Summary
אנו מדגימים את הוידאו שיטה לייצור באמצע חסימה בעורק המוח בעכברים בוגרים באמצעות monofilament intraluminal. כמו כן, אנו מראים כיצד להעריך את מידת אוטם מוחי על ידי מכתים 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC).
Abstract
שבץ היא מחלה נוירולוגית קטלנית הנפוצה ביותר בארצות הברית 1. רוב מקרי השבץ (88%) כתוצאה חסימה של כלי דם במוח (שבץ איסכמי) 2. מאז שבץ איסכמי ביותר (~ 80%) מתרחשות בשטח של עורק המוח האמצעי (MCA) 3, במודלים של בעלי חיים רבים שבץ שפותחו התמקדו עורק זה. המודל monofilament intraluminal של חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) כרוכה החדרת נימה כירורגית לתוך עורק הצוואר חיצוני להשחיל אותו קדימה לעורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת) עד קצה חוסם את מקורם של MCA, וכתוצאה מכך הפסקת זרימת הדם לבין אוטם מוחי לאחר מכן ב 4 השטח MCA. הטכניקה יכולה לשמש מודל חסימה קבועה או חולפת 5. אם תפר יוסר לאחר פסק זמן מסוים (30 דקות, 1 שעות, או 2 ח), reperfusion מושגת (MCAO חולף); אם הסיב נשאר במקומו (24 שעות) בהליך מתאים כמודל MCAO קבע . טכניקה זו אינה דורשת craniectomy, הליך נוירוכירורגי להסיר חלק בגולגולת, אשר עשויים להשפיע על לחץ תוך גולגולתי והטמפרטורה 6. זה הפך את השיטה הנפוצות ביותר בשימוש לחקות קבע חולף איסכמיה מוחית מוקד חולדות ועכברים 7,8. כדי להעריך את מידת אוטם מוחי, אנו כתם פרוסות המוח עם כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) כדי לזהות רקמות מוח איסכמי 9. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה MCAO וקביעת גודל האוטם על ידי מכתים TTC.
Protocol
1. שיטת MCAO
פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השתמש באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ו קנט סטייט, ולאחר פועלת לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות מעבדה.
- גזור תפר 5-0 monofilament (הרווארד Apparatus, Holliston, MA) לתוך 20 קטעים מ"מ. סיבוב קצה של כל פלח ידי חימום זה ליד cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA). מדוד את הקוטר של קצה באמצעות מיקרומטר (יישומי Image Inc, רוצ'סטר, ניו יורק). אנו משתמשים תפר בקוטר קצה הסופי של 0.21-0.22 מ"מ עבור עכבר עם משקל גוף של 25-30 גרם
- לעקר את כל כלי הניתוח על ידי מעוקר (מינימום 121 ° C, 15 PSI, במשך 15 דקות). לטהר את שולחן הניתוח וציוד נלווה באמצעות אתנול 70%.
- הרדימי 8-12 בן שבוע העכבר (25-30 גרם) עם 5% isoflurane (Aerrane, בקסטר, Deerfield, IL) ב 30% O 2 / 70% N 2 O באמצעות מערכת ה-V-10 הרדמה (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). בעקבות אינדוקציה של הרדמה, להפחית את רמת isoflurane ולתחזק אותו 1.5%.
- מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על משטח חימום. הכנס בדיקה רקטלית, לפקח ולשמור על טמפרטורת הגוף בין 36.5-37.5 מעלות צלזיוס באמצעות TR-200 המערכת טמפרטורה homeothermic (Fine המדע כלים בע"מ, פוסטר סיטי, קליפורניה).
- לגלח את הפרווה שעל באזור הצוואר הגחון עם קוצץ חשמלי (Braintree Scientific) כדי לחשוף את העור. לחטא את האתר כירורגית באמצעות שלושה יישומים של אתנול 70%.
- תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו (ניקון, יפן), לעשות 1 ס"מ חתך קו האמצע ארוך על הצוואר. השתמש retractors (Braintree Scientific) כדי לחשוף את שדה הניתוח ולזהות את עורק התרדמה המשותף הימני (CCA), חיצוני העורק הראשי (ECA), ו פנימי העורק הראשי (רשפ"ת). בזהירות לנתח את העורקים ללא שמסביב עצבים fascia.
- מנתחים את ECA נוסף distally ו להקריש ECA ו עורק התריס מעולה (STA) הסניף באמצעות coagulator דו קוטבית (הווארד כלי Inc, Tuscaloosa, א.ל.). חותכים את ECA ו STA בכל מגזר קרוש.
- Loosely קושרים שתי 8-0 תפרים משי סביב הגדם ECA. החל מהדק וסקולרית (כלי מדעי פיין) בשעה הסתעפות של המרכז לאמנות עכשווית לתוך ECA ו ICA.
- לעשות חתך קטן בסוף ECA גדם עם Vannas בסגנון מספריים באביב (כלים המדע פיין). מדוד ורשום את אורך תפר 5-0 monofilament מעוגלים בקצה. הכנס את תפר את החתך ולהתקדם מהדק. הדקו את שני התפרים משי סביב לומן מספיק כדי לאבטח עדיין לשמר הניידות של תפר ב-המגורים monofilament.
