تشخيص وEndoparasites Ecto في الجرذان والفئران المعملية

Summary

توضح هذه المقالة إجراءات مختلفة لفحص الجرذان والفئران لكشف إندو أو ectoparasitism. سيظهر فحوصات التشخيص عدة ، سواء تلك التي مناسبة للاستخدام على الحيوانات الحية وتلك التي استخدمت بعد القتل الرحيم للحيوان. وسيتم إدراج الصور للمساعدة في التعرف على الطفيليات الجرذان والفئران.

Abstract

الطفيليات الداخلية والخارجية لا تزال مصدر قلق كبير في مرافق القوارض المختبرية ، ومرافق الميناء العديد من الأبحاث مطفول بعض الحيوانات. قبل الشروع في دراسة الحيوانات من الطفيليات ، ينبغي النظر في أمرين. واحد : وستبذل ما في استخدام المعلومات التي تم جمعها ، والثاني : وهو الاختبار هو الأكثر ملاءمة. قد يعرف أن يكون شيئا مطفول الحيوانات أن مرفق يقبل ، ولكن غالبا ما يكون هناك حاجة لعلاج الحيوانات ومن ثم لتحديد مدى فعالية العلاج. قد يتم الكشف عن الطفيليات في الحيوانات من خلال تقنيات مختلفة ، بما فيها العينات المأخوذة من الحيوانات الحية أو الموت الرحيم. تاريخيا ، حسب التجارب مع حساسية أكبر التشخيص القتل الرحيم للحيوان ، وإن سمحت PCR ذات حساسية عالية لاختبار عدة أنواع من الطفيليات. هذه المقالة يوضح إجراءات للكشف عن إندو والطفيليات الخارجية في الفئران والجرذان. نفس الإجراءات التي تنطبق على غيرها من القوارض ، على الرغم من أن نوعا من الطفيليات الموجودة سوف تختلف.

Protocol

1. طفيلي جواني الفحص (الجدول 1)

1. اختبار الشريط حول الشرج (انظر أيضا القسم 5 ؛ عادة ما يتم تنفيذ هذه في نفس الوقت)

1. إزالة طول واضحة ، وليس متجمد ، شريط السلوفان من موزع. وينبغي أن يكون الشريط طويل بما يكفي لمعالجة من قبل طرف واحد دون لمس المتوسطة (حوالي 5 سم). قد يكون من الأسهل أن تستغني أطوال عدة في وقت واحد ، والتي أرفقت بها إلى حافة سطح عمل نظيف واستخدام عند الحاجة.
2. رفع الماوس من قفصه ومكان على غطاء القفص ، وعقد من قبل الذيل. تنفيذ هذا الإجراء في مجلس الوزراء تدفق الصفحي أو السلامة الأحيائية لمجلس الوزراء اذا كانت الحالة الصحية للحيوانات تتطلب ذلك.
3. كبح الفأر من ذيله ، ورفع رجليه الخلفيتين من القفص. فهم في نهاية الشريط بين الإبهام والسبابة ، ثم تطبيق منتصف الشريط بحزم العجان الماوس ، بما في ذلك المنطقة حول الشرج عدة مرات. وينبغي أن ينظر إلى أن يكون الشعر ملتصق على الشريط لفحص للنظر ناجحة.
4. مكان الماوس في الجزء الخلفي من القفص.
5. وضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة زجاجية نظيفة المسمى ، وتطبيق الشريط إلى الشريحة ، ثم آخر قطرة من الزيوت المعدنية. مع تغطية غطاء زجاجة زلة.
6. قراءة الشرائح باستخدام المجهر أهداف 40X 10x وعلى ضوء المجهر. اختبار الشريط حول الشرج هو الأفضل في كشف Syphacia البيض ، على الرغم من أن وجدت في بعض الأحيان بيض الطفيليات الأخرى.

