Summary
Nous présentons notre protocole optimisé nucléofection à haut débit comme un moyen efficace de transfection humaines primaires dérivées de monocytes des cellules dendritiques avec soit l'ADN plasmidique ou siRNA sans causer la maturation des cellules. En outre, nous fournir des preuves pour faire taire les siARN réussie de gène ciblé RIG-I à la fois au niveau ARNm et des protéines.
Abstract
Cellules dendritiques (CD) peuvent être considérés comme des sentinelles du système immunitaire qui jouent un rôle critique dans son initiation et une réponse à l'infection. Détection de l'antigène pathogènes par les CD naïve est à travers des récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR) qui sont capables de reconnaître des structures spécifiques conservé appelé pathogène motifs moléculaires associés (PAMPS). Détection des PAMPs par les CD déclenche une cascade de signalisation intracellulaire entraîne leur activation et de transformation pour les PED matures. Ce processus est généralement caractérisé par une production d'interféron de type 1 avec d'autres cytokines pro-inflammatoires, la régulation positive des marqueurs de surface cellulaire, comme CMHII et CD86 et la migration des DC matures dans les ganglions lymphatiques drainant, où l'interaction avec les cellules T initie la réponse immunitaire adaptative 2, 3. Ainsi, les PED relier les systèmes immunitaire innée et adaptative.
La capacité à disséquer les réseaux moléculaires qui sous-tendent la réponse à divers pathogènes DC est cruciale pour une meilleure compréhension de la régulation de ces voies de signalisation et de leurs gènes induits. Il devrait également aider à faciliter le développement de vaccins à base de DC contre les maladies infectieuses et les tumeurs. Cependant, cette ligne de recherche a été gravement entravée par la difficulté de transfecter des primaires PED 4.
Méthodes de transduction virus, tels que le système lentiviral, sont généralement utilisés, mais portent de nombreuses limitations telles que la complexité et de la bio-dangereux risque (avec les coûts associés) 5,6,7,8. En outre, la livraison de produits de gènes viraux augmente l'immunogénicité de ces transduites PED 9,10,11,12. L'électroporation a été utilisée avec des résultats mitigés 13,14,15, mais nous sommes les premiers à signaler l'utilisation d'un protocole de transfection à haut débit et de manière concluante démontrer son utilité.
Dans ce rapport, nous résumons un protocole optimisé commerciale pour la transfection à haut débit des humains PED primaire, avec une toxicité cellulaire limitée et une absence de maturation des DC 16. Efficacité de la transfection (de plasmide GFP) et la viabilité des cellules ont été plus de 50% et 70% respectivement. FACS analyse a établi l'absence d'augmentation de l'expression des marqueurs de la maturation du CD86 et CMH II dans des cellules transfectées, tandis qRT-PCR n'a démontré aucune régulation à la hausse des IFNβ. En utilisant ce protocole d'électroporation, nous fournir des preuves pour la transfection réussie des PED avec le siRNA et efficace abattre des gènes ciblés RIG-I, un récepteur de reconnaissance clés virale 16,17, à la fois l'ARNm et de protéine.
Protocol
1. Programme du 96 Amaxa ainsi Nucleofector navettes
- Ouvrez un nouveau fichier de paramètres.
- Sélectionnez le nombre de puits que vous allez utiliser pour la transfection standards en faisant glisser le curseur sur le diagramme de plaque de 96 puits. Utiliser un minimum de trois puits à la piscine pour chaque échantillon expérimental.
- Entrez le code du programme: en part1 sélectionnez 'FF' et choisissez part2 '168 'à partir des menus déroulants
- De la boîte de solutions, sélectionnez 'monocytes, humaine »
- Selon l'option de configuration, sélectionnez «standard».
- Cliquez sur Appliquer.
- Pour inclure un contrôle sans transfection, sélectionnez puits supplémentaires à partir du schéma tel que requis, puis choisissez «No Control Program 'de l'option de configuration et cliquez sur Appliquer.
- Sélectionnez l'un des puits inutilisés sur le diagramme et cliquez sur la plaque undefine.
2. Préparer les PED pour la transfection
- Tout travail doit être effectué dans des conditions stériles sous une hotte de culture cellulaire lorsque cela est possible. Préparer la solution en ajoutant nucléofection de 96 puits complément de monocytes humains de 96 puits Solution Nucleofector dans le rapport de 450 à 2025. Mélanger et laisser réchauffer à température ambiante. Vous aurez besoin de 20 pi de solution nucléofection par puits. Faire un excès de 10% pour permettre de pipetage erreur.