- הסר את מהדק מ הסתעפות. בעדינות לקדם את תפר monofilament מ לומן של ECA לתוך ICA למרחק של 9-10 מ"מ מעבר הסתעפות של המרכז לאמנות עכשווית כדי לחסום את המקור של MCA. משך הניתוח הוא כ - 30-45 דקות.
- תפר את החתך על הצוואר במקום עכבר בתיבת 35 ° C סיעוד להתאושש מן ההרדמה, ולהחזיר אותו לכלוב. זה בדרך כלל לוקח 50-10 דקות עבור העכברים כדי להתאושש מן ההרדמה. כדי לבצע MCAO חולף, החוקר יכול להרדים מחדש את העכבר למשוך את תפר בחזרה גדם של ECA לאחר תקופה מסוימת, בדרך כלל בין 0.5-2 ח
- עשרים וארבע שעות לאחר גיוס של MCAO, להרדים את העכבר עם 5% ו isoflurane להרדים אותו על ידי נקע בצוואר הרחם. לערוף את העכבר לאסוף את המוח. פורסים את המוח coronally לארבע פרוסות 2 מ"מ עם מטריצה המוח (Braintree Scientific) על קרח. דגירה את פרוסות המוח 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) (סיגמא אולדריץ ') ב 1X PBS עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לקבוע את הגודל וההיקף של אוטם. תקן את פרוסות המוח ב -10% ניטרלית שנאגרו פתרון פורמלין (סיגמא אולדריץ ') בשעה 4 ° C עד הדמיה. היקף אוטם ניתן לכמת כמתואר יופיטר פרוטוקול 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9.
2. נציג תוצאות
אוטמים שנוצר על ידי MCAO נראים בסטריאטום ואת קליפת דורסולטרלי. הסטריאטום הוא רגיש יותר לאיסכמיה מאשר בקליפת המוח. שלושים דקות של MCAO יפיק האוטם רק בסטריאטום, בעוד יותר משעה של MCAO יפגע הן הסטריאטום ואת קליפת המוח. לאחר 24 שעות MCAO קבוע, אחוז האוטם הכולל הוא ~ 40 ± 5% בחצי הכדור ואת שיעור התמותה לאחר הניתוח הוא ~ 10%. אנו לא כוללים עכברים ממחקרים נוספים אם דימום יתר מתרחשת במהלך הניתוח, את זמן הניתוח עולה על 90 דקות, עכברים מצליחים להתאושש מן ההרדמה בתוך 15 דקות, או דימום נמצא את פרוסות המוח או בבסיס המעגל של ויליס במהלך הבדיקה שלאחר המוות .
61/2761fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
באיור 1. נציג תמונות של TTC מוכתם פרוסות המוח (רמת העטרה 1-4) לאחר 24 שעות של MCAO קבע. בכל רקמה חיה TTC הוא מופחת על ידי enzymatically dehydrogenases ל 1,3,5-triphenylformazan (TPF), שבו הוא בצבע אדום, ואילו באזורים נמקי הוא נשאר לבן בשל היעדר הפעילות האנזימטית כאלה. לכן, בתחום של אוטם ניתן לזהות לפי צבע לבן שלה בשל חוסר ההמרה של TTC כדי TPF. הערה: TTC הוא חום מעט אור לא יציב כל כך להגן על החלקים המוכתמים מהחום והאור כמה שיותר.
Discussion
MCAO בעכברים נפוץ מודל איסכמיה מוקד בבני אדם. שימוש בעכברים ללימודי שבץ הפכה שכיחה יותר בגלל הזמינות של זנים מהונדס ו בנוקאאוט. ישנם כמה פרטים קריטיים לציין בפרוטוקול:
- זה חיוני כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עכבר במהלך הניתוח ולפני זה לגמרי מתאושש מן ההרדמה. טמפרטורת הגוף יש השפעות על היקף של אוטם: ירידות היפותרמיה ו היפרתרמיה מגבירה את גודל האוטם.
- בעוד לחשוף לבודד את המרכז לאמנות עכשווית ו ECA, למנוע נזק העצב התועה סמוך לקנה הנשימה, מה שיכול להגדיל את גודל האוטם ואת הכדאיות ירידה.
- לעולם לא להכניס את תפר monofilament יותר מ -10 מ"מ להעביר את הסתעפות. תפר מוכנס מדי יכולים לנקב את עורק מוחי כתוצאה הקדמי וגם דימום מוחי. התנגדות ניתן לחוש כאשר תפר מתקדמת על 9-10 מ"מ מעבר לנקודת הסתעפות. במקרה זה, החוקר צריך להפסיק לקדם את תפר ולאשר את המרחק.
Disclosures
אין לנו שום אינטרסים מנוגדים פוטנציאל לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH NS057195 מענק, פרס reac קליפורניה בסן פרנסיסקו, ו קנט סטייט הזנק קרן WH צ'ו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
