פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Summary

אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

Abstract

תאים דנדריטים (DCS) יכול להיחשב זקיפים של המערכת החיסונית אשר לשחק תפקיד קריטי בייזום שלה בתגובה לזיהום ^1. זיהוי של אנטיגן פתוגניים ידי DCs נאיבית היא באמצעות הכרה קולטנים דפוס (PRRs) אשר מסוגלים לזהות מבנים ישומרו ספציפי המכונה הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPS). גילוי PAMPs ידי DCs מפעילה מפל איתות תאיים והתוצאה ההפעלה שלהם טרנספורמציה כדי DCs בוגרת. תהליך זה מאופיין בדרך כלל יחד עם ציטוקינים מעודדי דלקת אחרים על ידי ייצור של אינטרפרון מסוג 1, upregulation של תא השטח סמנים כגון MHCII ו CD86 והגירה של DC הבוגרת לבלוטות הלימפה לנקז, שבה האינטראקציה עם בתאי T מפעילה את התגובה החיסונית אדפטיבית ^{2, 3.} לפיכך, DCs הקישור מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות.

היכולת לנתח את רשתות המולקולריים שבבסיס התגובה DC לפתוגנים שונים חיוני להבנה טובה יותר של ויסות של מסלולים אלו איתות גנים המושרה שלהם. זה אמור גם לעזור להקל על פיתוח של DC מבוסס חיסונים נגד מחלות זיהומיות וגידולים. עם זאת, הקו הזה של המחקר כבר הקשתה קשות הקושי העיקרי transfecting DCs ^4.

התמרה וירוס שיטות, כגון מערכת lentiviral, משמשים בדרך כלל, אבל לשאת מגבלות רבות כגון המורכבות ביו מסוכנים סיכון (עם העלויות הכרוכות) ^5,6,7,8. בנוסף, אספקת המוצרים גנטי נגיפי מעלה את immunogenicity של אלה transduced DCs ^9,10,11,12. Electroporation נעשה שימוש עם תוצאות מעורבות ^13,14,15, אבל אנחנו הראשונים לדווח על השימוש בפרוטוקול תפוקה גבוהה transfection ו משמעי להפגין השירות שלה.

בדוח זה אנו מסכמים פרוטוקול מסחרי אופטימיזציה עבור transfection תפוקה גבוהה של DCs ראשוני האדם, עם רעילות לתא מוגבלת והעדר התבגרות DC ^16. יעילות transfection (של ה-GFP הפלסמיד) ואת כדאיות התא היו יותר מ 50% ו -70% בהתאמה. FACS ניתוח הקים את העדר עלייה ביטוי של סמני הבשלה CD86 ו MHCII בתאים transfected, בעוד qRT-PCR הפגינו שום upregulation של IFNβ. שימוש בפרוטוקול זה electroporation, אנו מספקים ראיות transfection מוצלח של DCs עם siRNA ויעיל להפיל של הגן ממוקד תלבושת-I, קולטן מפתח זיהוי נגיפי ^16,17, ב-mRNA והן רמות החלבון.

Protocol

1. תוכנית Amaxa 96 גם מעבורת Nucleofector

1. פתיחת קובץ פרמטר חדש.
2. בחר את מספר בארות תשתמש עבור transfection תקן ידי גרירת הסמן מעל תרשים 96 את הצלחת היטב. שימוש מינימום של 3 בארות לבריכה למדגם כל הניסוי.
3. את קוד התוכנית קלט: ב part1 בחר 'FF' ו part2 לבחור '168 'מ למשוך את הנפתחים
4. מ ', מונוציטים האדם "תיבת פתרון לבחור
5. תחת אפשרות בקרה בחר 'רגיל'.
6. לחץ על החל.
7. כדי לכלול שליטה ללא transfection, בחר בארות נוספות מן התרשים כנדרש ולאחר מכן לבחור "אין בקרה התוכנית" מ אפשרות שליטה ולחץ על החל.
8. בחר בארות בשימוש הנותרים בתרשים צלחת ולחץ על Undefine.

