Summary
Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren repetitieve
Abstract
In vivo beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie 1 in muizen die genetisch zijn gemanipuleerd om fluorescerende eiwitten uit te drukken in specifieke celtypen 2-3 aanzienlijk verbreed onze kennis van fysiologische en pathologische processen in een groot aantal weefsels in vivo 4-7. In studies van het centrale zenuwstelsel (CZS), is er sprake van een brede toepassing van in vivo beeldvorming in de hersenen, die heeft geleid tot een overvloed aan nieuwe en vaak onverwachte bevindingen over het gedrag van cellen zoals neuronen, astrocyten, microglia, onder fysiologische of pathologische condities 8-17. Echter, veelal technische complicaties beperkt de uitvoering van de in vivo beeldvorming in studies van de levende muis ruggenmerg. In het bijzonder, de anatomische nabijheid van het ruggenmerg naar de longen en het hart genereert belangrijke beweging artefact dat maakt beeldvorming van de woonkamer ruggenmerg een uitdagende taak. We ontwikkelden een nieuwe methode die de inherente beperkingen van het ruggenmerg imaging overwint door het stabiliseren van de wervelkolom, waardoor de luchtwegen veroorzaakte bewegingen te creëren, waardoor het gebruik van twee-foton microscopie aan het imago van de muis ruggenmerg in vivo. Dit wordt bereikt door het combineren van een op maat gemaakte spinale stabilisatie-apparaat met een methode van diepe verdoving, wat resulteert in een significante vermindering van de luchtwegen veroorzaakte bewegingen. Deze video laat zien hoe protocol aan de kaak een klein gebied van de levende ruggenmerg die kan worden gehandhaafd onder stabiele fysiologische omstandigheden gedurende langere tijd door het houden van weefselbeschadiging en bloeden tot een minimum. Vertegenwoordiger van RAW-afbeeldingen verworven in vivo detail in hoge resolutie de nauwe relatie tussen microglia en de bloedvaten. Een timelapse sequentie toont het dynamisch gedrag van microglia processen in de levende muis ruggenmerg. Bovendien is een continu scannen van dezelfde z-frame aan te tonens de uitstekende stabiliteit die deze methode kan bereiken stapels van beelden en / of timelapse films die niet nodig beelduitlijning na de overname te genereren. Tot slot laten we zien hoe deze methode gebruikt kan worden om opnieuw en Reimage hetzelfde gebied van het ruggenmerg op latere tijdstippen, waardoor voor longitudinale studies van lopende fysiologische of pathologische processen in vivo.
Protocol
1. Het bouwen van de spinale stabilisatie-apparaat
- Bestel de Narishige STS-A Compact Spinal Cord klemmen en de Narishige MA-6N head holding adapter.
- Op maat ontwerpen en maken een roestvrij stalen bodemplaat om de twee delen Narishige te houden op een lijn, zodat het dier het hoofd wordt ondersteund, terwijl de wervelkolom en de staart zijn geklemd. Houd er rekening mee dat het gehele apparaat moet onder de microscoop lens past meestal op een verlaagd microscoop podium.
2. Dier een operatie
- Verwarm de microscoop kamer met een luchtverwarming apparaat en handhaven bij 37 ° C.
- Weeg het dier en maken het verdovingsmiddel mix met 100 mg ketamine, 15 mg en 2,5 mg xylazine acepromazine per kg lichaamsgewicht, verdund in 0,9% NaCl-oplossing onder steriele omstandigheden.
- Verdoven van het dier door het inspuiten van de verdoving mix (KXA) intraperitoneaal. Regelmatig teen knijpen dient te worden uitgevoerd tot diep in de gehele narcosehet experiment. Te vullen met de helft van de oorspronkelijke dosis per uur of als dat nodig is.
- Gebruik een klein dier verwarming pad om thermische ondersteuning te bieden tijdens het uitvoeren van de chirurgische procedure.
- Pas kunstmatige tranen zalf op de ogen corneale uitdroging en beschadiging te voorkomen.
- Eerste scheerbeurt de rug van het dier met een trimmen apparaat en vervolgens met een scherp mes om volledig haar te verwijderen uit het gebied rond de incisie.
- Verwijder de haren geschoren en ontsmet de geschoren huid oppervlak met een alcoholdoekje.
- Voer een klein (~ 1,5 cm) longitudinale incisie van de huid over het gewenste niveau van de wervelkolom (borstwervels hier afgebeeld).
- Expose de rugspieren door voorzichtig het terugtrekken van de onderhuidse bindweefsel.
