Summary
Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.
Abstract
As células dendríticas (DCs) podem ser considerados sentinelas do sistema imune que desempenham um papel fundamental no seu início e resposta à infecção 1. Detecção de antígeno patogênicos por DCs naïve é através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que são capazes de reconhecer estruturas específicas conservadas referido como patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs). Detecção de PAMPs por DCs desencadeia uma cascata de sinalização intracelular, resultando em sua ativação e transformação para DCs maduras. Este processo é normalmente caracterizada pela produção de interferon tipo 1, juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias, upregulation de marcadores da superfície celular como MHCII e CD86 e migração da DC maduro para os linfonodos de drenagem, onde a interação com as células T inicia a resposta imune adaptativa 2, 3. Assim, DCs ligação dos sistemas imune inata e adaptativa.
A capacidade de dissecar as redes moleculares subjacentes DC resposta a vários patógenos é fundamental para uma melhor compreensão da regulação destas vias de sinalização e seus genes induzidos. Ele deve também ajudar a facilitar o desenvolvimento de DC baseado em vacinas contra doenças infecciosas e tumores. No entanto, esta linha de pesquisa tem sido severamente impedido pela dificuldade de transfecting DCs primários 4.
Métodos de transdução de vírus, como o sistema lentiviral, são normalmente utilizados, mas carregam muitas limitações, como a complexidade e bio-perigosos risco (com os custos associados) 5,6,7,8. Além disso, a entrega de produtos do gene viral aumenta a imunogenicidade dos transduzidas DCs 9,10,11,12. Eletroporação tem sido usado com resultados mistos 13,14,15, mas somos os primeiros a relatar o uso de um protocolo de transfecção de alto rendimento e demonstrar conclusivamente a sua utilidade.
Neste relatório, resumem um protocolo otimizado comercial para high-throughput transfecção de DCs humanas primárias, com limitada toxicidade celular e uma ausência de maturação DC 16. Eficiência de transfecção (GFP de plasmídeo) e viabilidade celular foram mais de 50% e 70%, respectivamente. FACS análise estabeleceu a ausência de aumento da expressão do CD86 e marcadores de maturação MHCII em células transfectadas, enquanto qRT-PCR não demonstrou upregulation de IFNβ. Usando este protocolo eletroporação, que fornecem evidências de sucesso da transfecção com siRNA DCs e eficaz knock down do gene alvo RIG-I, um receptor de reconhecimento chave viral 16,17, em ambos os mRNA e os níveis de proteína.
Protocol
1. O programa Amaxa 96 poços Nucleofector shuttle
- Abra um arquivo novo parâmetro.
- Selecione o número de poços que será utilizado para a transfecção padrão, arrastando o cursor sobre o diagrama de placa de 96 poços. Use um mínimo de três poços para piscina para cada amostra experimental.
- Introduza o código do programa: em part1 selecionar 'FF' e em part2 selecionar '168 'do pull down menus
- De 'monócitos humanos, "Solução caixa de seleção
- Na Opção de Controle, selecione 'standard'.
- Clique em Aplicar.
- Para incluir um controle não-transfecção, selecione poços adicionais a partir do diagrama conforme necessário e, em seguida, escolha a opção 'Sem Controle Program' Opção de Controle e clique em Aplicar.
- Selecione qualquer cavidades remanescentes não utilizadas no diagrama de placa e clique em Cancele.
2. Prepare DCs para transfecção
- Todo o trabalho deve ser feito sob condições estéreis em uma capa de cultura de células, sempre que possível. Preparar a solução adicionando nucleofection de 96 poços suplemento para monócitos humanos de 96 poços Solução Nucleofector na proporção de 450 a 2025. Misture e deixe à temperatura ambiente. Você vai precisar de 20μl de solução nucleofection por poço. Faça um excesso de 10% para permitir a pipetagem erro.
- Coloque o número de módulos nucleocuvette que você precisa na placa nucleocuvette no ie orientação correta de inserir o primeiro em que as linhas 1 e 2.