2. برازي التعويم

1. التجمع حل التعويم ، وقارورة مسطحة (قارورة حبوب منع الحمل أو البراز جهاز تعويم مثل Ovatector) ، طبق بتري ، زلة تغطية ، شريحة المجهر ، وقضيب / العصي التحريك. وينبغي حل الطرح ، مثل Fecasol ، يملك الثقل النوعي لل1،20-1،30 وربما تكون مصنوعة من أملاح الصوديوم المختلفة ، والسكر ، وكبريتات الزنك ، أو شراؤها تجاريا. (الجدول 2)
2. جمع 2-5 الكريات البرازية من قفص أو طازجة من الحيوانات (ق) الى غرفة التعويم. قد إذا البراز جافة للغاية ، إما بسبب السن أو الأنواع المنتجة في البراز ، البراز تبليل مع 500 ميكرولتر من المياه المالحة 0.9 ٪ يكون مفيدا.
3. مكان القنينة في طبق بتري لحماية سطح العمل من فيض من البراز المنحل. إضافة صغر حجم الطرح المتوسطة والهريس ويقلب جيدا. لا ينبغي لقطع كبيرة من المواد لا تزال قائمة. الاستمرار في إضافة المتوسطة التعويم حتى أشكال هلالة فوق حافة القارورة.
4. وضع غطاء على زلة هلالة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وبيض الطفيليات وبعض البيضات الأوالي الارتفاع إلى الأعلى والتمسك انزلاق الغطاء.
5. بعد الحضانة ، ورفع الغطاء عكس زلة. ضع زلة تغطية على شريحة ميكروسكوب زجاجية.
6. فحص الشريحة باستخدام أهداف 10x و40X تحت المجهر الخفيفة.
7. على الرغم من التقنية العالية والمنخفضة من السهل القيام بها ، بصورة عامة ، لا ينصح لهذه التقنية الفئران أو الجرذان. وكقاعدة عامة ، هو أكثر ملاءمة للحيوانات التي تنتج أكبر كمية من البراز.

3. برازي التركيز والطرد المركزي

1. التجمع تعويم الحل ، أنبوب الطرد المركزي ، زلة تغطية ، شريحة المجهر ، وقضيب / العصي والقبعات التحريك الأنبوب. وينبغي أن يكون لها حل تعويم الثقل النوعي لل1،18-1،30 ويمكن أن تكون مصنوعة من أملاح الصوديوم المختلفة ، والسكر ، كبريتات الزنك ، أو تم شراؤها تجاريا. (الجدول 2)
2. جمع 20-10 كريات البراز من قفص أو طازجة من الحيوانات (ق) في أنبوب جمع. قد إذا البراز جافة للغاية ، إما بسبب السن أو الأنواع المنتجة في البراز ، البراز تبليل مع 500 ميكرولتر من 0.9 ٪ أو المالحة مع الحل الذي تستخدمه التعويم يكون مفيدا.
3. مزيج العينة في محلول التعويم المناسبة داخل الزجاج أنبوب الطرد المركزي. ويمكن استخدام الانفعالات الميكانيكية مع vortexer لخلط العينات. إذا تم استخدام vortexer ، يجب وضع القبعات المفاجئة على قمم أنبوب لمنع التسرب والتلوث الصليب. بشكل روتيني ، يتم إعداد العينات في الثقل النوعي 1.18 كبريتات الزنك ، ولكن يمكن استخدام حلول أخرى بالإضافة (في أنبوب إعداد منفصلة) أو في الاستبدال.
4. إضافة إلى تعويم الحل إضافية لكل أنبوب لتشكيل هلالة إيجابي طفيف على كل أنبوب. تطبيق البلاستيك لتغطية زلة كل أنبوب ، وضمان أن يتم الاتصال الكامل مع شفة الانبوب. مكان أنبوب (ق) إلى جهاز الطرد المركزي.
5. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 616-760 إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 دقيقة. إذا فقدت أو زلات تغطية كسر أثناء عملية الطرد المركزي ، يمكن وضع زلة غطاء جديد على أنبوب العينة ، ويمكن أن أنبوب يميل بلطف بحيث تلامس هلالة زلة تغطية جديدة. لا الطرد المركزي إضافية أمر ضروري.
6. إزالة الغطاء زلة من أنبوب الطرد المركزي ومكان على ونظيفة وصفت شريحة ميكروسكوب زجاجية. إذا تم استخدام حلول متعددة الطرد المركزي لتقييم عينة واحدة البراز ، قد تكون وضعت غطاء ينزلق اثنين على نفس الشريحة.
7. وصمة عار الشريحة مع اليود. وهذا يسمح للبريداسيير تحديد الخراجات.
8. فحص الشريحة باستخدام أهداف 40X 10x وعلى ضوء المجهر.