- Haal voorzichtig het paravertebrale spieren van de wervelkolom op het gewenste niveau. Voer zo min mogelijk incisies om de spieren los te maken van beide zijden van elke processus spinosus en vervolgens de vrijstaande spieren schrapen eenweg van de laminaire oppervlak.
- Kies de lamina dat wordt verwijderd en de voorbereiding van de plaatsen van binnenkomst voor de spinale klemmen aan weerszijden van de wervelkolom, onmiddellijk rostraal en caudaal van de laminectomie. Voorzichtig verplaatsen spierweefsel tot vier zakken waar de klemmen wordt ingevoegd maken.
- Til de wervelkolom met de rechte vertanding-tip een tang om een veilige plaatsing van de gebogen stompe-tip schaar onder de lamina toe zonder het aanraken van het ruggenmerg. Voer de laminectomie door langzaam te snijden op het bot aan de ene kant en daarna aan de andere kant.
- Gebruik een wattenstaafje of voeg voorgesneden kleine gelfoam absorbeerbare gelatine spons stukken naast de incisies om kleine bloeden te beperken. Gebruik een klein schip cauterizer verder te bloeden onder controle te indien nodig. Gebruik voorverwarmde steriele kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) om weefsel te wassen.
3. Stabilisatie van de wervelkolom en de voorbereiding voor in vivo beeldvorming
- Plac e het dier op een hoogte pad op de bodemplaat van de spinale stabilisatie-apparaat en zet de kop in het hoofd holding adapter.
- Plaats de spinale klemmen van de STS-A-apparaat langs de anterior-posterior as van het dier in de pre-en-klare zakken aan weerszijden van de laminectomie (figuur 1). De twee klemmen moet worden geplaatst onder een hoek van ~ 45 ° ten opzichte van rostro-caudale het dier as voldoende ruimte laten voor het verlagen van een onderdompeling in water lens over het blootliggende ruggenmerg (figuur 1).
- Leg de derde klem van de STS-A-apparaat aan de basis van de staart, zodat het dier het lichaam kan worden opgeschort in de lucht na verwijdering van de hoogte pad voor de duur van de imaging experimenten (figuur 1).
- Bouwen van een kleine bron van Gelseal (Amersham Biosciences Corp) rond de blootgestelde ruggenmerg naar het onderhoud van het ruggenmerg in ACSF en de onderdompeling van de microscoop lens in deze oplossing voor in vivo beeldvorming te vergemakkelijken.
- Breng het dier op de spinale stabilisatie-apparaat in de voorverwarmde kamer met betrekking tot de microscoop en zet het op een verlaagde microscoop podium plaatsen van de laminectomie recht onder de lens (zie figuur 1).
- Voorzichtig lager een water-onderdompeling lens in de ACSF oplossing ervoor te zorgen dat het niet de ruggengraat klemmen of de Gelseal raken.
- Gebruik epifluorescentie het gebied van interesse te identificeren en op te richten. Schakel over naar laser scanning mode en uit te voeren in vivo beeldvorming met behulp van de juiste twee-foton laser excitatie golflengte, koudlichtspiegel en bandpass filters voor de fluoroforen aanwezig in het verbeelde weefsel.
5. Repetitive beeldvorming en post-operatieve zorg
- Aan het einde van imaging experimenten, verwijder de muis van de spinale stabilisatie apparaat en zorgvuldig de Gelseal veeg uit het gebied rond de laminectomie.Reinig het gebied goed.
- Te herstellen en hechtdraad de rugspieren over de laminectomie.
- Te herstellen en hechtdraad de huid over de laminectomie, wattenstaafje met betadine.
- Zorg voor een ml Ringers lactaat oplossing (Baxter Healthcare) als een nutriënt en hydratatie aan te vullen, evenals pijnstillende behandeling subcutaan (0,1 mg / kg buprenorfine).
- Dien antiseptische behandeling intraperitoneaal (0,03 ml per muis, 2,27% enrofloxacine injecteerbare antibacteriële oplossing).
- Plaats dier op een verwarmingselement tot volledig herstel van de anesthesie en vervolgens individueel huis is.
- Dagelijks herhalen antiseptische administratie voor de eerste 3-5 dagen na de operatie en pijnstillende behandeling om de 8-12 uur gedurende 2-3 dagen post-operatief. Dagelijks te controleren dier om normaal gedrag en volledig herstel te verzekeren.
- Voor de re-imaging via dezelfde laminectomie, de heropening van de gehechte huid en spieren en herhaal de stappen die worden beschreven in de punten 2 - 4.
- Opnieuw vinden het vorige boekjaarously beeld gebracht gebied met behulp van het bloed vaatstelsel als een kaart, zoals eerder beschreven 10.