- Placez le nombre de modules nucleocuvette vous avez besoin dans la plaque nucleocuvette dans la bonne orientation à savoir insérer le premier pour les lignes 1 et 2.
- Déterminer le nombre de PED nécessaire pour le calcul de votre expérience sur les 500 000 cellules par puits et de culot par centrifugation à 400g pendant 10min. Retirer délicatement le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans la solution par un léger pipetage nucléofection haut et en bas à quelques reprises.
- Divisez le volume correct de cellules en suspension dans eppendorfs étiquetés pour le particulier par exemple le traitement GLO et RIG-I.
- Ajouter siARN 0.25μg par 500.000 cellules et mélanger par pipetage. Non-utilisation de siRNA ciblant dans votre échantillon de contrôle sans-transfection.
- Pipeter 20 pi du mélange ci-dessus dans les modules nucleocuvette, en fonction de votre configuration expérimentale, assurant que le liquide est livré au fond du puits.
- Recouvrir la plaque nucleocuvette avec le couvercle et appuyez sur le plateau sur une surface dure une couple de fois pour aider à assurer l'élimination des bulles d'air.
3. Transfecter les PED
- Insérer la plaque dans le bac de navette de 96 puits Nucleofector, cliquez sur Télécharger et puis démarrer.
- Suivez les progrès des processus de transfection sur l'écran du lap top, une croix noire sur un fond vert signifie une transfection réussie dans ce puits, tandis qu'une barre noire sur un fond rouge signifie qu'il a échoué.
- A l'issue du processus de transfection, enlever la plaque et ajouter 80μl de milieu de croissance DC à chaque puits en utilisant une pipette multicanaux.
- Incuber la plaque pendant 10 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Transférer le volume 100 ul de la nucleocuvettes dans des tubes contenant 100 pi de la matrice pré-chauffé milieu de croissance DC, le maintien de l'orientation correcte.
- Retirez et jetez les tubes où la transfection n'a pas eu lieu.
- Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pour l'intervalle de temps ou d'autres 24h désiré.
4. Infecter les cellules avec NDV
- Retirer les tubes de matrice de l'incubateur de la hotte de culture cellulaire et piscine tubes pour chaque échantillon expérimental dans eppendorfs
- Pellet les cellules doucement par rotation dans une centrifugeuse de bureau pendant 5 min et retirez surnageant.
- Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance sans sérum contenant NDV à une MOI de 1 et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 45 min, avec eppendorfs vaguement recouverte d'une manière stérile.
- Ajouter 900μl de milieu de croissance DC, et re-incuber pendant 8-10 h.
5. Récolte des cellules
- Cellules Pellet en faisant tourner eppendorfs dans une centrifugeuse de bureau et retirer le surnageant.
- Cellules de récolte pour l'ARN ou de l'extraction des protéines en fonction de votre protocole.
6. Les résultats représentatifs:
En utilisant notre protocole optimisé, nous transfectées avec les PED RIGI ciblage siRNA pour 24 h et ensuite infecté les cellules avec NDV (un paramyxovirus détecté par RIG-I) pour stimuler la voie de réponse interféron. Par QRT-PCR, nous avons démontré renverser du gène de 75% au niveau de la transcription. Nous avons également observé une réduction similaire de l'expression de IFNβ, qui est un effecteur en aval de RIG-I dans la cascade de signalisation IFN. Par ailleurs, nous avons observé que l'expression de IFNβ chez les non-infectés, le contrôle de cellules transfectées n'était pas détectable alors que celle de MxA, un gène de réponse IFNβ aval, a été minime (figure 1A).
Une seconde transfection des PED avec RIGI ciblage siRNA a été réalisée en utilisant suffisamment de cellules pour y inclure une analyse Western blot. Lorsque leRT-PCR résultats étaient semblables à ce que nous avons vu précédemment (62% et 66% d'abattre RIG-I et d'expression IFNβ respectivement) (figure 1B), le Western blot sondé pour la RIG-I a révélé que l'expression de ce gène avait été complètement bloqué (figure 1C).
Figure 1. (A) ont été transfectées avec MoDCs soit siRNA ciblant RIG-I ou siRNA GLO non spécifique et l'effet sur l'expression de la RIG-I, IFNβ et MxA déterminée par qRT-PCR. Le protocole de transfection utilisé un tampon de monocytes spécifiques et FF168 programme nucleoporation (Lonza Walkersville Inc) Après incubation pendant 24 h, les cellules transfectées ont été soit infectés par le NDV (+) ou vers la gauche non infectées (-). Après une incubation de 10 h, les cellules ont été récoltées et les niveaux d'ARN extrait Transcription représentent les résultats de deux expériences répétées. Tiré de Bowles et al 16 (B). MoDCs obtenu à partir d'un pelage différent de Buffy que celles utilisées pour la figure 1A ont de nouveau été transfectées avec RIG-I-ciblage siRNA ou siARN GLO non spécifiques en utilisant le protocole de transfection même que ci-dessus. Un contrôle supplémentaire à l'aide MoDCs non transfectées a été incorporé dans l'expérience. Après une incubation de 24 h toutes les cellules ont été infectées par le NDV et incubé pendant encore 10 h avant d'être récolté à la fois pour l'ARN et l'extraction des protéines. Niveaux Transcription de RIG-I, IFNβ et MxA tel que déterminé par qRT PCR représentent les résultats de deux expériences répétées. Tiré de Bowles et al 16. (C) des lysats de cellules décrit dans la figure 1B ci-dessus ont été analysés par Western blot. Les pistes 1 et 2, des lysats de cellules non transfectées; pistes 3 et 4, des lysats de cellules transfectées siARN GLO; voies 5 et 6, des lysats de cellules transfectées avec RIG-I-ciblage siRNA. Les échantillons ont été sondées pour RIG-I et aussi GAPDH (comme un contrôle du chargement) et ont été analysés en double. Tiré de Bowles et al 16.
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Discussion
Transfection efficace des cellules dendritiques naïves primaire est importante pour l'analyse à haut débit et l'ingénierie inverse des voies cellulaires inflammatoires dans cette cellule clé de la médiation de la transition innée-immune adaptative. Cependant, la plupart des chercheurs estiment que ces cellules sont difficiles à transfecter fois efficace et sans la maturation de transfection de cellules induisant la procédure lors de l'utilisation des techniques de transfection standard. Nous avons recherché si ces limitations peuvent être surmontées par une optimisation de débit en utilisant un protocole de haut simultanée, système indépendant de 96 puits de transfection commerciales nucléaire (Lonza).
Utiliser le tri de cellules fluorescentes (FACS), nous avons mesuré une GFP-plasmide exprimant comme un marqueur de l'efficacité de transfection et l'immunoréactivité CD86 et CMH II comme une lecture de la maturation des cellules. Une série d'expériences évaluant les tampons et les programmes de l'électroporation finalement identifié les conditions de transfection montrant> 50% et une absence d'augmentation des marqueurs de maturation.
Pour approfondir l'activation possible des PED par le processus nucléofection nous avons analysé les niveaux d'expression de IFNβ et ses MxA aval du gène de réponse au niveau des ARNm. MxA d'expression est extrêmement sensible à la production et de IFNβ peut être utilisé comme un test biologique pour détecter de très faibles niveaux de l'cytokine18. Grâce qRT-PCR, nous avons vu aucune expression détectable IFNβ mais ne voir régulation positive des MxA indiquant ainsi l'induction IFNβ ci-base. Cependant, cette régulation à la hausse minime de MxA chez les non-infectés, le contrôle de cellules transfectées a été négligeable par rapport à celui résultant de virus de la médiation de stimulation de la cascade de signalisation IFNβ (figure 1A) et a confirmé que nous pouvions utiliser avec succès notre protocole nucleoporation à transfecter PED sans activer à un niveau significatif.
L'utilité de notre protocole optimisé a été confirmée par Western blot. La transfection de siRNA ciblant les PED avec RIG-I a causé une perte complète de RIG-I détectable de protéines (figure 1C). Notons que pour la perturbation de succès d'autres gènes, la quantité de siARN utilisées et la durée de la transfection peut être optimisé.
À notre connaissance, ce travail permet pour la première fois la conception du haut débit une perte de fonction des études dans l'enseignement primaire CD humaines, résolvant ainsi un obstacle difficile à la recherche dans ce domaine. Cela devrait offrir de nouvelles possibilités pour l'étude de CC de signalisation et peuvent contribuer à l'avancement dans le développement de DC à base d'immunothérapies.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par le NIH NIAID Marché n HHSN2662000500021C. Nous remercions Ming Chen pour son assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
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