Summary
हम या तो प्लाज्मिड या सेल परिपक्वता के कारण के बिना डीएनए siRNA साथ प्राथमिक मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं transfecting की एक कारगर तरीका के रूप में हमारे अनुकूलित nucleofection उच्च throughput प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम आगे लक्षित जीन RIG मैं दोनों mRNA और प्रोटीन के स्तर पर सफल siRNA मुंह बंद करने के लिए सबूत प्रदान करते हैं.
Protocol
1. कार्यक्रम Amaxa 96 अच्छी तरह शटल Nucleofector
- एक नए पैरामीटर फ़ाइल खोलें.
- आप 96 अच्छी तरह से थाली आरेख पर कर्सर खींचकर मानक अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए किया जाएगा कुओं की संख्या का चयन करें. पूल करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के लिए 3 कुओं की एक न्यूनतम का उपयोग करें.
- इनपुट प्रोग्राम कोड: part1 का चयन करें 'एफएफ' में part2 में का चयन करें डाउन मेनू पुल से '168 '
- समाधान बॉक्स का चयन करें monocyte, मानव 'से
- नियंत्रण विकल्प के तहत 'मानक' का चयन करें.
- लागू करें पर क्लिक करें.
- नियंत्रण नहीं अभिकर्मक शामिल करने के लिए, आरेख से आगे कुओं के रूप में आवश्यक है और तब नियंत्रण विकल्प से कोई कार्यक्रम नियंत्रण 'का चयन करें और लागू करें पर क्लिक करें का चयन करें.
- थाली चित्र पर किसी भी शेष अप्रयुक्त कुओं का चयन करें और Undefine पर क्लिक करें.
2. अभिकर्मक के लिए DCs तैयार
- सभी काम एक सेल संस्कृति हुड जहां संभव में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. Nucleofection समाधान जोड़कर तैयार 96 अच्छी तरह से मानव monocyte 96 अच्छी तरह से 450 करने के लिए 2025 के अनुपात में Nucleofector समाधान के लिए पूरक. मिश्रण और कमरे के तापमान को गर्म की अनुमति. आप nucleofection समाधान के 20μl प्रति अच्छी तरह से की आवश्यकता होगी. त्रुटि pipetting के लिए अनुमति देने के लिए 10% की एक अतिरिक्त.
- Nucleocuvette मॉड्यूल आप सही ओरिएंटेशन अर्थात् में nucleocuvette थाली में पंक्तियों 1 और 2 में पहली बार एक डालने की जरूरत की संख्या प्लेस.
- DCs अपने प्रयोग 10min के लिए 400g में centrifuging द्वारा अच्छी तरह से और गोली प्रति 500,000 कोशिकाओं पर की गणना के लिए जरूरत की संख्या का निर्धारण करते हैं. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- Nucleofection समाधान में धीरे से ऊपर और नीचे pipetting कुछ समय से कोशिकाओं Resuspend.
- विशेष उपचार जैसे GLO और RIG मैं के लिए लेबल eppendorfs में resuspended कक्षों की सही मात्रा में फूट डालो.
- Pipetting द्वारा प्रति 500.000 कोशिकाओं और मिश्रण 0.25μg siRNA जोड़ें. गैर लक्ष्यीकरण अपने नियंत्रण नहीं अभिकर्मक नमूना में siRNA का उपयोग करें.
- Nucleocuvette मॉड्यूल में ऊपर मिश्रण के पिपेट 20μl अपने प्रयोगात्मक लेआउट में अनुसार, तरल अच्छी तरह से नीचे को सुनिश्चित करने के लिए दिया जाता है.
- ढक्कन के साथ कवर nucleocuvette प्लेट और एक कठिन सतह समय की एक जोड़ी हवाई बुलबुले को हटाने सुनिश्चित करने में मदद पर थाली नल.
3. Transfect DCs
- Nucleofector 96 अच्छी तरह शटल ट्रे में थाली डालें, अपलोड पर क्लिक करें और फिर शुरू.
- गोद शीर्ष प्रदर्शन पर अभिकर्मक प्रक्रिया की प्रगति का पालन करें, एक हरे रंग की पृष्ठभूमि पर एक काला पार कि अच्छी तरह से एक सफल अभिकर्मक का प्रतीक है, जबकि एक लाल रंग की पृष्ठभूमि पर काली पट्टी का मतलब यह असफल रहा था.
- अभिकर्मक की प्रक्रिया के पूरा होने पर, थाली को हटा दें और अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग कर प्रत्येक के लिए डीसी मध्यम विकास के 80μl जोड़ें.
