Summary
Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.
Abstract
Dendritische Zellen (DCs) können als Wächter des Immunsystems, die eine kritische Rolle bei der Einleitung und Reaktion auf eine Infektion 1 sein. Nachweis von pathogenen Antigen, das durch naive DCs wird durch pattern recognition receptors (PRR), die in der Lage, bestimmte konservierte Strukturen bezeichnet als pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) zu erkennen sind. Erkennung von PAMPs von DCs löst eine intrazelluläre Signalkaskade führt deren Aktivierung und Umwandlung zu reifen DCs. Dieser Prozess wird in der Regel durch die Produktion von Typ-1-Interferon gemeinsam mit anderen proinflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet ist, Hochregulation von Zelloberflächenmarker wie MHCII und CD86 und Migration der reifen DC zu drainierenden Lymphknoten, wo die Interaktion mit T-Zellen löst die adaptive Immunantwort 2, 3. So verlinken DCs der angeborenen und adaptiven Immunsystem.
Die Fähigkeit, die zugrunde liegenden molekularen Netzwerke DC Reaktion auf verschiedene Krankheitserreger sezieren ist entscheidend für ein besseres Verständnis der Regulation dieser Signalwege und ihrer induzierten Gene. Es sollte auch dazu beitragen, die Entwicklung von DC-basierte Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten und Tumoren. Allerdings hat diese Linie der Forschung ist stark von der Schwierigkeit der Transfektion von primären DCS 4 behindert.
Virus Transduktion Methoden, wie die lentiviralen Systems werden in der Regel verwendet, tragen aber viele Einschränkungen wie Komplexität und bio-Ex-Risiko (mit den damit verbundenen Kosten) 5,6,7,8. Darüber hinaus erhöht die Lieferung von viralen Genprodukte die Immunogenität dieser transduzierten DCs 9,10,11,12. Die Elektroporation wurde mit gemischten Ergebnissen 13,14,15 verwendet worden, aber wir sind die ersten, die Verwendung einer High-Throughput-Transfektionsprotokolls Bericht und schlüssig nachweisen seine Nützlichkeit.
In diesem Bericht fassen wir ein optimiertes Protokoll für die kommerziellen High-Throughput-Transfektion von primären humanen DCs, mit begrenzten Zelltoxizität und das Fehlen von DC Reifung 16. Transfektionseffizienz (von GFP-Plasmid) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mehr als 50% bzw. 70%. FACS-Analyse wurde das Fehlen Erhöhung der Expression der Reifung Marker CD86 und MHCII in transfizierten Zellen, während qRT-PCR zeigte keine Hochregulation von IFNβ. Mit dieser Elektroporation Protokoll, bieten wir Beweise für eine erfolgreiche Transfektion von DCs mit siRNA und effektive knock down von gezielten Gen RIG-I, ein wichtiger viraler recognition receptor 16,17, sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.
Protocol
1. Programmieren Sie die Amaxa 96 well Shuttle Nucleofector
- Öffnen Sie eine neue Parameter-Datei.
- Wählen Sie die Anzahl der Bohrlöcher Sie für Standard-Transfektion verwenden, indem Sie den Cursor über den 96-Well-Platte Diagramm wird. Verwenden Sie ein Minimum von 3 Brunnen zu bündeln für jede experimentelle Probe.
- Geben Sie den Programm-Code: in part1 wählen 'FF' und in part2 wählen '168 'aus dem Pulldown-Menüs
- Von Solution Box wählen Sie "Monozyten, Mensch '
- Under Control Option wählen "Standard".
- Klicken Sie auf Anwenden.
- Um einen nicht-Transfektion Kontrolle, wählen Sie weitere Bohrungen aus dem Diagramm nach Bedarf und wählen Sie dann "No Program Control" von Control Option und klicken Sie auf Anwenden.
- Wählen Sie einen beliebigen unbenutzten Vertiefungen auf der Platte Diagramm und klicken Sie auf Undefine.
2. Bereiten DCs für die Transfektion
- Alle Arbeiten sind unter sterilen Bedingungen in einer Zellkultur Motorhaube wenn möglich durchgeführt werden. Bereiten Sie die Nukleofektion Lösung durch Zugabe von 96-Well-to Human Monozyten 96-well Nucleofector Lösung im Verhältnis von 450 bis 2025 zu ergänzen. Vermischen und auf Raumtemperatur aufwärmen. Sie werden 20 &mgr; l der Nukleofektion Lösung pro Vertiefung benötigen. Machen Sie einen Überschuss von 10% bis zum Pipettieren Fehler erlauben.
- Legen Sie die Anzahl der Nucleocuvette Module, die Sie in die Nucleocuvette Platte in der richtigen Ausrichtung, dh Einsetzen der ersten in die Zeilen 1 und 2.
