Summary
Vi visar i videon en metod för att producera en mellersta cerebral artär ocklusion i vuxna möss med hjälp av en intraluminal monofilament. Vi visar också hur man ska värdera omfattningen av hjärninfarkt av 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) färgning.
Abstract
Stroke är den vanligaste dödliga neurologisk sjukdom i USA 1. Majoriteten av stroke (88%) beror på blockering av blodkärl i hjärnan (ischemisk stroke) 2. Eftersom de flesta ischemisk stroke (~ 80%) inträffar inom mellersta cerebral artär (MCA) 3, har många djur stroke-modeller som har utvecklats fokuserat på denna artär. Den intraluminal monofilamentgarn modellen av mellersta cerebral artär ocklusion (kortex) innebär införandet av en kirurgisk glödtråden i den yttre halspulsådern och dra den framåt i den inre halspulsådern (ICA) tills spetsen occludes ursprung MCA, vilket resulterar i ett upphörande av blodflödet och efterföljande hjärninfarkt i MCA område 4. Tekniken kan användas för att modellera permanent eller tillfällig ocklusion 5. Om sutur tas bort efter ett visst intervall (30 min, 1 h eller 2 h), är reperfusion uppnås (övergående kortex), om glödtråden är kvar på plats (24 h) Bestämmelserna är lämplig som en modell av permanent kortex . Denna teknik kräver inte craniectomy, ett neurokirurgiskt ingrepp för att avlägsna en del av skallen, som kan påverka intrakraniella tryck och temperatur 6. Det har blivit den mest använda metoden för att efterlikna permanent och tillfällig fokal cerebral ischemi hos råttor och möss 7,8. För att utvärdera omfattningen av hjärninfarkt, bets vi hjärnan skivor med 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) för att identifiera ischemisk hjärnvävnad 9. I denna video visar vi de kortex metoden och bestämning av infarkt storlek med TTC färgning.
Protocol
1. Kortex Metod
Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och kommittéer Använd vid UCSF och Kent State University, och står fast vid National Institutes of Health riktlinjer för användningen av försöksdjur.
- Skär en 5-0 monofilamentgarn sutur (Harvard Apparatur, Holliston, MA) till 20 mm segment. Runda toppen av varje segment genom att värma det nära en cauterizer (Braintree Scientific, Inc., Braintree, MA). Mät diametern på spetsen med hjälp av en mikrometer (Applied Image Inc., Rochester, NY). Vi använder en sutur med ett sista tips diameter på 0,21-0,22 mm för en mus med en kroppsvikt på 25-30 g.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg genom autoklavering (minst 121 ° C, 15 PSI, i 15 min). SNYGGA operationen bordet och tillhörande utrustning som använder 70% etanol.
- Bedöva en 8-12 veckor gamla mus (25-30 g) med 5% isofluran (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) hos 30% O 2 / 70% N 2 O med V-10 Anestesi-systemet (VetEquip, Inc ., Pleasanton, CA). Efter induktion av anestesi, minska nivån av isofluran och bibehålla den vid 1,5%.
- Placera musen i ryggläge på en värmedyna. Sätt in en rektal sond, samt övervaka och upprätthålla kroppstemperaturen mellan 36,5-37,5 ° C med hjälp av TR-200 homeothermic temperatur systemet (Fine Science Tools Inc., Foster City, CA).
- Raka pälsen på ventrala halsregionen med elektrisk hårklippningsmaskiner (Braintree vetenskapliga) att exponera huden. Desinficera operationsområdet med hjälp av tre tillämpningar av 70% etanol.
- Enligt en stereo dissekera mikroskop (Nikon, Japan), gör en 1 cm lång mittlinje snitt på halsen. Använd upprullningsdon (Braintree vetenskapliga) att avslöja kirurgiska området och identifiera de rätta gemensamma halspulsådern (CCA), yttre halspulsådern (ECA), och carotis interna (ICA). Försiktigt dissekera artärerna fri från omgivande nerver och fascia.
- Dissekera revisionsrätten ytterligare distalt och koagulerar revisionsrätten och dess överlägsna sköldkörtel artär (STA) filial med hjälp av en bipolär coagulator (Howard Instrument Inc., Tuscaloosa, AL). Skär revisionsrätten och STA på koagulerat segmentet.
- Löst slips två 8-0 siden suturer runt ECA stubben. Applicera en vaskulär klämma (Fine Science Tools) vid bifurkation av CCA till revisionsrätten och ICA.