6. Representatieve resultaten
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die door institutionele Animal Care en gebruik Commissies aan de Universiteit van Californië, San Francisco en zijn in overeenstemming met landelijke richtlijnen. Een foto van de spinale stabilisatie-apparaat en een schematische weergave van de positionering van een muis op het apparaat onder een microscoop lens is weergegeven in figuur 1. Het toestaan van voldoende ruimte voor de ademhaling bewegingen onder het lichaam van het dier zorgt voor stabiel in vivo beeldvorming in het ruggenmerg. Figuur 2 toont de nauwe relatie tussen microglia en de bloedvaten zoals het was afgebeeld in vivo in het ruggenmerg van Cx3cr1 GFP / + transgene muizen 18, waarin de microglia zijn endogeen aangeduid met GFP. figuur 3 laat voorbeelden zien van repetitievein vivo beeldvorming als het was uitgevoerd in hetzelfde ruggenmerg gebieden in muizen die een fluorescerend eiwit in de wervelkolom axonen (YFP-H lijn 3) en microglia (in de Cx3cr1 GFP / + muizen).
Figuur 1. Stabilisatie van de wervelkolom muis voor in vivo beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie. (A) Een op maat gemaakte stalen bodemplaat wordt gebruikt ter ondersteuning en uitlijnen van de STS-A Narishige compacte ruggenmerg klemmen en de MA-6 N Narishige hoofd houden adapter zoals hier te zien. (B) De juiste plaatsing van volwassen transgene muizen verdoofd met een verdovingsmiddel KXA op de spinale stabilisatie-apparaat. De insert geeft de plaatsing van de wervelkolom klemmen onmiddellijk rostraal en caudaal aan de laminectomie en de blootgestelde ruggenmergweefsel.
<img alt = "Figuur 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" />
Figuur 2. In vivo beeldvorming van hoge dichtheid microgliale cellen en bloedvaten in het ruggenmerg van verdoofde muizen. Verwachte maar niet-gebonden z-stapels (A) zeer dichte GFP-positieve microglia (groen) in het ruggenmerg van een CX3CR1 GFP / + muis in de buurt met de bloedvaten (rood, gelabeld met iv injectie van rhodamine dextran). (B) High vergroting afbeelding gelabeld als in (A) van een enkele cel microgliale bevestigd aan de wand van een bloedvat met processen uitgebreid rond het schip en de richting van het ruggenmerg parenchym. Schaal van bars, 10μm.
Figuur 3. Repetitive in vivo beeldvorming van dezelfde axonale segmenten en microglia zoals ze waren verplaatst en reimaged in het ruggenmerg van de verdoofde muizen op verschillende dagen. (A) YFP-lab eLED axonen op dag 0 en 5. (B). Dezelfde vasculaire structuren en microgliacellen om hen heen afgebeeld in vivo in het ruggenmerg van Cx3cr1 GFP / + muizen op dag 0 en 1. Schaal van bars, 10μm.
Film 1. Vertegenwoordiger timelapse volgorde verworven in vivo van de muis ruggenmerg. Deze volgorde toont in detail fijn microgliacellen procesdynamica (groen) en hun interacties met het vaatstelsel (rood, gelabeld met een iv injectie van rhodamine dextran) na verloop van tijd in een tissue dichtbevolkt met fluorescerende structuren. De ruwe beelden zijn alleen gecorrigeerd voor achtergrondgeluid, helderheid en het contrast en de timelapse film werd gebouwd door het projecteren van z-volgorde opgenomen beelden, zonder beeld uitlijning, middeling of z-selectie van individuele vliegtuigen. Bloedvaten gaan door een vergelijkbare reeks van z vliegtuigen als de beelden van microglia. Z-vlak diepte: 38 micrometer.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Klik hier om de film te bekijken.