- Bestimmen Sie die Anzahl der DCs für Ihr Experiment Berechnung auf 500.000 Zellen pro Well und Pellet durch Zentrifugation bei 400g für 10min benötigt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Resuspendieren der Zellen in der Nukleofektion Lösung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren ein paar mal.
- Teilen Sie die richtige Menge der resuspendierten Zellen in Eppendorfs für die jeweilige Behandlung zB GLO und RIG-I bezeichnet.
- Add 0.25μg siRNA pro 500.000 Zellen und durch Pipettieren gründlich mischen. Verwenden Sie nicht-targeting siRNA in Ihrem no-Transfektion Kontrollprobe.
- Pipette 20 &mgr; l der oben genannten Mischungen in die Nucleocuvette Modulen nach Ihren experimentelle Anordnung ist die Gewährleistung der Flüssigkeit auf den Boden des Brunnens geliefert.
- Decken Sie die Nucleocuvette Platte mit dem Deckel und tippen Sie auf die Platte auf eine harte Oberfläche ein paar Mal, um sicherzustellen, Entfernung von Luftblasen.
3. Transfizieren DCs
- Legen Sie Platte in die Nucleofector 96-well Shuttle Tablett, auf Upload klicken und dann starten.
- Befolgen Sie die Fortschritte der Transfektion Prozess auf dem Laptop-Display, ein schwarzes Kreuz auf grünem Hintergrund bedeutet eine erfolgreiche Transfektion in die gut, während ein schwarzer Balken auf rotem Hintergrund bedeutet, dass es nicht erfolgreich war.
- Nach Abschluss der Transfektion, entfernen Sie die Platte, und fügen Sie 80μl der DC Wachstumsmedium in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.
- Inkubieren Platte für 10 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Übertragen Sie die 100 &mgr; Volumen aus dem nucleocuvettes in Matrix Röhrchen mit 100 &mgr; l vorgewärmtes DC Wachstumsmedium, so dass die richtige Orientierung.
- Entfernen und entsorgen Sie diese Röhren wo Transfektion nicht aufgetreten wäre.
- Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden oder eine andere gewünschte Zeitintervall.
4. Infect Zellen mit NDV
- Nehmen Sie Matrix Rohre aus dem Inkubator in der Zellkultur Kapuze und Pool Röhrchen für jede experimentelle Probe in Eppendorfs
- Pellet die Zellen vorsichtig durch Drehen in einer Tischplatte Zentrifuge für 5 min und entfernen Überstand.
- Resuspendieren der Zellen in serumfreiem Wachstumsmedium mit NDV bei einer MOI von 1 und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 45 min, mit Eppendorfs lose in einer steril abgedeckt.
- Fügen Sie 900μl der DC Nährmedium und re-Inkubation für 8-10 h.
5. Ernten Sie die Zellen
- Pellet-Zellen durch Spinnen Eppendorfs in einer Tischplatte Zentrifuge und Überstand entfernen.
- Ernten Sie die Zellen für die RNA-oder Protein-Extraktion nach Ihren Protokoll.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Mit unseren optimierten Protokoll wir transfizierten DCs mit RIGI-targeting siRNA für 24 h und dann infiziert die Zellen mit NDV (a Paramyxovirus von RIG-I erfasst), die Interferon-Antwort-Weg anregen. Durch qRT-PCR-Analyse haben wir gezeigt, knock down des Gens um 75% auf der Ebene der Transkription. Wir beobachteten auch eine ähnliche Reduktion in der Expression von IFNβ, die einem nachgeschalteten Effektor von RIG-I wird in der IFN-Signalkaskade. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die Expression von IFNβ in nicht-infizierten, Steuer-transfizierten Zellen nicht nachweisbar war, während die von MxA, ein IFNβ nachgelagerten Reaktion Gen war minimal (Abbildung 1A).
Eine zweite Transfektion von DCs mit RIGI-targeting siRNA erfolgte mit genügend Zellen zur Western-Blot-Analyse. Wo dieRT-PCR-Ergebnisse waren ähnlich, was wir sahen zuvor (62% bzw. 66% knock down von RIG-I und IFNβ Ausdruck bzw.) (Abbildung 1B), sondiert die Western-Blot für RIG-I zeigte, dass die Expression dieses Gens war vollständig blockiert (Abbildung 1C).
