Summary
Мы представляем наш оптимизированный для высокой пропускной nucleofection протокол как эффективный способ трансфекции первичных человеческих моноцитарных дендритные клетки либо с плазмидой ДНК или миРНК, не вызывая клетка созревания. Мы также предоставить доказательства для успешного глушителей миРНК целевой ген RIG-I как на РНК и белка.
Abstract
Дендритные клетки (ДК) можно рассматривать часовых иммунной системы, которые играют важнейшую роль в его возбуждении и реакции на инфекцию 1. Обнаружение патогенных антигена наивно домена через распознавания образов рецепторы (РРСС), которые способны распознавать определенные сохраняющиеся структуры называются патоген-связанные молекулярные модели (PAMPS). Обнаружение PAMPs по РС вызывает внутриклеточный сигнальный каскад в результате чего их активации и перехода к зрелой DC. Этот процесс, как правило, характеризуется производство интерферона типа 1, наряду с другими провоспалительных цитокинов, регуляция клеточных поверхностных маркеров, таких как MHCII и CD86 и миграцию зрелых постоянного тока для слива лимфатические узлы, где взаимодействие с Т-клетки, инициирует адаптивного иммунного ответа 2, 3. Таким образом, контроллеры домена ссылку врожденной и адаптивной иммунной системы.
Способность анализировать молекулярные сети постоянного тока основной ответ на различные патогенные имеет решающее значение для лучшего понимания регулирование этих сигнальных путей и их индуцированных генов. Он также должен способствовать развитию округ Колумбия, вакцин против инфекционных заболеваний и опухолей. Тем не менее, это направление было сильно мешают трудности трансфекции первичных контроллерах домена 4.
Вирус трансдукции методы, такие как лентивирусов системы, как правило, используются, но имеют много ограничений, таких как сложность и биологически опасных рисков (с соответствующими затратами) 5,6,7,8. Кроме того, доставка продуктов вирусного гена увеличивает иммуногенность тех трансдуцированных домена 9,10,11,12. Электропорация была использована со смешанными результатами 13,14,15, но мы первыми сообщили использование высокой пропускной трансфекции протокол и убедительно доказать свою полезность.
В этом докладе мы суммируем оптимизированных коммерческих протокол для высокой пропускной трансфекции первичных человеческих DC, с ограниченным токсичности клеток и отсутствие постоянного созревания 16. Трансфекция эффективности (GFP из плазмиды) и жизнеспособности клеток были более чем на 50% и 70% соответственно. FACS анализ установленных отсутствие увеличения выражение созревание маркеров CD86 и MHCII в трансфекции клеток, а QRT-PCR, не выявили регуляция IFNβ. Используя этот протокол электропорации, мы предоставляем доказательства для успешной трансфекции миРНК с контроллерами домена и эффективной сбить целевой ген RIG-I, ключевых вирусных рецепторов признание 16,17, как на РНК и белка.
Protocol
1. Программа Amaxa 96 и трансфер Nucleofector
- Откройте новый файл параметров.
- Выберите количество скважин вы будете использовать для стандартных трансфекции, перемещая курсор на 96 лунок диаграмме пластины. Используйте не менее 3 скважин бассейн для каждого экспериментального образца.
- Введите код программы: в part1 выберите 'FF' и в part2 выберите '168 'из выпадающего меню
- С Решения окне выберите "Моноцитарный, человеческое '
- Под контролем Вариант выбора "стандартный".
- Нажмите на Apply.
- Чтобы включить не трансфекции управления, выберите дальнейшего скважин из диаграммы по мере необходимости, а затем выберите "Нет программы борьбы с 'из управления Вариант и нажмите на кнопку Apply.
- Выберите любые остающиеся неиспользованными скважин на пластине диаграммы и нажмите на Undefine.
2. Подготовка домена для трансфекции
- Все работы должны производиться в стерильных условиях в капот культуре клеток, где это возможно. Подготовка nucleofection решение, добавив 96-а дополнением к человеческих моноцитов 96-луночного Nucleofector решение в соотношении 450 к 2025 году. Перемешать и дать прогреться до комнатной температуры. Вам понадобится 20 мкл nucleofection решение на лунку. Сделать более 10%, чтобы учесть ошибки пипетирования.
