vivo imaging ved læsion kanten eller ved at vælge en skade model, der forårsager en målrettet, mindre læsion, såsom tynd nål transection model 19.

Metoden er beskrevet her udstiller en lille del af rygmarven, ved at udføre en enkelt laminektomi over målet imaging-området. Den underliggende dura Sagen er blevet efterladt intakt hvor det er muligt. Dette sikrer minimal forstyrrelse af filmede vævet under hjernehinden og minimerer de afholdte skadetil dyrets ryg. Den samlede stabilisering Ordningen kan nemt tilpasses til billede enten gennem interlaminar rummet uden at udføre en laminektomi 20 eller gennem flere seriel laminectomies, hvis en mindre eller en større billedbehandling vindue foretrækkes for en given undersøgelse hhv.

Som er fælles med de fleste in vivo teknik, kan de resultater, der opnås ved at bruge denne in vivo imaging-metoden i høj grad afhængig af brugen af korrekt bedøvelse. Den KXA bedøvelse mix, der er anbefalet her har også været brugt inden for billedbehandling studier af forskellige væv, før 21-24 og blev valgt udelukkende baseret på dets evne til at reducere vejrtrækning bevægelser. Andre bedøvelse tilgange kan frembringe sammenlignelige resultater til denne KXA mix.

Rygmarven imaging teknik, som beskrevet i denne protokol giver et kraftfuldt værktøj til rygmarven forskning, da evnen til at registrere celle-celle interaktioner i virkelige tIME høj grad kan lette in vivo studier af rygmarven i fysiologi og patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Scleroseforeningen give RG4595A1 / T til DD og NIH / NINDS stipendier NS051470, NS052189 og NS066361 til KA Tal og film tilpasset og / eller genoptrykt fra Davalos et al., J Neurosci Metoder. 2008 Marts 30, 169 (1) :1-7 Copyright 2008, med tilladelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhodamine B dextran Invitrogen D1841 70 kDa, diluted in
ACSF (3% w/v)
Ketamine HCl Bioniche Pharma NDC No: 67457-001-10 Injectable, 50mg/ml
Anased Lloyd, Inc. NADA No: 139-236 Xylazine injectable,
20mg/ml
Acepromazine Vedco, Inc. NADA No: 117-531 Injectable,10mg/ml
Artificial tears ointment Phoenix Pharmaceuticals, Inc. NDC No: 57319-760- 25 Lubricant
Betadine Fisher Scientific 19-061617
McPherson-Westcott Scissors World Precision Instruments, Inc. 555500S Curved, blunt-tipscissors
Straight Forceps World Precision Instruments, Inc. 555047FT Toothed tip forceps
Small vessel cauterize Fine Science Tools 18000-00
Gelfoam Pharmacia Corporation (Pfizer) Mixer Mill MM400
Compact spinal cord clamps Narishige International STS-A
Head holding adaptor Narishige International MA-6N
Gelseal Amersham 80-6421-43
Lactated Ringers Baxter Internationl Inc. 2B8609
Buprenex Reckitt Benckiser NDC No: 12496- 6757-1 Buprenorphine,injectable
Baytril Bayer AG NADA 140-913 Enrofloxacin,
antibacterial injectable
2.27% (20ml)
Heating pad - Large Fine Science Tools 21060-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  2. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  3. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  4. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
  5. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
  6. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
  7. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  8. Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  9. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  10. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
  11. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
  12. Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  13. Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
  14. Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
  15. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  17. Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
  18. Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  19. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
  20. Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
  21. Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
  22. Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
  23. Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
  24. Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).

Tags

Neurovidenskab Rygmarv billedbehandling, axoner mikroglia blodkar
<em>In vivo</em> imaging af Mouse Spinal Cord ved hjælp af to-foton mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davalos, D., Akassoglou, K. In… More

Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (59), e2760, doi:10.3791/2760 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter