Summary
We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.
Abstract
Dendritische cellen (DC's) kan worden beschouwd als schildwachten van het immuunsysteem, die een cruciale rol spelen in de initiatie en reactie op de infectie 1. Detectie van pathogene antigen door naïeve DCs is door middel van patroonherkenning receptoren (PRRS), die in staat zijn om specifieke geconserveerd structuren aangeduid als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPS) te erkennen. Detectie van PAMPs door DCs triggers een intracellulaire signalisatie cascade resulteert in hun activering en transformatie om te rijpen DCs. Dit proces wordt doorgaans gekenmerkt door de productie van type 1 interferon samen met andere pro-inflammatoire cytokines, opregulatie van celoppervlaktemerkers zoals MHCII en CD86 en de migratie van de volwassen DC om drainerende lymfeklieren, waar de interactie met T-cellen initieert de adaptieve immuunrespons 2, 3. Zo, DC koppeling het aangeboren en adaptieve immuunsysteem.
De mogelijkheid om de moleculaire netwerken die ten grondslag liggen DC naar aanleiding van de verschillende ziekteverwekkers ontleden is cruciaal voor een beter begrip van de regeling van deze signaalwegen en hun geïnduceerde genen. Het moet ook helpen de ontwikkeling van de DC-gebaseerde vaccins tegen infectieziekten en tumoren. Echter, deze lijn van onderzoek ernstig belemmerd door de moeilijkheid van het transfecteren primaire DCs 4.
Virus transductie methoden, zoals het lentivirale-systeem, worden doorgaans gebruikt, maar dragen vele beperkingen, zoals de complexiteit en de bio-gevaarlijk risico (met de daaraan verbonden kosten) 5,6,7,8. Daarnaast is de levering van virale gen-producten verhoogt de immunogeniciteit van de getransduceerde DCs 9,10,11,12. Elektroporatie is gebruikt met gemengde resultaten 13,14,15, maar wij zijn de eersten die het gebruik van een high-throughput transfectie protocol rapport en overtuigend aan te tonen het nut.
In dit rapport vatten we een optimale commerciële protocol voor high-throughput transfectie van menselijke primaire DCs, met een beperkte cel toxiciteit en een afwezigheid van DC rijping 16. Transfectie-efficiëntie (van GFP plasmide) en de levensvatbaarheid van de cellen werden meer dan 50% en 70% respectievelijk. FACS-analyse opgesteld van de afwezigheid van een toename van expressie van de rijping markers CD86 en MHCII in getransfecteerde cellen, terwijl qRT-PCR toonden geen opregulatie van IFNβ. Met behulp van deze elektroporatie protocol, we leveren het bewijs voor een succesvolle transfectie van DCs met siRNA en effectief naar beneden slaan van gerichte gen RIG-I, een belangrijke erkenning virale receptor 16,17, zowel op mRNA-en eiwitniveau.
Protocol
1. Programmeer de Amaxa 96 goed shuttle Nucleofector
- Open een nieuwe parameter bestand.
- Selecteer het aantal putten zul je voor de standaard transfectie worden met behulp van door het slepen van de cursor over de 96 wells plaat diagram. Gebruik een minimum van drie waterputten tot het zwembad voor elke experimentele monster.
- Voer de code-programma: in part1 selecteer 'FF' en in part2 kies '168 'uit het pull-down menu's
- Vanuit 'monocyt, menselijke' Solution selectievakje
- Onder controle optie te selecteren 'standaard'.
- Klik op Toepassen.
- Om een no-transfectie controle, selecteert u verder putten uit het diagram zoals vereist en kies vervolgens 'No Program Control' van Control Option en klik op Toepassen.
- Selecteer een resterende, ongebruikte putten op de plaat diagram en klik op undefine.
2. Bereid DCs voor de transfectie
- Al het werk moet worden gedaan onder steriele omstandigheden in een celkweek kap waar mogelijk. Bereid de nucleofection oplossing door het toevoegen van 96-well aanvulling op de Human monocyt 96-well Nucleofector Solution in de verhouding van 450 tot 2025. Meng en laat op te warmen tot kamertemperatuur. U moet 20μl van nucleofection oplossing per goed. Maak een overmaat van 10% toe te staan voor het pipetteren fout.
- Plaats van het aantal nucleocuvette modules die u nodig in de nucleocuvette plaat in de juiste richting wil zeggen het plaatsen van de eerste in de rijen 1 en 2.
