Diagnos av Ecto-och endoparasiter i laboratorium råttor och möss

Summary

I artikeln beskrivs olika förfaranden för screening råttor och möss att upptäcka endo-eller ectoparasitism. Flera diagnostiska analyser kommer att demonstreras, både för dem lämpliga för användning av levande djur och de som används efter avlivning av djuret. Fotografier till stöd i identifiering av råtta och mus parasiter kommer att ingå.

Abstract

Interna och externa parasiter fortfarande ett betydande problem i laboratorier gnagare, och många forskningsanläggningar hamnen några parasiterade djur. Innan vi inleder en undersökning av djur för parasiter, bör två saker beaktas. Ett: vad kommer att använda den insamlade informationen, och två: vilket test är den mest lämpliga. Vetskapen om att djuren är parasiterade kan vara något att anläggningen accepterar, men det finns ofta ett behov av att behandla djur och sedan för att bestämma effekten av behandlingen. Parasiter kan påvisas hos djur genom olika tekniker, däribland prover som tagits från levande eller avlivas djur. Historiskt sett krävs testerna med den största diagnostiska sensitiviteten dödshjälp av djuret, även om PCR har möjliggjort hög känslighet test för flera typer av parasiten. Den här artikeln visar förfaranden för påvisande av endo-och ektoparasiter hos möss och råttor. Samma tillvägagångssätt gäller för andra gnagare, även om arter fann parasiter kommer att skilja sig.

Protocol

1. Endoparasite undersökning (tabell 1)

1. Perianala tejp-test (se även avsnitt 5, dessa utförs vanligen på samma gång)

1. Ta bort en längd av tydliga, inte frostat, tejp från en automat. Tape bör vara tillräckligt lång för att klara av ena änden utan att röra vid mitten (ca 5 cm). Det kan vara lättare att dosera flera längder på en gång, förbinder dem med kanten av en ren arbetsyta och hjälp som behövs.
2. Lyft en mus från sin bur och placera på buren locket, håll den i svansen. Utför denna åtgärd i ett laminärt flöde skåp eller biosäkerhet skåp om hälsotillståndet hos det djur kräver det.
3. Hålla musen i svansen, lyfta bakbenen från buren. Ta tag i änden av bandet mellan tummen och pekfingret, sedan tillämpa mitten av tejpen ordentligt på musens perineum, inklusive perianal område flera gånger. Hår ska ses som anhängare till bandet för analysen att betraktas som framgångsrika.
4. Placera musen tillbaka i buren.
5. Placera en droppe mineralolja på en märkt ren glasskiva, applicera tejpen på glaset, sedan en droppe mineralolja. Täck med en glaskupa halka.
6. Läs objektglas med 10x och 40x mål på ett ljusmikroskop. Den perianala bandet test är bäst på att upptäcka Syphacia ägg, även om andra parasit ägg ibland hittas.

2. Fecal flotation

1. Montera flotation lösning, en flatbottnad flaska (piller injektionsflaska eller fekal flotation enhet såsom Ovatector), petriskål, täckglas, objektglas, och applikatorn / omrörning pinnar. Floating lösning, exempelvis Fecasol, bör ha en specifik vikt av 1,20 till 1,30 och kan göras från olika natriumsalter, socker, zinksulfat, eller köpt kommersiellt. (Tabell 2)
2. Samla 2-5 fekal pellets från buren eller färska från djuret (s) i flotation kammaren. Om avföring är extremt torra, antingen på grund av ålder eller arter som producerar avföring, fuktas avföring med 500 l 0,9% koksaltlösning kan vara välgörande.
3. Placera injektionsflaskan i petriskål att skydda arbetsyta från överflöd av lösta avföring. Lägg en liten mängd flytelement medelstora och mosa och rör om ordentligt. Inga stora delar av material bör förbli. Fortsätt att lägga flotation medelstora tills en menisk former ovanför kanten på injektionsflaskan.
4. Placera locket halka på menisken och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Parasit ägg och vissa protozoer oocystor kommer att stiga till toppen och hålla sig till locket glida.
5. Efter inkubation, lyfta och vända på locket halka. Placera locket halka på ett glas objektglas.
6. Undersök bilden med 10x och 40x målen enligt ett ljusmikroskop.
7. Även lågteknologiska och lätt att utföra, i allmänhet, är denna teknik rekommenderas inte för möss eller råttor. Som regel är det mer lämpligt för djur som producerar en större volym av avföring.