- Место количество модулей nucleocuvette вам нужно в пластину nucleocuvette в правильной ориентации, т.е. вставив первый в к строкам 1 и 2.
- Определить количество контроллеров домена, необходимые для вашего эксперимента в расчете на 500 000 клеток на лунку и гранул путем центрифугирования при 400g в течение 10 минут. Осторожно удалите супернатант.
- Ресуспендируют клеток в nucleofection решение, мягко пипетирования вверх и вниз несколько раз.
- Разделите правильный объема ресуспендировали клеток в eppendorfs предназначенного для конкретного лечения, например, GLO и RIG-I.
- Добавить 0.25μg миРНК в клетки 500000 и перемешать с помощью пипетки. Используйте ненацеливании миРНК в не-трансфекции контрольного образца.
- Внесите 20 мкл выше смесей в модулях nucleocuvette, в соответствии с вашими Схема экспериментальной установки, обеспечивая жидкость подается на дно колодца.
- Обложка nucleocuvette пластины с крышкой и нажмите на пластину на твердую поверхность несколько раз, чтобы обеспечить удаление пузырьков воздуха.
3. Трансфекции домена
- Вставьте пластину в Nucleofector 96-луночного трансфер лоток, нажмите на Загрузить и запустить.
- Следуйте прогресса трансфекции процесса на дисплее верхней коленях; черный крест на зеленом фоне означает успешное трансфекции в том, что хорошо, в то время как черная полоса на красном фоне означает, что она была неудачной.
- По завершении процесса трансфекции, удалить пластину и добавить 80μl среднего роста DC в каждую лунку помощью многоканальной пипетки.
- Инкубируйте пластине в течение 10 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
- Передача 100 мкл объемом от nucleocuvettes в матрицу пробирки, содержащие 100 мкл подогретого среднего роста, округ Колумбия, поддержание правильной ориентации.
- Удаляют тех пробирках, где трансфекции не произошло.
- Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 24 часов или другого желаемого интервала времени.
4. Инфицировать клетки с НДВ
- Удалите матрицу труб из инкубатора в капот культуре клеток и бассейн трубы для каждого экспериментального образца в eppendorfs
- Гранул клетки осторожно, крутя в центрифуге верхней палубе, в течение 5 минут и удалить супернатант.
- Ресуспендируют клетки в бессывороточной роста среде, содержащей НДВ в МВД 1 и инкубировать при температуре 37 ° С и 5% CO 2 в течение 45 мин, при eppendorfs слабо покрыта стерильной моды.
- Добавить 900μl среднего роста, округ Колумбия, и вновь инкубировать в течение 8-10 ч.
5. Урожай клетки
- Гранул клеток спиннинг eppendorfs в центрифуге верхней палубе, и удалите супернатант.
- Урожай клеток на РНК или белка добычи в соответствии с вашим протоколом.
6. Представитель результаты:
Используя наш оптимизированный протокол мы трансфицированных контроллеры домена с Риги таргетирования миРНК в течение 24 ч, после чего инфицированные клетки с НДВ (парамиксовирус обнаружены RIG-I), чтобы стимулировать пути интерферона ответ. По QRT-PCR анализа мы показали, сбить гена на 75% на уровне транскрипции. Мы также наблюдали похожее сокращение выражения IFNβ, которая ниже по течению эффектор RIG-I в каскаде ИФН сигнализации. Кроме того, мы обнаружили, что выражение IFNβ в неинфицированных, контрольно-трансфекции клеток не обнаруживается в то время как MXA, IFNβ вниз по течению гена ответ, было минимальным (рис. 1А).
Второй трансфекции домена с Риги таргетирования миРНК проводили с использованием достаточное количество клеток для включения Западной блоттинга. ГдеRT-PCR результаты были похожи на то, что мы видели ранее (62% и 66% сбить из RIG-I и IFNβ выражении соответственно) (рис. 1Б), иммуноблоттинга исследовали на RIG-I показало, что экспрессия этого гена была полностью блокирован (рис. 1в).
