Summary
我们目前我们优化的高通量nucleofection协议，要么质粒DNA或不会造成细胞的成熟的siRNA转染初级人类单核细胞衍生的树突状细胞的有效方法。我们进一步提供证据证明为成功的siRNA沉默靶基因的mRNA和蛋白水平的RIG - I。
Abstract
树突状细胞可以被认为是其中发挥关键作用，在其发起和响应感染 1的免疫系统的哨兵。天真区议会致病抗原的检测是通过模式识别受体（PRRS）是能够识别特定病原体相关分子模式（PAMPS）的保守结构。区议会PAMPS检测触发细胞内的信号级联，导致他们的活化和转化为成熟DC。这个过程通常是通过对1型干扰素的生产特点以及与其他炎性细胞因子，如MHCII和CD86和迁移的淋巴结，与T细胞相互作用启动适应性免疫反应的成熟DC的细胞表面标志的上调， 3。因此，区议会的联系先天免疫和适应性免疫系统。
解剖的基本直流响应，以各种病原体的分子网络的能力是至关重要的，以更好地了解了这些信号通路的调控和诱导基因。它也应当有助于促进DC为基础的疫苗针对传染病和肿瘤的发展。然而，此行的研究已经严重阻碍，难以转染的主要区议会 4 。
病毒转导的方法，如慢病毒系统，通常使用的，但携带很多限制，如复杂性和有害生物风险（ 相关费用）5,6,7,8。此外，该病毒基因产物的交付增加转区议会 9,10,11,12的免疫原性。电穿孔技术已用于13,14,15结果好坏参半，但我们是第一个报告使用一种高通量的转染协议和确凿证明其效用。
在这份报告中，我们总结了一个优化的商业协议，高通量转染人类的主要区议会，与有限的细胞毒性和一个 DC成熟16的情况下。转染效率（GFP质粒）和细胞活力分别超过50％和70％。流式细胞仪分析建立的成熟标志物CD86和MHCII转染细胞中表达增加的情况下，而定量RT - PCR结果显示没有IFNβ上调。使用此电协议，我们提供证据议会成功转染siRNA和有效的敲有针对性的基因RIG - I，16,17一个关键的病毒识别受体的mRNA和蛋白水平，。
Protocol
1。计划Amaxa 96穿梭Nucleofector
- 打开一个新的参数文件。
- 选择您将使用标准的转拖动光标在96孔板图，井的数量。使用至少3口井，池，每个实验样品。
- 输入程序代码：在第一部分选择“FF”，并在第2部分选择'168'从下拉式菜单
- 从解决方案中，选择“单核细胞，人类”
- 在控制选项，选择“标准”。
- 点击应用。
- 包括无染控制，从图中选择进一步根据需要，然后选择“没有计划控制”控制选项，并单击Apply井。
- 选择任何的板图上剩余的未使用的水井和点击取消定义。
2。准备转区议会
- 一切工作都要在细胞培养罩在可能的情况下无菌条件下进行。准备加入96 nucleofection解决方案以及补充96人单核细胞以及在450到2025年的比例Nucleofector解决方案。混合，让温暖室温。您需要的解决方案nucleofection20μL，每口井。作出超过10％，让移液错误。
- 将nucleocuvette模块，你需要在正确的方向，即nucleocuvette板插入1和第2行第一个。
- 确定为您的实验400克离心10min后，在50万个以及细胞和颗粒细胞计算所需的DC。小心去除上清。
- 重悬浮在nucleofection溶液中轻轻吹打向上和向下几次的细胞。
- 分成特定的治疗如GLO和RIG - I标记eppendorfs的悬浮细胞的正确的卷。
- 添加吹打每50万细胞和混合0.25μg的siRNA。使用非针对你不转染对照样品的siRNA。
- 移取20μL到nucleocuvette模块上述混合物中，根据实验布局，确保液体被传递到井底。
- 盖上盖子nucleocuvette板和挖掘了几次，在坚硬的表面，以帮助确保去除气泡板。
3。转染区议会
- Nucleofector 96穿梭托盘插入板，点击上传，然后开始。
- 按照圈上方显示转染过程中的进展情况;一个绿色背景上的黑十字标志，以及在成功转染，而红色背景上的一个黑条意味着它是不成功的。
- 在转染过程完成后，删除板和直流生长介质中添加每口井使用多道移液器80μl。
- 盘10分钟在37 ° C和5％的CO 2。
- 从nucleocuvettes转移到矩阵管的预热直流生长培养基中含有100μL100μL量，保持正确的方向。
- 取下并丢弃那些管的地方转没有发生。
- 在37 ° C和5％的CO 2为24小时或其他所需的时间间隔。
4。感染新城疫病毒细胞
- 每个实验样品取出矩阵管从孵化器到细胞培养罩和池管到eppendorfs
- 颗粒细胞轻轻在桌面离心纺丝5分钟，去除上清液。
- 重悬在无血清的增长介质中含有新城疫病毒的细胞在MOI为1，并在37 ° C和5％ 的 CO 2为45分钟eppendorfs松散覆盖在无菌的方式。