- 37 पर 10 मिनट के लिए थाली सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- Nucleocuvettes से पूर्व गर्म डीसी विकास के माध्यम से 100μl युक्त मैट्रिक्स ट्यूबों में 100μl मात्रा स्थानांतरण सही ओरिएंटेशन को बनाए रखने.
- निकालें और उन ट्यूबों जहां अभिकर्मक घटित नहीं था त्यागें.
- 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 24 या अन्य वांछित समय अंतराल के लिए सीओ 2 .
4. NDV के साथ कोशिकाओं को संक्रमित
- इनक्यूबेटर से सेल संस्कृति हुड और पूल ट्यूबों मैट्रिक्स ट्यूबों eppendorfs में प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के लिए निकालें
- गोली कोशिकाओं धीरे से 5 मिनट के लिए एक डेस्क टॉप अपकेंद्रित्र में कताई द्वारा और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- सीरम मुक्त विकास NDV युक्त माध्यम से कोशिकाओं को 1 के एक MOI Resuspend और 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस और 45 मिनट के लिए 5 सीओ 2% शिथिल एक बाँझ फैशन में कवर eppendorfs के साथ.
- एच. 8-10 के लिए डीसी मध्यम विकास के 900μl, और फिर से सेते जोड़ें
5. हार्वेस्ट कोशिकाओं
- एक डेस्क टॉप अपकेंद्रित्र में eppendorfs कताई और सतह पर तैरनेवाला हटायें द्वारा गोली कोशिकाओं.
- शाही सेना या अपने प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन निष्कर्षण के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग हम साथ DCs ट्रांसफ़ेक्ट Rigi लक्ष्यीकरण siRNA के लिए 24 घंटे और फिर NDV (एक RIG मैं द्वारा पता लगाया paramyxovirus) के साथ कोशिकाओं इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया मार्ग को प्रोत्साहित संक्रमित. QRT-पीसीआर विश्लेषण करके हम जीन प्रतिलेखन स्तर पर 75% से नीचे दस्तक का प्रदर्शन किया. हम भी IFNβ की अभिव्यक्ति में एक समान कमी है, जो IFN संकेत झरना में एक बहाव RIG मैं effector है मनाया . इसके अलावा, हम ने कहा कि गैर संक्रमित, नियंत्रण ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में IFNβ की अभिव्यक्ति detectable जबकि MxA, एक IFNβ बहाव प्रतिक्रिया जीन, कि कम से कम था (चित्रा 1 ए) नहीं था .
के साथ एक DCs के दूसरे अभिकर्मक Rigi लक्ष्यीकरण siRNA पर्याप्त कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण शामिल किया गया था. जहाँRT-पीसीआर के परिणाम के लिए समान थे क्या हम पहले देखा था (62% और 66% RIG-मैं और IFNβ अभिव्यक्ति क्रमशः नीचे दस्तक) (चित्रा 1 बी), पश्चिमी धब्बा रिग - मैं पता चला है कि इस जीन की अभिव्यक्ति किया गया था के लिए जांच पूरी तरह से अवरुद्ध (चित्रा 1C).
चित्रा 1. (ए) MoDCs या तो siRNA लक्ष्यीकरण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे RIG-मैं या nonspecific GLO और रिग - मैं IFNβ, और MxA QRT-पीसीआर द्वारा निर्धारित की अभिव्यक्ति पर प्रभाव siRNA. (-) अभिकर्मक प्रोटोकॉल एक बफर monocyte विशिष्ट और nucleoporation FF168 कार्यक्रम (Lonza Walkersville इंक) के बाद 24 घंटे के लिए ऊष्मायन का इस्तेमाल किया, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं या तो (+) NDV या बाएँ असंक्रमित के साथ संक्रमित थे. 10 घंटे के लिए एक और आगे ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं काटा गया और शाही सेना निकाली ट्रांसक्रिप्ट स्तर दो को दोहराने के प्रयोगों के परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं. बाउल्स एट अल 16 से लिया (बी) एक अलग buffy कोट से प्राप्त के रूप में चित्रा 1A के लिए इस्तेमाल किया MoDCs फिर साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे या तो रिग मैं siRNA या nonspecific GLO ही अभिकर्मक प्रोटोकॉल का उपयोग कर के रूप में ऊपर siRNA लक्ष्यीकरण. एक अतिरिक्त untransfected MoDCs का उपयोग करते हुए नियंत्रण प्रयोग में शामिल किया गया था. 24 घंटे ऊष्मायन के बाद सभी कोशिकाओं NDV से संक्रमित थे और दोनों शाही सेना और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए काटा जा रहा से पहले एक और 10 घंटे के लिए incubated. RIG - मैं IFNβ और MxA QRT-पीसीआर द्वारा निर्धारित के रूप में की ट्रांसक्रिप्ट स्तर दो को दोहराने के प्रयोगों के परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं. से लिया बाउल्स एट अल 16 (सी) चित्रा 1B में ऊपर वर्णित कोशिकाओं से lysates पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया. लेन 1 और 2, untransfected कोशिकाओं से lysates, 3 और 4 गलियों, GLO siRNA कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट से lysates, 5 गलियों और 6, RIG मैं लक्ष्यीकरण siRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से lysates. नमूने RIG मैं के लिए जांच कर रहे थे और भी GAPDH (एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में) और दो प्रतियों में चला गया. बाउल्स एट अल 16 से लिया है .