Рисунок 1. (А) MoDCs трансфицируют либо миРНК ориентации RIG-I или неспецифических миРНК GLO и влияние на экспрессию RIG-I, IFNβ и MXA определяется QRT-PCR. Трансфекции протокол, используемый моноцитов конкретного буфера и nucleoporation программы FF168 (Lonza Уолкерсвилл Inc) После инкубации в течение 24 ч, трансфекции клетки либо были инфицированы НДВ (+) или влево неинфицированных (-). После дальнейшей инкубации в течение 10 ч, клетки собирали и РНК, выделенная уровней Стенограмма представляют результаты двух повторить эксперименты. Взято из Боулз и др. 16. (В) MoDCs получены из различных пальто Баффи, который используется для рис. 1А снова трансфицированных либо RIG-I-таргетинга миРНК или неспецифических миРНК GLO, используя тот же протокол трансфекции как указано выше. Дополнительного контроля с использованием untransfected MoDCs был включен в эксперимент. После 24 ч инкубации все клетки были инфицированы НДВ и инкубировали в течение еще 10 ч до сбора урожая и для РНК и белка добычи. Стенограмма уровней RIG-I, IFNβ и MXA, как это определено QRT-PCR представляют результаты двух повторить эксперименты. Взято из Боулз и др. 16. (С) Лизаты из клеток показано на рисунке 1b выше, были проанализированы иммуноблоттинга. Дорожки 1 и 2, из лизатов untransfected клеток; полосы 3 и 4, лизатов от GLO миРНК трансфекции клеток; полосы 5 и 6, лизатов из клеток, трансфицированных RIG-I-таргетинга миРНК. Образцы были исследованы на RIG-I, а также GAPDH (как погрузка контроль) и проводились в двух экземплярах. Взято из Боулз и др. 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эффективность трансфекции наивно первичных дендритных клеток имеет важное значение для высокой пропускной способности и анализа инженерный клеточных воспалительных путей в этой ключевой ячейки посредническую врожденной-адаптивной иммунной перехода. Тем не менее, большинство исследователей считают, что эти клетки являются трудными для трансфекции как эффективно и без вызывающих трансфекции созревания ячейки процедуры при использовании стандартных методов трансфекции. Мы исследовали, являются ли эти ограничения могут быть преодолены высоким оптимизации протокола пропускной использованием одновременных независимых 96-и коммерческих ядерных системы трансфекции (Lonza).
Использование активированного флуоресцентные сортировки клеток (FACS), мы измерили GFP-экспрессирующих плазмид в качестве маркера для эффективности трансфекции и CD86 и MHCII иммунореактивности как считывание ячейки созревания. Серии экспериментов оценки буферов и электропорации программ в конечном итоге определили условия показывает> 50% трансфекции и отсутствие увеличения созревание маркеров.
Для дальнейшего изучения возможной активации контроллеров домена по nucleofection процесс мы проанализировали уровни экспрессии IFNβ и вниз по течению MXA гена реагирования на уровне мРНК. MXA выражение изысканно чувствительны к IFNβ производства и может быть использована в качестве биологического анализа для обнаружения очень низких уровнях cytokine18. Через QRT-PCR анализа мы увидели, не обнаружено IFNβ выражения, но видел некоторые регуляция MXA что свидетельствует выше базовой IFNβ индукции. Однако эта минимальная регуляция MXA в неинфицированных, контрольно-трансфекции клеток было незначительным по сравнению с результатом вирус-опосредованной стимуляции IFNβ сигнальный каскад (рис. 1А) и подтвердил, что мы могли бы успешно использовать наш nucleoporation протокол для трансфекции домена без активации их существенного уровня.
Полезность наш оптимизированный протокол был подтвержден Вестерн-блоттинга. Трансфекция контроллеры домена с миРНК ориентации RIG-I вызвало полную потерю обнаружить RIG-I белка (рис. 1в). Следует отметить, что для успешного возмущение других генов, количество миРНК используются и длина трансфекции время, возможно, придется быть оптимизированы.
Насколько нам известно, эта работа позволяет в первый раз дизайн высокой пропускной потерей функциональных исследований в первичных человеческих контроллеры домена, решив тем самым трудным препятствием для исследований в этой области. Это должно обеспечить новые возможности для изучения DC сигнализации и может способствовать прогрессу в развивающихся округ Колумбия, иммунотерапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Проект был поддержан NIH NIAID контракт № HHSN2662000500021C. Мы благодарим Мин Чена за его техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