3. Fekal koncentration och centrifugering

1. Montera flotation lösning, centrifugrör, täckglas, objektglas, och applikatorn / omrörning pinnar och kapsyler rör. Flotation lösning bör ha en specifik vikt av 1,18 till 1,30 och kan göras från olika natriumsalter, socker, zinksulfat, eller köpt kommersiellt. (Tabell 2)
2. Samla 2-10 fekal pellets från buren eller färska från djuret (s) i ett provrör. Om avföring är extremt torra, antingen på grund av ålder eller arter som producerar avföring, fuktas avföring med 500 l 0,9% koksaltlösning eller med flotation lösning som du använder kan vara välgörande.
3. Blanda provet i en lämplig flotation lösning inom ett glas centrifugrör. Mekanisk omrörning med en vortexer kan användas för att blanda prover. Om en vortexer används bör snap lock placeras på toppen av röret för att förhindra spill och korskontaminering. Rutinmässigt, är prov som har beretts i 1,18 densitet zinksulfat, men andra lösningar kan användas som tillägg (i en separat beredning rör) eller i ersättning.
4. Lägg till ytterligare flotation lösning till varje rör för att bilda en svagt positiv menisk på varje rör. Applicera ett plasthölje slip till varje rör och se till att full kontakt med slang läpp görs. Placera röret (er) i centrifugen.
5. Centrifugera vid cirka 616-760 RCF i 10 minuter. Om täckglas försvinner eller går sönder vid centrifugeringen, kan en ny täckglas placeras på provröret och röret kan lätt tippas så att menisken tangerar den nya täckglas. Ingen ytterligare centrifugering behövs.
6. Ta bort locket glida från centrifugrör och lägg på en märkt, rent glas objektglas. Om flera centrifugering lösningar används för att utvärdera ett avföringsprov kan två täckglas placeras på samma bild.
7. Färga objektglaset med jod. Detta möjliggör för easier identifiering av cystor.
8. Undersök bilden med 10x och 40x mål på ett ljusmikroskop.

4. Direkt undersökning av tarmar maskar och protozoer

1. Placera euthanized mus eller råtta stommen i rygg VILA på en ren dissektion board eller liknande arbetsyta.
2. Använd pincett, lyft bukväggen i underlivet. Använda sax, försiktigt incisionsfilm den ventrala bukväggen från underlivet till basen i bröstkorgen att ta bort både hud och muskler och utsätta tarmen. Ta bort tarmen, med början på tolvfingertarmen (den del av tarmen som börjar vid utloppet från magsäcken) och vidare till fallande kolon (den del av tarmen som slutar vid anus och oftast innehåller bildas avföring).
3. Placera tarmarna i en 100 ml petriskål. Samla en del av blindtarmen och tolvfingertarmen från euthanized djur och placera på en dissekera ombord. Incise varje tarmen segment längden att exponera slemhinnan.
4. Med sax, klippa återstående tarmen i små sektioner. Lägg tillräckligt med kranvatten till skålen till knappt dränka de insamlade vävnad.
5. Inkubera provet blandningen på 35-40 ° C i ett laboratorium ugn eller inkubator för minst 10 minuter. Detta kommer att frigöra och exponera luminala maskar. Medan provet ruvar, utföra följande steg.
6. Placera två droppar 0,9% koksaltlösning sida vid sida på en märkt enda bild, för att möjliggöra beredning av prover från två tarmen segment (tolvfingertarmen och blindtarmen).
7. Värme sterilisera och svalt en inokulering slinga eller motsvarande.
8. Skrapa slemhinnan i tolvfingertarmen och placera avskrap på den vänstra sidan av bilden (sidan närmast frostad kant).
9. Skrapa slemhinnan i blindtarmen och placera avskrap från på höger sida av bilden.
10. Toppa skrapningar med ett täckglas. Undersök beredd skjuta med 40x objektiv under ett faskontrastmikroskop), ökar förstoringen som behövs för identifiering. Om parasiter upptäcks, identifiera baserad på morfologi.
11. Skålen Innehållet kommer att vara klara för granskning enligt denna punkt. Undersök skålen innehållet vid en dissekera mikroskop. Använd en sond eller applikator pinne som behövs för att flytta innehållet i skålen för att slutföra en grundlig undersökning. Om springmask är närvarande kommer de att visas som små, vita, hår-liknande maskar. Om bandmask är närvarande, kommer de att visas som segmenterade, platta maskar (större än trådformiga springmask).
12. Om maskar upptäcks eller misstänks samla in provet med en liten pincett.
13. Montera provet på en märkt ren glasskiva i en droppe paraffin eller mineralolja och lägg ett täckglas ovanpå provet. Undersök bilden med 10x och 40x mål på ett ljusmikroskop.