2. הכן DCs עבור transfection

1. כל עבודה צריך להיעשות בתנאים סטריליים במנדף תא התרבות במידת האפשר. הכן את הפתרון nucleofection ידי הוספת 96-גם תוספת פתרון האדם מונוציטים 96 היטב Nucleofector ביחס של 450-2025. מערבבים ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת החדר. יהיה עליך 20μl של פתרון לכל nucleofection היטב. הפוך את עודף של 10% כדי לאפשר pipetting שגיאה.
2. מניחים את מספר מודולים nucleocuvette שאתה צריך לתוך הצלחת nucleocuvette ב כלומר בכיוון הנכון הכנסת הראשון כדי שורות 1 ו -2.
3. לקבוע את מספר DCs הדרוש עבור הניסוי שלך בחישוב על 500,000 תאים לכל היטב על ידי גלולה centrifuging ב 400 גרם עבור 10min. הסר בזהירות את supernatant.
4. Resuspend התאים הפתרון nucleofection ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
5. מחלקים את נפח הנכון של תאים לתוך resuspended eppendorfs שכותרתו עבור מסוים כגון טיפול Glo ו-לבוש אני.
6. הוסף siRNA 0.25μg לכל 500,000 תאים ומערבבים ידי pipetting. השתמש siRNA ללא מיקוד במדגם שלך ללא transfection שליטה.
7. פיפטה 20μl של תערובות לעיל לתוך מודולים nucleocuvette, על פי פריסת הניסוי שלך, כדי להבטיח את הנוזל מועבר לתחתית הבאר.
8. מכסים את הצלחת nucleocuvette עם המכסה וללחוץ את הצלחת על משטח קשה כמה פעמים כדי להבטיח את סילוק בועות אוויר.

3. Transfect DCs

1. הכנס הצלחת למגש מעבורת Nucleofector 96-טוב, לחץ על Upload ולאחר מכן להתחיל.
2. עקוב אחר התקדמות תהליך transfection בצג העליון הברכיים; צלב שחור על רקע ירוק מסמל transfection מוצלח כל כך טוב, ואילו פס שחור על רקע אדום אומר שזה לא הצליח.
3. ביום השלמת תהליך transfection, הסר את צלחת ולהוסיף 80μl של המדיום צמיחה DC זה גם בעזרת פיפטה רב.
4. דגירה צלחת 10 דקות בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
5. העברת נפח 100μl מ nucleocuvettes לתוך צינורות מטריצה ​​המכילה 100μl של המדיום מראש חימם צמיחה DC, שמירה על הכיוון הנכון.
6. הסר וזורקים אותם צינורות שבו transfection לא התרחשה.
7. לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ עבור מרווח 24h או אחר הזמן הרצוי.

4. להדביק תאים עם NDV

1. הסר צינורות מטריצת מן החממה עד למכסה המנוע לתא תרבות צינורות בריכה מדגם ניסיוני לתוך eppendorfs
2. גלולה התאים בעדינות על ידי ספינינג בצנטריפוגה גבי השולחן במשך 5 דקות ולהסיר supernatant.
3. Resuspend התאים בינוני סרום ללא צמיחה המכיל NDV על הפנים של 1 ו לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ דקות 45, עם eppendorfs מכוסה באופן רופף בצורה סטרילית.
4. הוסף 900μl של מדיום הגידול DC, מחדש דגירה של 80-10 ח

5. קציר תאים

1. גלולה תאים על ידי ספינינג eppendorfs בצנטריפוגה בראש השולחן ולהסיר supernatant.
2. קציר תאים או מיצוי RNA חלבון על פי פרוטוקול שלך.

6. נציג התוצאות:

באמצעות פרוטוקול מותאם שלנו transfected DCs עם ריגי במיקוד siRNA למשך 24 שעות ולאחר מכן את התאים הנגועים עם NDV (א paramyxovirus מזוהים על ידי לבוש-I) כדי לעורר את מסלול התגובה אינטרפרון. על ידי ניתוח qRT-PCR הפגנו להפיל של הגן על ידי 75% ברמת שעתוק. אנו הבחנו גם הפחתה דומה בביטוי של IFNβ, שהינה מפעיל במורד הזרם של המתקן, אני במפל IFN איתות. יתר על כן, ראינו כי הביטוי של IFNβ שאינם נגועים, שליטה transfected תאים לא היה להבחין בעוד זה של MxA, גן IFNβ בתגובה במורד הזרם, היה מזערי (איור 1A).

Transfection השני של DCs עם ריגי במיקוד siRNA בוצעה באמצעות תאים מספיק כדי לכלול ניתוח כתם המערבי. איפהRT-PCR התוצאות היו דומות למה שראינו בעבר (62% ו -66% להפיל של לבוש, אני וביטוי IFNβ בהתאמה) (איור 1 ב), את כתם המערבי תרה אחר לבוש, אני גילה כי את הביטוי של גן זה היה חסום לחלוטין (תרשים 1C).