4. المباشرة لفحص الامعاء الديدان والطفيليات

1. مكان الماوس الموت الرحيم أو الذبيحة الفئران في الاستلقاء على ظهري مجلس تشريح نظيفة أو ما شابه سطح العمل.
2. باستخدام الملقط ، ورفع جدار البطن في منطقة الأعضاء التناسلية. باستخدام مقص ، وبعناية شق الجدار البطني البطن من منطقة الأعضاء التناسلية إلى قاعدة القفص الصدري إزالة كل من الجلد والعضلات وتعريض الامعاء. إزالة الأمعاء ، وتبدأ في العفج (الجزء من بداية الأمعاء عند مخرج المعدة) والاستمرار في القولون النازل (الجزء من الأمعاء التي تنتهي في فتحة الشرج ، وعادة ما تحتوي على براز المشكلة).
3. الامعاء مكان في صحن بيتري 100 مل. جمع جزء من الأعور والاثني عشر من الحيوانات الموت الرحيم ووضعه على لوحة التشريح. شق كل قطعة بالطول المعوية لفضح الغشاء المخاطي.
4. باستخدام مقص ، قص الامعاء المتبقية إلى أجزاء صغيرة. إضافة إلى ما يكفي من مياه الصنبور الطبق إلى غمر بالكاد الأنسجة التي تم جمعها.
5. احتضان الخليط على عينة 35-40 درجة مئوية في فرن المختبر أو حاضنة لمدة لا تقل عن 10 دقائق. وهذا تحرير وفضح الديدان اللمعية. بينما كانت العينة يحتضنها ، تنفيذ الخطوات التالية.
6. مكان قطرتين من الجانب المالحة 0.9 ٪ إلى جنب على شريحة واحدة المسمى ، للسماح لإعداد عينات من جزأين المعوية (اثنى عشر والأعور).
7. تعقيم وتبريد الحرارة حلقة بتلقيح أو ما يعادلها.
8. كشط الغشاء المخاطي للاثنى عشر ومكان مأخوذة على الجانب الأيسر من الشريحة (الجانب الأقرب إلى حافة بلوري).
9. كشط مخاطية من الأعور ومكان مأخوذة من على الجانب الأيمن من الشريحة.
10. أعلى مأخوذة مع زلة غطاء. دراسة أعدت باستخدام شريحة الهدف 40X تحت المجهر مرحلة التباين) ؛ التكبير زيادة حسب الحاجة لتحديد الهوية. إذا تم الكشف عن الطفيليات وتحديد القائمة على التشكل.
11. سوف محتويات الطبق تكون جاهزة للفحص من قبل هذه النقطة. فحص محتويات الطبق تشريح تحت المجهر. استخدام عصا أو قضيب التحقيق اللازمة لنقل محتويات داخل صحن لاستكمال إجراء فحص شامل. إذا pinworms موجودة فإنها تبدو وكأنها ، ديدان صغيرة بيضاء تشبه الشعر. إذا الدودة الشريطية موجودة ، فإنها تبدو وكأنها الديدان ، ومجزأة شقة (أكبر من pinworms يشبه الخيط).
12. إذا تم الكشف عن الديدان الطفيلية أو المشتبه بهم وجمع العينات باستخدام ملقط صغير من الزوج.
13. تحميل العينة على المسمى ، شريحة زجاجية نظيفة في قطرة من زيت البارافين أو المعدنية ووضع غطاء على رأس زلة للعينة. فحص الشريحة باستخدام أهداف 40X 10x وعلى ضوء المجهر.

2. فحص الطفيليات الخارجية (الجدول 3)

5. الفراء نتف لفحص الطفيليات الخارجية (اختبار الشريط)

1. إزالة طول واضحة ، وليس متجمد ، شريط السلوفان من موزع. وينبغي أن يكون الشريط طويل بما يكفي لمعالجة من قبل طرف واحد دون لمس المتوسطة (حوالي 5 سم). قد يكون من الأسهل أن تستغني أطوال عدة في وقت واحد ، والتي أرفقت بها إلى حافة سطح عمل نظيف واستخدام عند الحاجة.
2. رفع ماوس أو فأرا من قفصه ومكان على غطاء القفص ، وعقد من قبل الذيل. تنفيذ هذا الإجراء في مجلس الوزراء تدفق الصفحي أو السلامة الأحيائية لمجلس الوزراء اذا كانت الحالة الصحية للحيوانات تتطلب ذلك.
3. كبح الماوس أو الفئران. فهم الفراء مع المرقأة ونتف بلطف الفراء من منطقة الماوس ، كتفي ، والمنطقة البطنية عنق الرحم ، منطقة الإبطين والمنطقة الأربية ، والردف الظهرية. الفراء مكان على الشريط. وينبغي أن ينظر إلى أن يكون الشعر ملتصق على الشريط لفحص للنظر ناجحة. مكان الماوس أو الظهر الفئران في قفص والخمسين.
4. وضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة زجاجية نظيفة المسمى ، وتطبيق الشريط ، ثم آخر قطرة من الزيوت المعدنية. مع تغطية غطاء زجاجة زلة.
5. قراءة الشرائح باستخدام المجهر أهداف 10x و40X تحت المجهر الخفيفة.
6. هذا الفحص هو أفضل للكشف عن مثل العث الفراء Radfordia ، Myobia وMyocoptes.