2. Ectoparasite undersökning (tabell 3)

5. Fur plocka undersökning för ektoparasiter (tejp test)

1. Ta bort en längd av tydliga, inte frostat, tejp från en automat. Tape bör vara tillräckligt lång för att klara av ena änden utan att röra vid mitten (ca 5 cm). Det kan vara lättare att dosera flera längder på en gång, förbinder dem med kanten av en ren arbetsyta och hjälp som behövs.
2. Lyft en mus eller råtta från sin bur och placera på buren locket, håll den i svansen. Utför denna åtgärd i ett laminärt flöde skåp eller biosäkerhet skåp om hälsotillståndet hos det djur kräver det.
3. Hålla musen eller råtta. Ta tag i päls med peanger och försiktigt plocka päls från musens skulderbladsbrosket område, ventral halsregionen, armhålan område, ljumsk området, och rygg-bakdel. Placera päls på bandet. Hår ska ses som anhängare till bandet för analysen att betraktas som framgångsrika. Placera musen eller råttan tillbaka i sin bur.
4. Placera en droppe mineralolja på en märkt ren glasskiva, gäller bandet, sedan en droppe mineralolja. Täck med en glaskupa halka.
5. Läs objektglas med 10x och 40x målen enligt ett ljusmikroskop.
6. Denna undersökning är bäst för att upptäcka päls kvalster som Radfordia, Myobia och Myocoptes.

6. Hud skrapa

1. Montera följande material: djur som ska testas, mineralolja, objektglas, täckglas, skalpell och sax. Om detta test skall utföras på levande djur, bör de bedövas innan.
2. Prova dorsum nära svansroten och den tidsmässiga region i huvudet. Alternativt kan hudskador och / eller andra webbplatser skrapas.
3. Djupt skrapa huden med skalpell bladet i motsatt riktning mot hårväxten, att erodera epidermis. Trimning av pälsen innan skrapning kan förbättra screening känsligheten genom att minska visuell obstruktion (överflödigt hår) påbild.
4. Placera en droppe olja på bilden. Applicera provet till oljan sjunka genom att torka av bladet (med exempel bifogas) på ytan av bilden. Lägg till ytterligare olja till bilden om det behövs och toppa med ett täckglas.
5. Läs objektglas med 10x och 40x målen enligt ett ljusmikroskop.
6. Huden skrapa i allmänhet används för att upptäcka Demodex (och dermatophytic svampar).

7. Direkt undersökning av HÅRBEKLÄDNAD

1. Placera euthanized mus eller råtta på scenen av en dissekera mikroskop.
2. Undersök håren på skinnet på cirka 10x med en applikator pinne eller liknande instrument som en del av håret och observera basen av hårstrået.
3. Undersök skallen, mellan ögonen och öronen, mellan öronen, mellan scapulae, under hakan, och ljumsk-och armhålan områden. Alternativt kan hela slaktkroppen undersökas.
4. Samla alla ektoparasiter eller misstänkta materialet ses med en liten pincett. Ektoparasiter kan ofta se ut som mjäll eller ett gult vax uppbyggd vid foten av ett hårstrå eller direkt på huden.
5. Montera provet på en ren glasskiva i en droppe paraffin eller mineralolja och lägg ett täckglas ovanpå provet. Undersök bilden med 10x och 40x målen enligt ett ljusmikroskop.