- Bepaal het aantal DC's nodig zijn voor uw experiment berekening op 500.000 cellen per well en de pellet door centrifugeren bij 400g voor 10min. Verwijder voorzichtig het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in de nucleofection oplossing door voorzichtig en neer te pipetteren een paar keer.
- Verdeel de juiste hoeveelheid van de geresuspendeerde cellen in eppendorfs bestemd is voor de bijzondere behandeling bijvoorbeeld GLO en RIG-I.
- Voeg 0.25μg siRNA per 500.000 cellen en meng door pipetteren. Gebruik niet-targeting siRNA in uw no-transfectie controlemonster.
- Pipet 20μl van de bovenstaande mengsels in de nucleocuvette modules, afhankelijk van uw experimentele lay-out, is het waarborgen van de vloeistof geleverd aan de bodem van de put.
- Bedek de nucleocuvette plaat met de deksel en tik op de plaat op een hard oppervlak een paar keer om ervoor te zorgen verwijderen van luchtbellen.
3. Transfecteren DC's
- Plaats plaat in de Nucleofector 96-wells shuttle lade, klik op Upload en dan beginnen.
- Volg de voortgang van de transfectie proces op de lap top scherm, een zwart kruis op een groene achtergrond betekent een succesvolle transfectie in die goed, terwijl een zwarte balk op een rode achtergrond betekent dat het geen succes was.
- Na afloop van de transfectie-proces, verwijder de plaat en voeg 80μl van DC groeimedium aan elk putje met behulp van een multichannel pipet.
- Incubeer plaat gedurende 10 min bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Breng de 100μl volume van de nucleocuvettes in de matrix buizen die 100μl van de voorverwarmde DC groeimedium, het onderhouden van de juiste richting.
- Verwijder en gooi die buizen waar transfectie deed zich niet voor.
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 24 uur of een andere gewenste tijdsinterval.
4. Cellen infecteren met NDV
- Verwijder de matrix buizen van de couveuse naar de celcultuur motorkap en het zwembad buizen voor elke experimentele monster in eppendorfs
- Pellet de cellen voorzichtig door het draaien in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
- Resuspendeer de cellen in serum-vrij groei medium met NDV op een MOI van 1 en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 45 min, met eppendorfs losjes bedekt met een steriele manier.
- Voeg 900μl van DC groeimedium, en re-incubeer voor 8-10 uur
5. Oogst cellen
- Pellet-cellen door het draaien van eppendorfs in een tafelblad centrifuge en verwijder supernatant.
- Oogst cellen voor RNA of eiwit-extractie volgens uw protocol.
6. Representatieve resultaten:
Met behulp van onze geoptimaliseerde protocol we getransfecteerd DCs met Rigi-targeting siRNA gedurende 24 uur en vervolgens geïnfecteerde cellen met de NDV (een paramyxovirus gedetecteerd door RIG-I) aan de interferon reactie pad te stimuleren. Door qRT-PCR-analyse toonden we knock down van het gen met 75% op de transcriptie niveau. We hebben ook waargenomen een overeenkomstige vermindering in de expressie van IFNβ, die een downstream-effector van RIG-I is in de IFN signaalcascade. Verder hebben we geconstateerd dat de expressie van IFNβ in niet-geïnfecteerde, controle-getransfecteerde cellen niet detecteerbaar was, terwijl die van MXA, een IFNβ stroomafwaarts respons-gen, was minimaal (Figuur 1A).
Een tweede transfectie van DCs met RIGI-gerichte siRNA werd uitgevoerd met behulp van genoeg cellen om Western blot-analyse op te nemen. Indien deRT-PCR resultaten waren vergelijkbaar met wat we zagen eerder (62% en 66% knock down van de RIG-I en IFNβ uitdrukking respectievelijk) (Figuur 1B), de Western blot gezocht heeft naar RIG-I bleek dat de expressie van dit gen was volledig geblokkeerd (figuur 1C).