- Determinar o número de DCs necessários para a sua experiência em cálculo de 500.000 células por poço e pellet por centrifugação a 400g por 10min. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender as células na solução nucleofection cuidado pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
- Divida o volume correto de células ressuspendido em eppendorfs etiquetados para o tratamento especial por exemplo GLO e RIG-I.
- Adicionar siRNA 0.25μg por 500.000 células e misture por pipetagem. Use siRNA não-alvo na sua amostra de controlo não-transfecção.
- Pipetar 20μl das misturas acima para os módulos de nucleocuvette, de acordo com seu layout experimental, garantindo que o líquido é enviado para o fundo do poço.
- Cobrir a placa nucleocuvette com a tampa e toque a placa sobre uma superfície dura um par de vezes para ajudar a garantir a remoção de bolhas de ar.
3. Transfectar DCs
- Inserir placa na bandeja de shuttle Nucleofector de 96 poços, clique em Enviar e, em seguida, começar.
- Acompanhar o progresso do processo de transfecção no visor lap top, uma cruz negra sobre um fundo verde significa uma transfecção bem sucedido em que o bem, ao passo que uma barra preta em um fundo vermelho significa que ele não teve sucesso.
- Após a conclusão do processo de transfecção, retire a placa e adicionar Pipete 80 da DC meio de crescimento a cada poço usando uma pipeta multicanal.
- Incubar placa por 10 min a 37 ° C e 5% CO 2.
- Transferir o volume de 100μl do nucleocuvettes em tubos de matriz contendo 100μl de pré-aquecido meio de crescimento DC, mantendo a orientação correta.
- Retire e deite fora os tubos onde transfecção não ocorreu.
- Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 para o intervalo de tempo de 24 horas ou outro desejado.
4. Infectar as células com NDV
- Remova os tubos da matriz da incubadora para a capa de cultura de células e tubos piscina para cada amostra experimental em eppendorfs
- Agregar as células delicadamente girando em uma centrífuga desk top por 5 minutos e retire o sobrenadante.
- Ressuspender as células no soro livre de meio de crescimento contendo NDV em um MOI de 1 e incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 45 min, com eppendorfs vagamente coberta de uma forma estéril.
- Adicionar 900μl de meio de crescimento DC, e re-incubar por 8-10 h.
5. Células colheita
- Células de pelotas por fiação eppendorfs em uma centrífuga desk top e remover o sobrenadante.
- Células colheita para RNA ou extração de proteínas de acordo com o protocolo.
6. Resultados representativos:
Usando nosso protocolo otimizado que transfectadas DCs com RIGI-targeting siRNA por 24 horas e, em seguida, as células infectadas com o NDV (a paramixovírus detectado pelo RIG-I) para estimular o trajeto resposta interferon. Por qRT-PCR demonstramos knock down do gene em 75% no nível de transcrição. Observamos também uma redução semelhante na expressão de IFNβ, que é uma a jusante efetoras de RIG-I na cascata de sinalização IFN. Além disso, observou-se que a expressão de IFNβ em não-infectados, controle de células transfectadas não foi detectado enquanto o de MxA, um gene de resposta IFNβ a jusante, foi mínima (Figura 1A).
A transfecção segunda DCs com RIGI-targeting siRNA foi realizada utilizando células suficientes para incluir a análise de Western blot. Onde oRT-PCR, os resultados foram semelhantes ao que vimos anteriormente (62% e 66% de derrubar RIG-I e expressão IFNβ respectivamente) (Figura 1B), o Western blot sondado para RIG-I revelou que a expressão desse gene foi completamente bloqueada (Figura 1C).