Abbildung 1. (A) MoDCs wurden entweder mit siRNA transfizierten Targeting RIG-I oder unspezifische GLO siRNA und die Wirkung auf die Expression von RIG-I, IFNβ und MxA durch qRT-PCR bestimmt. (-) Die Transfektion verwendete Protokoll ein Monozyten-spezifische Puffer und nucleoporation Programm FF168 (Lonza Walkersville Inc.) Nach Inkubation für 24 h, wurden die transfizierten Zellen entweder mit NDV (+) oder links infizierten infiziert. Nach einer weiteren Inkubation für 10 h wurden die Zellen geerntet und RNA extrahiert Transcript Ebenen repräsentieren die Ergebnisse von zwei wiederholten Experimenten. Taken from Bowles et al 16. (B) MoDCs aus einer anderen Buffy-Coat erhalten, wie für Abbildung 1A verwendet wurden erneut mit transfizierten entweder RIG-I-targeting siRNA oder unspezifische GLO siRNA unter Verwendung der gleichen Transfektionsprotokolls wie oben. Eine zusätzliche Kontrolle über untransfizierte MoDCs war in das Experiment einbezogen. Nach einer 24 h Inkubation alle Zellen wurden mit NDV infiziert und inkubiert für weitere 10 h, bevor sie für beide RNA-und Protein-Extraktion geerntet. Transcript Ebenen der RIG-I, IFNβ und MxA durch qRT-PCR ermittelt stellen die Ergebnisse von zwei wiederholten Experimenten. Taken from Bowles et al 16. (C) Lysate von Zellen in Abbildung 1B oben beschrieben wurden mittels Western Blot analysiert. Spuren 1 und 2, Lysate von transfizierten Zellen, Bahnen 3 und 4, Lysate von GLO siRNA transfizierten Zellen, Spuren 5 und 6, Lysate von Zellen mit RIG-I-targeting siRNA transfiziert. Die Proben wurden für RIG-I untersucht und auch GAPDH (als Ladekontrolle) und wurden in doppelter Ausführung. Taken from Bowles et al 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effiziente Transfektion von primären naiven dendritischen Zellen ist für hohen Durchsatz-Analyse und Reverse Engineering von zellulären Entzündungswege in diesem wichtigen Zell-Vermittlung der angeborenen-adaptive Immunsystem Übergang wichtig. Allerdings finden die meisten Forscher, dass diese Zellen nur schwer effizient und ohne die Transfektion induzieren Zellreifung transfizieren bei der Verwendung von Standard-Transfektion Techniken sind. Wir untersuchten, ob diese Einschränkungen, die im Hochdurchsatz-Protokoll-Optimierung mit einem gleichzeitigen, unabhängigen 96-well kommerziellen nuklearen Transfektionssystem (Lonza) überwunden werden könnten.
Unter Verwendung von fluoreszierenden activated cell sorting (FACS), messen wir eine GFP-exprimierenden Plasmid als Marker für die Transfektionseffizienz und CD86 und MHCII Immunreaktivität als ein Auslesen der Zellreifung. Eine Reihe von Experimenten Auswertung Puffer und Elektroporation Programme letztlich identifiziert Bedingungen zeigt> 50% der Transfektion und das Fehlen der Zunahme der Reifung Marker.
Zur weiteren Untersuchung mögliche Aktivierung von DCs durch die Nukleofektion Prozess analysierten wir die Expression von IFNβ und ihre nachgeschalteten Reaktion Gen MxA auf mRNA-Ebene. MxA Ausdruck ist außerordentlich empfindlich auf IFNβ Produktion und kann als Bioassay eingesetzt werden, um sehr geringe Mengen an erkennen die cytokine18. Durch qRT-PCR-Analyse haben wir gesehen keine nachweisbaren IFNβ Ausdruck aber einige Hochregulation von MxA was auf oben Baseline IFNβ Induktion zu sehen. Doch diese minimale Hochregulation von MxA in nicht-infizierten, Steuer-transfizierten Zellen war vernachlässigbar im Vergleich zu der sich aus Virus-vermittelten Stimulation der IFNβ Signalkaskade (Abbildung 1A) und bestätigt, dass wir erfolgreich unseren nucleoporation Protokoll DCs ohne Aktivierung transfizieren sie in nennenswertem Niveau.
Der Nutzen unserer optimierten Protokoll wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Transfektion von DCs mit siRNA Targeting RIG-I bewirkte einen vollständigen Verlust des nachweisbaren RIG-I-Protein (Abbildung 1C). Wir sollten beachten, dass für eine erfolgreiche Störung anderer Gene, die Menge der siRNA und verwendete Länge der Transfektion Zeit können optimiert werden.
Nach unserem Wissen können diese Arbeit zum ersten Mal das Design der High-Throughput-loss-of-function-Studien in primären humanen DCs, damit die Lösung eines schwierigen Hindernis für Forschung in diesem Bereich. Diese sollten neue Möglichkeiten für das Studium der DC-Signalisierung und kann zum Fortschritt in der Entwicklung DC-basierte Immuntherapien beitragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Das Projekt wurde vom NIH NIAID Contract No HHSN2662000500021C unterstützt. Wir danken Ming Chen für seine technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