- Gör ett litet snitt i slutet av revisionsrättens stubbe med Vannas stil våren sax (Fin Science Tools). Mät och anteckna längden på en 5-0 monofilamentgarn sutur rundade i spetsen. Sätt sutur i snitt och gå vidare till klämman. Dra åt de två siden suturer runt lumen precis tillräckligt för att säker men ändå bevara rörligheten i i-bostaden monofilament sutur.
- Ta bort klämman från bifurkation. Försiktigt föra monofilamentgarn sutur från lumen revisionsrätten i ICA för ett avstånd på 90-10 mm utanför bifurkation av CCA att täppa ursprung MCA. Tiden för operation är ca 30-45 min.
- Sutur snittet på halsen och placera musen i ett 35 ° C omvårdnad rutan för att återhämta sig från anestesi, och returnera den till buren. Det tar i regel 5-10 minuter för möss att återhämta sig från anestesi. För att utföra transienta kortex kan forskaren nytt söva musen och dra tillbaka sutur tillbaka in i stubben av revisionsrätten efter en tid, oftast mellan 0,5-2 h.
- Tjugofyra timmar efter induktion av kortex, söva musen med 5% isofluran och avliva den genom att halsdislokation. Halshugga musen och samla hjärnan. Skiva hjärnan koronalt i fyra 2-mm skivor med en hjärna matris (Braintree vetenskapliga) på is. Inkubera hjärnan skivor i 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) (Sigma-Aldrich) i 1X PBS i 20 min i rumstemperatur för att bestämma storleken och omfattningen av hjärtinfarkt. Fäst hjärnan skivor i 10% neutral buffrad formalin lösning (Sigma-Aldrich) vid 4 ° C tills avbildning. Omfattningen av infarkt kan kvantifieras enligt JUPITER-protokoll 955 ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9.
2. Representativa resultat
Den infarkter som genereras av kortex ses i striatum och dorsolaterala cortex. Striatum är mer känslig för ischemi än hjärnbarken. Trettio minuter av kortex kommer att producera en infarkt bara i striatum, medan mer än en timme av kortex kommer att skada både striatum och cortex. Efter 24 timmar bestående kortex är den totala infarkt andelen ~ 40 ± 5% av halvklotet och dödligheten efter operationen är ~ 10%. Vi utesluter möss från fortsatta studier vid kraftig blödning uppstår under operation, överstiger drifttid 90 min, möss misslyckas med att återhämta sig från anestesi inom 15 minuter, eller blödning finns i hjärnan skivor eller vid basen av kretsen av Willis vid obduktion undersökning .
61/2761fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Representant bilder av TTC-färgade hjärnan skivor (koronal nivå 1-4) efter 24 h fasta kortex. I levande vävnad TTC enzymatiskt minskas med dehydrogenaser till 1,3,5-triphenylformazan (TPF), som är röd till färgen, medan det i nekrotiska områden det är fortfarande vitt på grund av avsaknad av sådana enzymatiska aktivitet. Därför kan området infarkt identifieras genom sin vita färg på grund av konvertering av TTC till TPF. Obs: TTC är något värme och ljus instabil så skydda färgade snitt från värme och ljus så mycket som möjligt.
Discussion
Kortex hos möss används ofta för att modellera fokal ischemi i hjärnan hos människor. Användning av möss för stroke studier har blivit vanligare på grund av tillgången av transgena och knockout stammar. Det finns några viktiga detaljer att notera i protokollet:
- Det är viktigt att hålla temperaturen musen kroppen under operation och innan man helt återhämtar sig från narkosen. Kroppstemperaturen har effekter på omfattningen av infarkten, hypotermi minskar och hypertermi ökar storleken på infarkten.
- Medan exponera och isolera de CCA och revisionsrätten undvika skador på närliggande vagusnerven och luftstrupe, vilket skulle kunna öka infarkt storlek och minskar lönsamheten.
- Aldrig in monofilamentgarn suturen mer än 10 mm passerar bifurkation. En sutur in för långt kan perforera främre cerebral artär och resultera i hjärnblödning. Ett motstånd kan kännas när suturen är avancerad ca 90-10 mm utanför bifurkationen punkten. Om detta inträffar bör forskaren sluta föra fram suturen och bekräfta avståndet.
Disclosures
Vi har inte några potentiella intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag NS057195, UCSF REAC utmärkelse, och Kent State University startfond till WH Chou.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