Figura 1. (A) MoDCs foram transfectadas com siRNA alvo tanto RIG-I ou siRNA GLO inespecíficos eo efeito sobre a expressão de RIG-I IFNβ e MxA determinada por qRT-PCR. O protocolo de transfecção utilizado um buffer de monócitos específico e um programa de nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Após a incubação por 24 h, as células transfectadas ou foram infectadas com o NDV (+) ou para a esquerda não infectados (-). Após incubação de mais de 10 h, as células foram colhidas e os níveis de Transcrição RNA extraído representam os resultados de dois experimentos replicar. Tomado de Bowles et al 16. (B) MoDCs obtidos a partir de um revestimento buffy diferentes, usado para a Figura 1A foram novamente transfectadas com um RIG-I-alvo siRNA siRNA ou GLO inespecífica utilizando o protocolo de transfecção mesmo que acima. Um controle adicional usando MoDCs untransfected foi incorporado ao experimento. Após uma 24 horas de incubação todas as células foram infectadas com o NDV e incubados por um h mais 10 antes de ser colhida para ambos RNA e extração de proteínas. Níveis de transcrição de RIG-I IFNβ e MxA conforme determinado pelo qRT-PCR representam os resultados de dois experimentos replicar. Tomado de Bowles et al 16. (C) Lisados de células descrito na Figura 1B acima foram analisados por Western blot. Pistas 1 e 2, lisados de células untransfected; faixas 3 e 4, lisados de células transfectadas siRNA GLO; pistas 5 e 6, lisados de células transfectadas com siRNA RIG-I-alvo. As amostras foram sondados para RIG-I e também GAPDH (como um controle de carga) e foram executados em duplicata. Tomado de Bowles et al 16.
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Discussion
Transfecção eficiente de células dendríticas naïve primário é importante para a análise de elevada capacidade e engenharia reversa de celulares vias inflamatórias nesta célula-chave mediando a transição inata-imune adaptativo. No entanto, a maioria dos investigadores acham que essas células são difíceis de transfecção tanto de forma eficiente e sem a maturação das células transfecção procedimento de indução ao usar técnicas de transfecção padrão. Nós investigamos se essas limitações poderiam ser superadas através da optimização de alto rendimento usando um protocolo simultânea, sistema de transfecção independentes de 96 poços comerciais nuclear (Lonza).
Usando fluorescentes separação de células ativadas (FACS), medimos um plasmídeo expressando GFP-como um marcador para a eficiência de transfecção e imunorreatividade CD86 e MHCII como uma leitura de maturação celular. Uma série de experimentos avaliando buffers e programas de eletroporação, em última análise identificou condições mostrando> transfecção de 50% e ausência de aumento dos marcadores de maturação.
Para investigar possível ativação de DCs pelo processo nucleofection analisamos os níveis de expressão de IFNβ e sua MxA gene a jusante resposta a nível mRNA. Expressão MxA é extremamente sensível à produção IFNβ e pode ser usado como um bioensaio para detectar níveis muito baixos de o cytokine18. Através de qRT-PCR vimos nenhuma expressão detectável IFNβ mas ver alguns upregulation de MxA indicando acima linha de base de indução IFNβ. No entanto, este upregulation mínimo de MxA não-infectados, controle de células transfectadas foi insignificante em comparação ao que resulta do vírus mediada por estimulação da cascata de sinalização IFNβ (Figura 1A) e confirmou que poderíamos usar com sucesso o nosso protocolo de transfecção nucleoporation DCs sem ativar -los para qualquer nível significativo.
A utilidade do nosso protocolo otimizado foi confirmada por análise de Western blot. Transfecção de DCs com siRNA alvo RIG-I causou uma perda completa de proteínas RIG-I detectável (Figura 1C). Devemos observar que, para perturbação de sucesso de outros genes, a quantidade de siRNA utilizado e tempo de transfecção pode ter que ser otimizado.
Ao nosso conhecimento, este trabalho permite, pela primeira vez o projeto de alto rendimento de perda de função de estudos no ensino primário DCs humanas, resolvendo assim um impedimento difícil de investigação neste domínio. Isso deve proporcionar novas oportunidades para o estudo da DC sinalização e podem contribuir para o avanço no desenvolvimento de DC-based imunoterapias.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O projecto foi apoiado pelo NIH Contrato n º HHSN2662000500021C NIAID. Agradecemos Ming Chen por sua assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
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