Summary
علينا أن نظهر في شريط الفيديو وسيلة لإنتاج وسط انسداد الشريان الدماغي في فئران بالغة باستخدام حيدة داخل اللمعة. علينا أن نبين كيفية تقييم مدى احتشاء الدماغ بواسطة 2،3،5 - triphenyltetrazolium تلطيخ (TTC) كلوريد.
Abstract
السكتة الدماغية هي الأكثر شيوعا مرض عصبي قاتل في الولايات المتحدة (1). الغالبية من السكتات الدماغية (88 ٪) نتيجة انسداد الأوعية الدموية في الدماغ (السكتة الدماغية) 2. منذ السكتات الدماغية أكثر (~ 80 ٪) تحدث في أراضي الشريان الدماغي الأوسط (MCA) 3 ، وركزت العديد من النماذج الحيوانية السكتة الدماغية التي تم وضعها على هذا الشريان. نموذج حيدة داخل اللمعة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) ينطوي على ادراج خيوط جراحية في الشريان السباتي الخارجي والترابط إلى الأمام في الشريان السباتي الداخلي (ICA) حتى غيض occludes أصل MCA ، مما أدى إلى وقف تدفق الدم واحتشاء الدماغ لاحقة في 4 أراضي MCA. ويمكن استخدام هذه التقنية لنموذج إطباق دائمة أو عابرة 5. إذا تمت إزالة خياطة بعد فترة معينة (30 دقيقة ، ح 1 ، ح أو 2) ، ويتحقق ضخه (MCAO عابرة) ، وإذا ترك خيوط في مكانه (24 ساعة) الإجراء هو مناسبة كنموذج للMCAO دائمة . هذه التقنية لا تتطلب قطع القحف ، وهو إجراء جراحة الأعصاب لإزالة جزء من الجمجمة ، والتي قد تؤثر على الضغط داخل الجمجمة ، ودرجة الحرارة 6. أصبح الأسلوب الأكثر استخداما لتقليد دائم ونقص تروية دماغية عابر التنسيق في الجرذان والفئران 7،8. لتقييم مدى احتشاء دماغي ، ونحن وصمة عار شرائح الدماغ مع 2،3،5 - triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) لتحديد نقص تروية أنسجة المخ 9. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح طريقة MCAO وتحديد حجم احتشاء بواسطة تلطيخ TTC.
Protocol
1. أسلوب MCAO
وتمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدم في سان فرانسيسكو وجامعة كينت الدولة ، وتلتزم المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لاستخدام حيوانات التجارب.
- قطع خياطة حيدة 5-0 (جهاز هارفارد ، Holliston ، MA) في 20 قطاعات ملم. جولة غيض من كل قطعة بتسخينه بالقرب من cauterizer (برينتري العلمية ، وشركة ، برينتري ، MA). قياس قطرها من طرف باستخدام ميكرومتر (صورة التطبيقية ، وشركة روتشستر ، نيويورك). نستخدم خياطة مع قطر الحافة النهائية لل0،21-0،22 مم للماوس مع وزن الجسم من 25-30 غرام.
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية بواسطة التعقيم (الحد الأدنى 121 درجة مئوية ، 15 PSI ، لمدة 15 دقيقة). تعقيم طاولة الجراحة والمعدات المرتبطة باستخدام الايثانول 70 ٪.
- تخدير an 8-12 أسبوع من العمر الماوس (25-30 ز) مع 5 ٪ isoflurane (Aerrane ، باكستر ، ديرفيلد ، IL) في 30 ٪ O 2 / 70 ٪ N 2 O باستخدام نظام V - 10 التخدير (VetEquip ، المؤتمر الوطني العراقي . ، بليزانتون ، كاليفورنيا). بعد التخدير ، وخفض مستوى isoflurane والحفاظ عليه عند 1.5 ٪.
- ضع الماوس في موقف ضعيف على وسادة التدفئة. ادخال مسبار المستقيم ، ورصد والمحافظة على درجة حرارة الجسم بين 36،5-37،5 درجة مئوية باستخدام نظام TR - 200 درجة حرارة homeothermic (العلوم أدوات الجميلة ، وشركة فوستر سيتي ، كاليفورنيا).
- حلق الفراء على منطقة الرقبة بطني مع كليبرز الكهربائية (برينتري العلمية) لفضح الجلد. تطهير الموقع الجراحية باستخدام ثلاثة طلبات من الايثانول 70 ٪.
- تحت المجهر ستيريو تشريح (نيكون ، اليابان) ، وجعل خط الوسط 1 سم شق طويل على الرقبة. استخدام الكامشات (برينتري العلمية) لفضح الجراحي الميداني والتعرف على حق الشريان السباتي المشترك (CCA) ، الشريان السباتي الخارجي (ECA) ، والشريان السباتي الداخلي (ICA). تشريح بعناية الشرايين خالية من الأعصاب المحيطة واللفافة.
- تشريح اللجنة الاقتصادية لأفريقيا بشكل أقصى زيادة تخثر واللجنة الاقتصادية لأفريقيا في الغدة الدرقية والشريان متفوقة (STA) فرع باستخدام مخثار القطبين (هوارد الصك ، وشركة توسكالوسا ، AL). اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وخفض STA في الجزء متخثر.
- ربط خيوط الحرير two فضفاضة حول الجذع 8-0 اللجنة الاقتصادية لأفريقيا. تطبيق المشبك الأوعية الدموية (أدوات العلوم الجميلة) في التشعب من التقييم القطري المشترك في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا والتحالف.