באיור 1. (א) MoDCs היו transfected עם siRNA או מיקוד חבל, אני או siRNA Glo ספציפי ואת ההשפעה על הביטוי של לבוש, אני IFNβ ו MxA נקבע על ידי qRT-PCR. פרוטוקול transfection בשימוש חיץ מונוציטים ספציפי תוכנית nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville Inc) בעקבות הדגירה במשך 24 שעות, תאים transfected היו נגועים או עם NDV (+) או שמאל נגוע (-). לאחר דגירה נוספת עבור 10 שעות, התאים נקצרו רמות RNA תמליל חילוץ לייצג את התוצאות של שני ניסויים לשכפל. הפיקוח בולס ואח' ^16. (ב) MoDCs המתקבל מעיל באפי שונים המשמשים איור 1A היו transfected שוב גם עם תלבושת-I-siRNA מיקוד או Glo siRNA ספציפיים באמצעות פרוטוקול transfection כנ"ל. בקרה נוספת באמצעות MoDCs untransfected שולב בניסוי. בעקבות הדגירה 24 שעות כל התאים נדבקו NDV וטופחו במשך 10 שעות נוספות שנקטפו בטרם הן רנ"א מיצוי חלבון. רמות תמליל חבל, אני IFNβ ו MxA כפי שנקבע על ידי qRT-PCR לייצג את התוצאות של שני ניסויים לשכפל. הפיקוח בולס ואח' ^16. (C) lysates מתאי המתואר בתרשים 1B לעיל נותחו על ידי כתם המערבי. Lanes 1 ו -2, lysates מתאי untransfected; נתיבים 3 ו -4, lysates מתאי Glo siRNA transfected; נתיבים 5 ו -6, lysates מתאי transfected עם siRNA מעטה אני במיקוד-. דוגמאות נבדקו עבור המתקן, אני גם GAPDH (כמו בקרת העמסה) והיו לרוץ כפולים. הפיקוח בולס ואח' ^16.

Discussion

Transfection יעיל של נאיביות תאים דנדריטים הראשוני חשוב לניתוח תפוקה גבוהה הנדסה לאחור של מסלולים דלקתיים הסלולר בתא מפתח זה מתווך את המעבר מולדת-אדפטיבית החיסונית. עם זאת, רוב החוקרים מוצאים כי התאים האלה קשה transfect הן ביעילות וללא הליך התבגרות transfection גרימת התא כאשר שימוש בטכניקות transfection סטנדרטי. אנו בדקו האם המגבלות האלה אפשר להתגבר על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול גבוהה התפוקה באמצעות סימולטני, מערכת עצמאית 96-היטב מסחרי transfection גרעיני (Lonza).

באמצעות ניאון מיון התא הפעיל (FACS), מדדנו GFP-לבטא פלסמיד כסמן ליעילות transfection ו immunoreactivity CD86 ו MHCII כמו readout של התבגרות התא. סדרת ניסויים הערכת מאגרים ותוכניות electroporation זיהה בסופו של דבר התנאים מראה> transfection 50% והעדר גידול סמנים התבגרות.

כדי להמשיך לחקור הפעלה אפשרית של DCs על ידי תהליך nucleofection ניתחנו את רמת הביטוי של הגן IFNβ ו MxA הזרם שלה בתגובה ברמת ה-mRNA. MxA הביטוי הוא רגיש להפליא ייצור IFNβ והוא יכול לשמש המבדק לזהות רמות נמוכות מאוד של cytokine18. באמצעות ניתוח qRT-PCR לא ראינו ביטוי IFNβ לזיהוי אבל ראיתי כמה upregulation של MxA ובכך המציין מעל הבסיס אינדוקציה IFNβ. אולם זה upregulation מינימלי של MxA שאינם נגועים, שליטה transfected התאים היה זניח לעומת זה הנובע גירוי וירוס בתיווך של מפל איתות IFNβ (איור 1A) ואישר כי נוכל להשתמש בהצלחה פרוטוקול nucleoporation שלנו transfect DCs ללא הפעלת אותם לרמה משמעותי.

השירות של פרוטוקול אופטימיזציה שלנו אושרה על ידי ניתוח כתם המערבי. Transfection של DCs עם siRNA מיקוד חבל, אני גרמה לאובדן מוחלט של חלבון המתקן, אני לגילוי (תרשים 1C). נציין כי עבור ההפרעות מוצלח של גנים אחרים, כמות siRNA בשימוש משך הזמן transfection עשוי להיות מותאם.

למיטב ידיעתנו, עבודה זו מאפשרת לראשונה את העיצוב של תפוקה גבוהה הפסד של פונקציה לימודי DCs האנושי הראשוני, ובכך לפתור מכשול קשה מחקר בתחום זה. זה אמור לספק הזדמנויות חדשות עבור המחקר של DC איתות עשוי לתרום להתקדמות בפיתוח DC מבוסס immunotherapies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle	Lonza Inc.	108S0109	Serial number
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit	Lonza Inc.	VHPA-2007	Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates
RIG-I siRNA	Dharmacon	L-012511-00
GLO siRNA	Dharmacon	D-001600-01-20
RPMI 1640	Invitrogen	11875	Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium
DMEM	Invitrogen	11965
L-glutamine	Invitrogen	25030081
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070063
Fetal Calf Serum	Hyclone	3070.03
Dendritic Cells	New York Blood center		DCs are purified from buffy coats using a standard procedure