Figuur 1. (A) MoDCs werden getransfecteerd met ofwel siRNA gericht op RIG-I of aspecifieke GLO siRNA en het effect op de expressie van RIG-I, IFNβ en MXA bepaald door qRT-PCR. De transfectie protocol dat wordt gebruikt een monocyt-specifieke buffer en nucleoporation programma FF168 (Lonza Walkersville Inc) Na incubatie gedurende 24 uur werden de getransfecteerde cellen ofwel geïnfecteerd met NDV (+) of links niet-geïnfecteerde (-). Na een verdere incubatie gedurende 10 uur werden cellen geoogst en RNA geëxtraheerd Transcript niveaus vertegenwoordigen de resultaten van twee experimenten te repliceren. Genomen van Bowles et al. 16. (B) MoDCs verkregen uit een andere buffy coat zoals gebruikt voor de figuur 1A waren opnieuw getransfecteerd met ofwel RIG-I-targeting siRNA of aspecifieke GLO siRNA transfectie met hetzelfde protocol als hierboven. Een extra controle met behulp van ongetransfecteerde MoDCs werd opgenomen in het experiment. Na een 24 uur incubatie van alle cellen werden geïnfecteerd met NDV en geïncubeerd voor nog eens 10 uur voordat het geoogst voor zowel RNA en eiwit-extractie. Transcriptie niveaus van RIG-I, IFNβ en MXA, zoals bepaald door qRT-PCR vertegenwoordigen de resultaten van twee experimenten te repliceren. Genomen van Bowles et al. 16. (C) Lysaten van cellen wordt beschreven in Figuur 1b hierboven werden geanalyseerd door Western blot. Lanen 1 en 2, lysaten van ongetransfecteerde cellen, lanen 3 en 4, lysaten van GLO siRNA getransfecteerde cellen, lanen 5 en 6, lysaten van cellen getransfecteerd met RIG-I-targeting siRNA. Monsters werden gezocht heeft naar RIG-I en ook GAPDH (als een laad-controle) en werden uitgevoerd in duplo. Genomen van Bowles et al. 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efficiënte transfectie van naïeve primaire dendritische cellen is belangrijk voor de high throughput analyse en reverse engineering van cellulaire inflammatoire paden in deze sleutel cel bemiddelt het aangeboren-adaptieve immuun overgang. Echter, de meeste onderzoekers vinden dat deze cellen zijn moeilijk te efficiënt en zonder de transfectie procedure inducerende celrijping transfecteren wanneer er gebruik wordt standaard transfectie technieken. We hebben onderzocht of deze beperkingen kunnen worden overwonnen door een hoge doorvoersnelheid protocol optimalisatie van het gebruik van een gelijktijdige, onafhankelijke 96-well commerciële nucleaire transfectie systeem (Lonza).
Met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), meten we een GFP expressie plasmide als een marker voor transfectie-efficiëntie en CD86 en MHCII immunoreactiviteit als een uitlezing van de cel rijping. Een reeks van experimenten evalueren van buffers en elektroporatie programma's uiteindelijk geïdentificeerd voorwaarden met> 50% transfectie en een gebrek aan toename van de rijping markers.
Om verdere mogelijke activering van DCs te onderzoeken door de nucleofection proces dat we de expressie niveaus van IFNβ en de downstream reactie gen MXA geanalyseerd op het mRNA-niveau. MXA expressie is uiterst gevoelig voor IFNβ productie en kan worden gebruikt als een bioassay tot zeer lage niveaus van sporen de cytokine18. Door middel van qRT-PCR-analyse zagen we geen waarneembare IFNβ expressie, maar deed wat opregulatie van MXA hetgeen wijst op boven-baseline IFNβ inductie te zien. Echter deze minimale opregulatie van MXA in niet-geïnfecteerde, controle-getransfecteerde cellen was te verwaarlozen in vergelijking met die welke voortvloeit uit virus-gemedieerde stimulatie van de IFNβ signaalcascade (Figuur 1A) en bevestigde dat we met succes konden onze nucleoporation-protocol gebruiken om ontwikkelingslanden te transfecteren zonder activering hen een significant niveau.
Het nut van onze geoptimaliseerde protocol werd bevestigd door Western blot-analyse. Transfectie van DC's met siRNA gericht op RIG-I veroorzaakte een volledig verlies van detecteerbaar RIG-I-eiwit (Figuur 1C). We moeten er rekening mee dat voor een succesvolle verstoring van andere genen, de hoeveelheid van siRNA gebruikt en de lengte van transfectie tijd kan worden geoptimaliseerd.
Voor zover wij weten, dit werk kan voor de eerste keer het ontwerp van high-throughput verlies-van-functie studies in primaire menselijke DC's, dus het oplossen van een moeilijk belemmering voor onderzoek op dit gebied. Dit moet nieuwe kansen voor de studie van de DC-signalering en kunnen bijdragen tot vooruitgang in de ontwikkeling van DC-gebaseerde immunotherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het project werd ondersteund door de NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C. Wij danken Ming Chen voor zijn technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