- إجراء شق صغير في نهاية الجذع اللجنة الاقتصادية لأفريقيا مع مقص الربيع Vannas على غرار (أدوات العلوم الجميلة). وسجل قياس طول الخيط حيدة 5-0 مدورة على الحافة. تضاف الى خياطة الفتحة وتقدم إلى المشبك. تشديد خيوط الحرير two حول تجويف ما يكفي لضمان الحفاظ على بعد التنقل من الدرز حيدة داخل المسكن.
- إزالة المشبك من التشعب. تقدم بلطف خياطة حيدة من التجويف للجنة الاقتصادية لأفريقيا في ICA لمسافة 9-10 ملم وراء انشعاب CCA لتسد أصل MCA. مدة الجراحة حوالي 30-45 دقيقة.
- خياطة الفتحة على الرقبة ووضع الماوس في مربع 35 درجة مئوية التمريض للتعافي من التخدير ، وإعادته إلى القفص. يستغرق عادة 50-10 دقيقة للفئران للتعافي من التخدير. لأداء MCAO عابرة ، يمكن للباحث إعادة تخدير الماوس وسحب الخيط مرة أخرى إلى اللجنة الاقتصادية لأفريقيا جدعة بعد فترة من الزمن ، عادة ما بين 0،5-2 ساعة.
- أربع وعشرين ساعة بعد تحريض MCAO ، تخدير الفأر مع 5 ٪ isoflurane والموت ببطء من قبل خلع عنق الرحم. قطع رأس الفأر وجمع الدماغ. شريحة الدماغ coronally إلى شرائح 2 ملم الأربع مع مصفوفة الدماغ (برينتري العلمية) على الجليد. احتضان شرائح الدماغ في 2 ٪ 2،3،5 - triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) (سيغما الدريخ) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة 1X في درجة حرارة الغرفة لتحديد حجم ومدى احتشاء. إصلاح شرائح المخ في 10 ٪ محايدة مخزنة حل الفورمالين (سيغما الدريخ) في 4 درجات مئوية حتى التصوير. ويمكن قياس مدى احتشاء كما هو موضح في البروتوكول إن الرب 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=955 ) 9.
2. ممثل النتائج
وينظر للعوائق التي تولدها MCAO في المخطط والقشرة ظهراني. والمخطط هو أكثر حساسية لنقص تروية من القشرة الدماغية. وثلاثين دقيقة من إنتاج MCAO احتشاء فقط في المخطط ، بينما أكثر من ساعة واحدة من MCAO سيضر كل من المخطط والقشرة. بعد 24 ساعة MCAO دائمة ، فإن النسبة المئوية الإجمالية احتشاء ~ 40 ± 5 ٪ من الكرة الأرضية ومعدل وفيات بعد الجراحة ~ 10 ٪. استثنينا الفئران من إجراء المزيد من الدراسات إذا يحدث النزيف أثناء الجراحة ، ووقت تشغيل يتجاوز 90 دقيقة ، والفئران فشل في التعافي من التخدير في غضون 15 دقيقة ، أو وجدت نزيف في الدماغ أو شرائح في القاعدة من دائرة ويليس خلال الفحص بعد الوفاة .
61/2761fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
صور الممثل الشكل 1. شرائح الدماغ TTC الملطخة (المستوى الإكليلي 1-4) بعد 24 ساعة من MCAO دائمة. في المعيشة ينخفض إنزيمي الأنسجة TTC بواسطة dehydrogenases لtriphenylformazan - 1،3،5 (TPF) ، وهو أحمر اللون ، بينما في المناطق نخرية يبقى الأبيض بسبب عدم وجود مثل هذا النشاط الأنزيمي. ولذلك ، يمكن تحديد المنطقة التي من احتشاء لونه أبيض بسبب عدم وجود لتحويل TTC TPF. ملاحظة : TTC الحرارة والضوء إلى حد ما غير مستقر حتى المقاطع ملطخة حماية من الحرارة والضوء قدر الإمكان.
Discussion
ويشيع استخدام MCAO في الفئران لنقص تروية الدماغ نموذج التنسيق بين البشر. أصبح استخدام الفئران لدراسات السكتة الدماغية أكثر تواترا بسبب توافر سلالات معدلة وراثيا وخروج المغلوب. هناك بعض التفاصيل الهامة أن نلاحظ في البروتوكول :
- فمن الضروري للحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس أثناء الجراحة وقبل أن يتعافى تماما من التخدير. درجة حرارة الجسم له تأثيرات على مدى احتشاء ؛ انخفاض درجة حرارة الجسم وارتفاع الحرارة يزيد من حجم احتشاء.
- حين فضح وعزل التقييم القطري المشترك واللجنة الاقتصادية لأفريقيا ، وتجنب إلحاق أضرار العصب المبهم في مكان قريب والقصبة الهوائية ، التي يمكن أن تزيد من حجم واستمرارية انخفاض احتشاء.
- أبدا إدراج خياطة حيدة أكثر من 10 ملم تمرير التشعب. ويمكن للخياطة إدراج بعيدا خرم الشريان الدماغي الأمامي ويؤدي إلى نزف في الدماغ. يمكن رأى المقاومة عندما متقدمة حول خياطة 90-10 ملم وراء النقطة التشعب. إذا حدث هذا ، يجب على الباحث وقف التقدم في خياطة الجروح وتأكيد المسافة.
Disclosures
ليس لدينا أية مصالح متضاربة المحتملة في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS057195 ، UCSF راكوشبالوتاي الجائزة ، وجامعة كينت ستيت بدء صندوق لWH تشو.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