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Discussion
भोले प्राथमिक वृक्ष के समान कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक उच्च throughput विश्लेषण और इस कुंजी सहज अनुकूली प्रतिरक्षा संक्रमण mediating कक्ष में सेलुलर भड़काऊ रास्ते के रिवर्स इंजीनियरिंग के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सबसे जांचकर्ताओं को लगता है कि इन कोशिकाओं दोनों कुशलतापूर्वक और अभिकर्मक प्रक्रिया उत्प्रेरण सेल परिपक्वता के बिना transfect जब मानक अभिकर्मक तकनीक का उपयोग कर मुश्किल है. हम जांच की कि क्या इन सीमाओं उच्च throughput प्रोटोकॉल एक साथ, स्वतंत्र 96 अच्छी तरह से वाणिज्यिक परमाणु अभिकर्मक प्रणाली (Lonza) का उपयोग अनुकूलन के द्वारा दूर किया जा सकता है.
फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करना, हम एक GFP अभिकर्मक और सेल परिपक्वता के एक readout के रूप में CD86 और MHCII immunoreactivity दक्षता के लिए एक मार्कर के रूप में व्यक्त प्लाज्मिड मापा. Buffers और electroporation अंततः> 50% अभिकर्मक और परिपक्वता मार्करों में वृद्धि की अनुपस्थिति दिखा शर्तों की पहचान कार्यक्रमों के मूल्यांकन प्रयोगों की एक श्रृंखला.
हम mRNA स्तर पर आगे nucleofection प्रक्रिया से संभव DCs के सक्रियण की जाँच करने IFNβ की अभिव्यक्ति के स्तर और उसके बहाव प्रतिक्रिया जीन MxA का विश्लेषण MxA अभिव्यक्ति exquisitely IFNβ उत्पादन के प्रति संवेदनशील है और bioassay के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है बहुत कम के स्तर का पता लगाने. cytokine18. QRT-पीसीआर विश्लेषण के माध्यम से हम कोई detectable IFNβ अभिव्यक्ति देखा था, लेकिन किया MxA इस प्रकार ऊपर आधारभूत IFNβ प्रेरण का संकेत के कुछ upregulation देखें. हालांकि गैर संक्रमित, नियंत्रण ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में इस MxA के न्यूनतम upregulation कि वायरस की मध्यस्थता IFNβ संकेत झरना (चित्रा 1 ए) की उत्तेजना से उत्पन्न करने के लिए तुलना में नगण्य था और पुष्टि की है कि हम सफलतापूर्वक हमारे nucleoporation प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सक्रिय किए बिना DCs transfect सकता उन्हें किसी भी महत्वपूर्ण स्तर है.
हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोगिता पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के द्वारा पुष्टि की गई. DCs के रिग - मैं detectable प्रोटीन RIG मैं (चित्रा 1C) की एक पूरी नुकसान के कारण होता है. लक्ष्यीकरण siRNA साथ अभिकर्मक हम नोट करना चाहिए कि अन्य जीनों की सफल गड़बड़ी के लिए, siRNA की राशि का इस्तेमाल किया और अभिकर्मक समय की लंबाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
हमारे ज्ञान करने के लिए, यह काम पहली बार उच्च throughput प्राथमिक मानव DCs में नुकसान के समारोह के अध्ययन के डिजाइन के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार इस क्षेत्र में अनुसंधान के लिए मुश्किल बाधा को सुलझाने. यह डीसी संकेत के अध्ययन के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं और उन्नति के लिए डीसी आधारित immunotherapies के विकास में योगदान कर सकते हैं चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
परियोजना NIH NIAID अनुबंध सं. HHSN2662000500021C द्वारा समर्थित किया गया. हम अपने तकनीकी सहायता के लिए मिंग चेन धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
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