Movie 2. Timelapse volgorde tonen de rauwe stabiliteit van de imaging-methode op het niveau van een enkele z-vlak. Een snelle verwerving van datzelfde single z-vlak in het ruggenmerg van CX3CR1 GFP / + muizen op de spinale stabilisatie apparaat onder KXA verdoving, toont een minimale image verplaatsing tussen opeenvolgende frames met een scansnelheid van 1 frame / s die sneller is dan de ademhalingsfrequentie van de muis. De minor resterende verplaatsing is waarschijnlijk te wijten aan hartslag. Klik hier om de film te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele en repetitieve in vivo beeldvorming van dichtbevolkte TL-cellulaire structuren in het ruggenmerg van verdoofde muizen met behulp van twee-foton microscopie. De bereikte stabiliteit is een gevolg van een custom-made spinale stabilisatie-apparaat en een verdovingsmiddel regime dat de luchtwegen veroorzaakte beweging artefact vermindert. De spinale stabilisatie-apparaat laat ademen ruimte onder de muis lichaam en kan worden gebouwd met behulp van commercieel verkrijgbare spinale klemmen en hoofd montage stuk (fig. 1). De methode is zeer reproduceerbaar, minimaal invasieve en consistent genereert ruwe data die voor experimentele analyses gebruikt worden zonder uitgebreide image post-processing (Fig.2 en Video 1). Deze techniek kan dus worden gebruikt voor onderzoek van cel-cel interacties in de overvloed van commercieel verkrijgbare tl-muis-lijnen (figuren 1-3 en Video 1). Deze methode kan oplossen, niet alleen dichtbevolkt celstructuren, maar eenlso snel optredende cellulaire functies of reacties (Video's 1, 2). Bijvoorbeeld, kan het gebruikt worden om kwantitatief microgliale procesdynamica meten over de tijd en afgelegde afstand tijdens de chemotactische gedrag. Kwantificering kan worden uitgevoerd zoals we eerder beschreven voor beeldvorming microgliale reacties in het levende brein 8. Bovendien kan het gebruikt worden in combinatie met andere experimentele benaderingen, zoals het gebruik van fluorescent gelabelde microsferen te microgliale fagocytose te meten in het ruggenmerg in vivo.
De mogelijkheid om repetitieve presteren in vivo beeldvorming van het exact hetzelfde gebied in het ruggenmerg van dezelfde dieren op verschillende dagen kan het bestuderen van de progressie van biologische verschijnselen en de versnijding van de opeenvolging van gebeurtenissen die kunnen bijvoorbeeld worden betrokken bij de ontwikkeling van de ziekte . Succesvolle toepassing van deze methode voor longitudinale studies is afhankelijk van de beschikbaarheid van het weefsel oriëntatiepunten voor de betrouwkundig verplaatsen van de gebieden die voorheen werden afgebeeld. Dit moet rekening worden gehouden met name voor dwarslaesie studies. Bijvoorbeeld in een aantal van de veel gebruikte dwarslaesie modellen, zoals het ruggenmerg kneuzing of dorsale hemisectie de massale necrotische laesie die wordt gegenereerd in het epicentrum van het letsel veroorzaakt aanzienlijke axonale en vasculaire herschikking dat verplaatsing van de eerder afgebeeld gebied zouden kunnen belemmeren. Dit kan worden ondervangen door ofwel het uitvoeren van repetitieve in vivo beeldvorming aan de laesie rand of door het selecteren van een blessure-model dat een gerichte, kleinere laesie oorzaken, zoals de dunne naald doorsnijding model 19.
De hier beschreven methode onthult een klein segment van het ruggenmerg, door het uitvoeren van een enkele laminectomie over het doel beeldvorming gebied. De onderliggende dura zaak is intact gelaten waar mogelijk. Dit zorgt voor een minimale verstoring van de verbeelde weefsel onder de hersenvliezen en minimaliseert de gemaakte letselom het dier wervelkolom. De algemene stabilisering regeling kan eenvoudig worden aangepast om de afbeelding, hetzij door de interlaminaire ruimte zonder het uitvoeren van een laminectomie 20 of door middel van meerdere seriële laminectomies als een kleiner of een groter imaging window is de voorkeur voor een bepaalde studie respectievelijk.
Zoals gebruikelijk is bij de meeste in vivo technieken, kunnen de resultaten verkregen door het gebruik van deze in vivo imaging methode sterk afhankelijk van het gebruik van de juiste anesthesie. De KXA verdoving mix die hier is aan te bevelen is ook gebruikt in de beeldvorming studies van verschillende weefsels voor de 21-24 en was alleen geselecteerd op basis van zijn vermogen om aanzienlijk te verminderen ademhalingsbewegingen. Andere anesthetica aanpak kan leiden tot vergelijkbare resultaten van deze KXA mix.
Het ruggenmerg beeldvormende techniek beschreven in dit protocol biedt een krachtig instrument voor het ruggenmerg onderzoek, omdat de mogelijkheid om op te nemen cel-cel interacties in real-time kunnen zeer bevorderlijk zijn in vivo studies van het ruggenmerg in de fysiologie en pathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society verlenen RG4595A1 / T naar DD en de NIH / NINDS beurzen NS051470, NS052189 en NS066361 naar KA figuren en films aangepast en / of overgenomen uit Davalos et al.., J Neurosci Methods. 30 maart 2008, 169 (1) :1-7 Copyright 2008, met toestemming van Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubricant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Curved, blunt-tipscissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps | Narishige International | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorphine,injectable |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad - Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