- 添加直流生长培养基900μl，和重新孵育8-10小时
5。收获细胞
- 纺eppendorfs在桌面离心机，去除上清液，沉淀细胞。
- 收获细胞RNA或蛋白质的提取，根据您的协议。
6。代表性的成果：
使用我们的优化协议，我们转染的 DC瑞吉，针对24小时的siRNA，然后感染新城疫病毒（RIG - I检测到一个副粘病毒）的细胞刺激干扰素反应途径。 QRT - PCR分析表明敲的基因在转录水平的75％。我们还观察到一个类似IFNβ表达减少，在干扰素信号级联，这是一个RIG - I的下游效应。此外，我们观察到，在非疫区，控制转染的细胞表达IFNβ，没有检测到 ， 而 MXA，IFNβ下游反应基因，是最小的（图1A）。
一个区议会第二次转瑞吉靶向的siRNA进行足够的细胞包括免疫印迹分析。凡RT - PCR结果相似，我们看到以前（敲除RIG - I和IFNβ表达分别下降62％和66％）（图1B），免疫印迹检测RIG - I显示，该基因的表达已完全阻断（图1C）。
图1。 （一）MoDCs或者siRNA的转染靶向的RIG - I或GLO的siRNA和非特异性的RIG - I，IFNβ和QRT - PCR确定MXA的表达效果。转染协议，用于单核细胞特定的缓冲和nucleoporation方案FF168（龙沙Walkersville公司）以下潜伏期为24小时，转染的细胞被感染了新城疫病毒（+）或左未受感染者（ - ）。进一步潜伏期为10小时后，收获细胞和RNA提取的转录水平代表两个重复实验的结果。从鲍尔斯等 16。（二）从一个不同的棕黄色大衣图1A MoDCs再次转任的RIG - I靶向siRNA或使用相同的转染上述协议的非特异性GLO的siRNA 。一个额外的控制，使用未转染MoDCs纳入实验。所有细胞与鸡新城疫病毒感染，并为进一步的RNA和蛋白质的提取收获前10 h孵育后培养24 h。 RIG - I，IFNβ和MXA QRT - PCR确定的转录水平代表两个重复实验的结果。鲍尔斯等 16（C）从上面的图1B中描述的细胞裂解液，免疫印迹分析。泳道1和2，未转染细胞裂解液;泳道3和4，来自GLO siRNA转染细胞裂解液;泳道5和6，RIG -我靶向的siRNA转染细胞裂解液。样品探测RIG - I，也GAPDH的装载控制和重复运行。摘自鲍尔斯等 16。
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Discussion
幼稚的初级树突状细胞的高效转染重要的是，在这关键的细胞介导的先天适应性免疫过渡的细胞炎症通路的高通量分析和逆向工程。然而，大多数研究人员发现，这些细胞是难以转染效率和转染过程诱导细胞成熟时，使用标准的转染技术。我们研究了克服这些限制是否可以由高吞吐量协议优化使用，同时，独立96以及商业核转染系统（龙沙）。
利用荧光激活细胞分选（FACS），我们测得的绿色荧光蛋白表达质粒转染效率和标志物CD86和MHCII免疫细胞成熟的读数。一系列实验评估缓冲器和电的方案，最终确定的条件显示> 50％的转染和成熟的标志物增加的情况下。
为了进一步探讨的nucleofection过程中可能激活区议会，我们分析，在mRNA水平的IFNβ的表达水平和其下游反应基因 MXA。MXA表达是极其敏感IFNβ生产的，可用于生物活性检测到非常低的水平在cytokine18。通过定量RT - PCR分析，我们看到没有检测 IFNβ表达，但确实看到一些MXA从而表明上述基准IFNβ诱导上调。然而，这在非疫区，控制转染细胞的MXA最小上调相比是微不足道的，从病毒介导的刺激IFNβ信号级联反应（图1A），并确认不激活转染区议会，我们可以成功地使用我们的nucleoporation协议任何重大的水平。
Western blot分析证实了我们的优化协议的效用。针对RIG - I造成完全丧失了检测的RIG - I蛋白（图1C）。siRNA的转染区议会我们应该注意到，其他基因的成功扰动，用量的siRNA转染时间长短可能要优化。
据我们所知，这项工作使首次设计的高通量功能丧失，在人类的主要区议会的研究，从而解决了一个困难的障碍，在这一领域的研究。这应提供新的机遇和直流电信号的研究可能有助于在开发基于DC免疫治疗的进步。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
该项目是由美国国立卫生研究院NIAID的合同号HHSN2662000500021C支持。我们感谢他的技术援助名臣。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
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