6. كشط الجلد

1. تجميع المواد التالية : الحيوانات لفحصها والزيوت المعدنية ، شريحة المجهر ، زلة تغطية ، مشرط ومقص. إذا كان هذا الاختبار هو المراد تنفيذها على الحيوانات الحية ، ينبغي أن تكون قبل بداية تخدير.
2. العينة ظهر بالقرب من قاعدة الذيل والمنطقة الزمنية للرئيس. بدلا من ذلك ، قد يتم كشط الآفات الجلدية و / أو المواقع الأخرى.
3. كشط الجلد بعمق مع شفرة المشرط في الاتجاه المعاكس لنمو الشعر ، وإلى إضعاف البشرة. قد وقص الشعر معطف قبل إلغاء تحسين حساسية الفحص عن طريق الحد من إعاقة بصرية (الشعر الزائد) علىالشريحة.
4. وضع قطرة من الزيت على الشريحة. تطبيق نموذج لانخفاض النفط مسح شفرة (مع النموذج المرفق) على سطح الشريحة. إضافة النفط إضافية إلى الشريحة إذا لزم الأمر ، وأعلى مع زلة غطاء.
5. قراءة الشرائح باستخدام المجهر أهداف 10x و40X تحت المجهر الخفيفة.
6. يستخدم عادة في كشط الجلد للكشف عن الدويدية (dermatophytic والفطريات).

7. المباشرة بدراسة شعر البدن

1. مكان الماوس الموت الرحيم أو فأر على مرحلة مجهر تشريح.
2. فحص الشعر للقذف في 10X تقريبا باستخدام عصا قضيب أو صك مماثل لجزء من الشعر ومراعاة قاعدة جذع الشعرة.
3. دراسة منطقة الجمجمة ، وبين العينين وpinnae ، وبين pinnae ، بين كتف ، تحت الفك ، والمناطق الأربية والإبطين. بدلا من ذلك ، قد يتم فحص الذبيحة كلها.
4. جمع أي مواد مشبوهة أو الطفيليات الخارجية المشاهدة باستخدام ملقط صغير من الزوج. قد تبدو في كثير من الأحيان الطفيليات الخارجية مثل قشرة الرأس أو تراكم الصفراء شمعية عند قاعدة عمود الشعر أو مباشرة على الجلد.
5. تحميل العينات على شريحة زجاجية نظيفة في قطرة من زيت البارافين أو المعدنية ووضع غطاء على رأس زلة للعينة. فحص الشريحة باستخدام أهداف 10x و40X تحت المجهر الخفيفة.

3. ممثل النتائج :

انظر الملفات المرفقة تحديد الطفيليات التالية : (ملاحظة : هذه الإجراءات سوف تكتشف أي البيض ، والديدان الطفيلية ، أو تكون موجودة في البراز كيسة أو على الجلد والفرو ، ويتم سرد فقط عدد قليل من هذه أدناه)

Endoparasites :

Syphacia الفأرية (البيض ، ودودة)	شفوية السياط bettencourti
Syphacia obvelata (البيض ، ودودة)	Hexamastix الفأرية
Aspiculuris tetraptera (البيض ، ودودة)	القعساء س.
Rodentolepis نانا (البيض ، ودودة)	الجيارديا النيابة.
المشعرة الثلاثية الفأرية	Spironucleus الفأرية
المتحولة الفأرية

الطفيليات الخارجية :

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia العضلات

	اختبار الشريط	برازي التعويم	FCC	الامتحان مباشرة 1	PCR
البروتوزوا	--	+	+ +	+ + +	+ + + / 2 NA
Metazoa
الدبوسية	+ / -- 3	+ / -- 4	+ 4	+ + +	+ + +
5 الشريطية	--	+	+ +	+ + +	NA
5 غيرها من الديدان	--	+	+ + +	+ + +	NA

^1. يتطلب هذا الأسلوب القتل الرحيم للحيوان.
^2. ليست هناك طرق الكشف PCR المتاحة حاليا لكل الأوالي.
^3. هذا الأسلوب هو الأكثر ملاءمة للكشف عن Syphacia النيابة.
^4. وسوف تكون هذه الطريقة أكثر عرضة للكشف عن Aspiculuris ، وأقل احتمالا للكشف عن Syphacia.
^5. الديدان الشريطية والديدان الأخرى من pinworms نادرة جدا في الفئران والجرذان المختبرية الحديثة.