3. Representativa resultat:

Se bifogade filer identifiera följande parasiter: (OBS: dessa förfaranden kommer att upptäcka eventuella ägg, helminth eller cysta som finns i avföring eller på hud och päls, endast ett fåtal av dessa är listade nedan)

Invärtesparasiter:

Syphacia Muris (ägg, mask)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (ägg, mask)	Hexamastix Muris
Aspiculuris tetraptera (ägg, mask)	Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (ägg, mask)	Giardia spp..
Tritrichomonas Muris	Spironucleus Muris
Entamoeba Muris

Ektoparasiter:

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia musculi

	Tejptest	Fecal flotation	FCC	Direkt tentamen 1	PCR
Protozoer	-	+	+ +	+ + +	+ + + / NA 2
Metazoer
Springmask	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
Bandmask 5	-	+	+ +	+ + +	NA
Övriga rundmaskar 5	-	+	+ + +	+ + +	NA

^1. Metoden kräver avlivning av djuret.
^2. Det är inte PCR-metoder för detektion finns för närvarande för varje protozo.
^3. Denna metod är mest lämplig för att upptäcka Syphacia SPP.
^4. Denna metod kommer att vara mer benägna att upptäcka Aspiculuris, och mindre benägna att upptäcka Syphacia.
^5. Bandmaskar och rundmaskar än springmask är mycket sällsynta i moderna laboratorium möss och råttor.

Tabell 1. Class of endoparasite och lämpliga detektionsmetod. Vissa metoder kräver avlivning av djuret. NA visar metoden finns för närvarande inte för dessa parasiter + anger lämplighet metoden för detektering av parasiten i fråga, och -. Indikerar att metoden inte rekommenderas för den parasit.

Lösning	Specifik vikt	Ingredienser per 1L H 2 O
Natriumklorid	1,20	311 g natriumklorid
Natriumnitrat	1,20	338 g natriumnitrat
Natriumnitrat	1,30	616 g natriumnitrat
Socker	1,20	1170 g sackaros 1
Sheather är socker	1,27-1,30	1563 g sackaros 1
Zinksulfat	1,18	493 g zinksulfat

^1. Dessa lösningar kräver kylning eller tillägg av 9 ml fenol som konserveringsmedel.

Tabell 2. Fekal flotation lösningar (från Smith et al.)

	Fur plocka (band-test)	Hud skrapa 1	Direkt tentamen 1	PCR
Löss	-	-	+ +	NA
Kvalster	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
Loppor 4	-	-	+	NA
Fästingar 4	-	-	+ +	NA

^1. Metoden kräver narkos om det ska utföras på ett levande djur.
^2. Metoden kräver avlivning av djuret.
^3. Det är inte PCR-metoder för detektion finns för närvarande för alla arter av kvalster.
^4. Loppor och fästingar är mycket ovanliga i moderna lokaler försöksdjur.

Tabell 3. Class of ectoparasite och lämpliga detektionsmetod. Vissa metoder kräver avlivning av djuret, och andra metoder kräver narkos för att utföra dem i levande djur. NA visar metoden finns för närvarande inte för dessa parasiter. NA visar metoden finns för närvarande inte för dessa parasiter + anger lämplighet metoden för detektering av parasiten i fråga, och -. Indikerar att metoden inte rekommenderas för den parasit.

Discussion

När du arbetar i ett laboratorium, Säkerheten bör alltid ett bekymmer. Kom ihåg att bära lämplig skyddsutrustning vid arbete med djur och att rengöra din arbetsstation med desinfektionsmedel före och efter. Dessa metoder är främst avsett för att hitta eventuella parasiter av smågnagare på de platser undersökts, det vill säga, de kan upptäcka exotiska eller ytterst sällsynta parasiter samt de mer vanliga springmask och kvalster päls. Trots att de är lika tillämpliga på andra arter kan vilda gnagare ha ytterligare parasiter på platser som lever, underhuden och hjärnan, inte utvärderats av ovanstående metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting board	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Cat #36114
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5910, G204	23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6808, G207	5”
Forceps-Curved	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8254 (M1/21004)	4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8160	Rat tooth
Metal probe	VWR international	Cat#25778-000
Hemostats	Vantage	V97-48
Applicator sticks	Puritan	6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ51, Schott, ACE1
Petri dish	VWR international	100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips	VWR international	Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides	VWR international	VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop	VWR international	Cat#50815-040
Light microscope	Olympus Corporation	Model#BX41TF
Laboratory oven	Quincy Lab Inc.	Model 10 Lab Oven
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Vortexer	VWR international	Mini-Vortexer
Test tube	Kimble Chase	15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips	VWR international	Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps	VWR international	Cat#60869-089
Iodine	Rowley biochemical institute	Cat#SO-364
Zinc sulfate	Sigma-Aldrich	Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#8360-06
Phenol	EMD Millipore	Cat#PX0510-1
Cellophane tape	Staples	Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#6358