الجدول رقم 1. فئة من طفيلي جواني والطريقة المناسبة لكشف. وسوف تتطلب بعض أساليب القتل الرحيم للحيوان. NA يشير إلى الطريقة ليست متوفرة حاليا لهذه الطفيليات + يشير إلى ملاءمة طريقة للكشف عن الطفيلي في السؤال ، و-- يشير إلى أنه لا ينصح الأسلوب لهذا الطفيلي.

حل	الثقل النوعي	المكونات بنسبة 2 O H 1L
كلوريد الصوديوم	1.20	كلوريد الصوديوم 311 غرام
نترات الصوديوم	1.20	33نترات الصوديوم 8 ز
نترات الصوديوم	1.30	نترات الصوديوم 616 غرام
سكر	1.20	1170 ز السكروز 1
Sheather من السكر	1،27-1،30	1563 ز السكروز 1
كبريتات الزنك	1.18	كبريتات الزنك 493 غ

^{1 ، وهذه} الحلول تتطلب التبريد أو إضافة 9 مل الفينول كمادة حافظة.

الجدول 2. حلول تعويم البراز (من سميث وآخرون).

	الفراء نتف (اختبار الشريط)	كشط الجلد 1	الامتحان مباشرة 1	PCR
قمل	--	--	+ +	NA
العث	+	+	+ + +	+ + + / 3 NA
البراغيث 4	--	--	+	NA
القراد 4	--	--	+ +	NA

^1. هذا الأسلوب يتطلب التخدير إذا كان المراد تنفيذها على الحيوانات الحية.
^2. يتطلب هذا الأسلوب القتل الرحيم للحيوان.
^3. ليست هناك طرق الكشف PCR المتاحة حاليا لكل انواع من السوس.
^4. البراغيث والقراد نادرة للغاية في المرافق الحديثة على الحيوانات في المختبرات.

الجدول 3. الفئة من الطفيليات الخارجية والطريقة المناسبة لكشف. وسوف تتطلب بعض أساليب القتل الرحيم للحيوان ، وغيرها من الأساليب يتطلب التخدير لأداء لها في الحيوانات الحية. NA يشير إلى الطريقة ليست متوفرة حاليا لهذه الطفيليات. NA يشير إلى الطريقة ليست متوفرة حاليا لهذه الطفيليات + يشير إلى ملاءمة طريقة للكشف عن الطفيلي في السؤال ، و-- يشير إلى أنه لا ينصح الأسلوب لهذا الطفيلي.

Discussion

عند العمل في المختبر ، وينبغي أن يكون دائما السلامة مصدر قلق. تذكر أن ارتداء معدات الوقاية المناسبة عند التعامل مع الحيوانات ، وتنظيف محطة العمل الخاصة بك مع مطهر قبل وبعد. وقد صممت هذه الطرق في المقام الأول في العثور على أي طفيليات من القوارض المختبرية في المواقع المدروسة ، أي أنهم يمكن الكشف عن الطفيليات غريبة أو نادرة للغاية وكذلك pinworms أكثر شيوعا والعث الفراء. على الرغم من أنها تنطبق أيضا على الأنواع الأخرى ، قد القوارض البرية والطفيليات إضافية في أماكن مثل تحت الجلد والكبد والمخ ، وليس تقييمها من الأساليب المذكورة أعلاه.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting board	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Cat #36114
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5910, G204	23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6808, G207	5”
Forceps-Curved	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8254 (M1/21004)	4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8160	Rat tooth
Metal probe	VWR international	Cat#25778-000
Hemostats	Vantage	V97-48
Applicator sticks	Puritan	6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ51, Schott, ACE1
Petri dish	VWR international	100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips	VWR international	Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides	VWR international	VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop	VWR international	Cat#50815-040
Light microscope	Olympus Corporation	Model#BX41TF
Laboratory oven	Quincy Lab Inc.	Model 10 Lab Oven
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Vortexer	VWR international	Mini-Vortexer
Test tube	Kimble Chase	15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips	VWR international	Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps	VWR international	Cat#60869-089
Iodine	Rowley biochemical institute	Cat#SO-364
Zinc sulfate	Sigma-Aldrich	Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#8360-06
Phenol	EMD Millipore	Cat#PX0510-1
Cellophane tape	Staples	Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#6358