אבחון חיצוני ו Endoparasites בחולדות מעבדה ועכברים

Summary

מאמר זה מתאר את ההליכים השונים חולדות ועכברים ההקרנה לזהות אנדו או ectoparasitism. מבחני אבחון כמה יהיה הפגינו, הן אלה מתאימים לשימוש בבעלי חיים לבין אלה המשמשים לאחר המתת חסד של החיה. צילומים לסייע בזיהוי של טפילים חולדה ועכבר ייכלל.

Abstract

טפילים פנימיים וחיצוניים להישאר דאגה משמעותית מתקני מכרסם מעבדה, מתקני מחקר רבים הנמל כמה חיות parasitized. לפני היציאה בדיקה של בעלי חיים טפילים, שני דברים צריך להיחשב. אחת: מה שימוש ייעשה במידע שנאסף, ושני: אשר הבדיקה המתאימה ביותר. בידיעה בעלי חיים parasitized יכול להיות משהו במתקן מקבל, אבל לעיתים קרובות יש צורך לטפל בבעלי חיים, ואז לקבוע את יעילות הטיפול. טפילים ניתן לזהות אצל בעלי חיים באמצעות טכניקות שונות, כולל דגימות שנלקחו מבעלי חיים או מורדמים. מבחינה היסטורית, עם רגישות בדיקות האבחון הגדולים הנדרשים המתת חסד של בעלי חיים, למרות PCR אפשרה רגישות גבוהה בדיקות עבור מספר סוגים של טפיל. מאמר זה מדגים את הליכי זיהוי של אנדו ו ectoparasites בעכברים וחולדות. ההליכים באותו החלות על מכרסמים אחרים, אם כי מינים של טפילים מצאו יהיה שונה.

Protocol

1. Endoparasite בדיקה (טבלה 1)

1. קלטת המבחן פי הטבעת (ראה גם סעיף 5; אלה מבוצעות בדרך כלל באותו זמן)

1. הסרת אורך ברור, לא חלבית, סרט צלופן מהמתקן. סרט צריך להיות ארוך מספיק כדי להתמודד על ידי מקצה אחד בלי לגעת באמצע (כ 5 ס"מ). זה יכול להיות קל יותר לוותר באורכים שונים בעת ובעונה אחת, צירופם קצה משטח עבודה נקי ושימוש כנדרש.
2. הרם עכבר מהכלוב שלה מקום על מכסה את הכלוב, מחזיק אותו בזנב. לבצע פעולה זו בארון זרימה למינרית או ארון biosafety אם מצבו הבריאותי של בעל החיים דורש את זה.
3. לרסן את העכבר בזנבו, הרמת רגליו האחוריות מהכלוב. לתפוס את הסוף של הסרט בין האגודל לאצבע, ולאחר מכן להחיל את האמצעי של הקלטת היטב חיץ הנקבים של העכבר, כולל את אזור פי הטבעת מספר פעמים. שיער צריך לראות כדי להיות חסיד לקלטת עבור assay כדי להיחשב מוצלח.
4. מניחים את העכבר בחזרה בכלוב.
5. מקום טיפה של שמן מינרלי בשקופית שכותרתו זכוכית נקי, להחיל את הסרט לשקופית, ולאחר מכן עוד טיפה של שמן מינרלי. מכסים להחליק כיסוי זכוכית.
6. קרא את השקופית באמצעות מיקרוסקופ מטרות 10x ו 40X על מיקרוסקופ אור. המבחן קלטת פריאנליות הוא הטוב ביותר באיתור ביצים Syphacia, למרות ביצים טפיל אחרים נמצאים לפעמים.

2. צואה הנפקה

1. להרכיב פתרון הנפקה, בקבוקון השטוחה (בקבוקון גלולה או התקן הנפקה צואה כגון Ovatector), צלחת פטרי, להחליק לכסות, שקופיות מיקרוסקופ, ואת המוליך / מקלות בחישה. פתרון floatation, כגון Fecasol, צריך הסגולי של 1.20-1.30 וניתן עשוי מלחי נתרן שונים, סוכר, אבץ סולפט, או נרכשו מסחרית. (טבלה 2)
2. איסוף 2-5 כדורי צואה מהכלוב או טריים מן החי (ים) לתוך תא הציפה. אם צואה יבשים מאוד, גם בגלל גיל או מין בהפקת צואה, מלחלחת את הצואה עם μl 500 תמיסת 0.9% עשוי להיות מועיל.
3. מניחים את הבקבוקון בצלחת פטרי כדי להגן על משטח עבודה של הצפת הצואה מומס. הוספת נפח קטן של המדיום floatation ומועכים ומערבבים היטב. אין חתיכות גדולות של חומר צריך להישאר. המשך להוסיף הנפקה בינוני עד לקבלת המניסקוס מעל קצה הבקבוקון.
4. מניחים את תלוש לכסות על המניסקוס ואת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. ביצים טפיל וכמה שביצים protozoan יעלה העליון לדבוק להחליק את המכסה.
5. לאחר דגירה, להרים להפוך את תלוש לכסות. מניחים את תלוש לכסות בשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
6. בדוק את השקופית באמצעות מטרות 10x ו 40X תחת מיקרוסקופ אור.
7. למרות low-tech וקל לבצע, באופן כללי, שיטה זו אינה מומלצת עכברים או חולדות. ככלל, הוא מתאים יותר לבעלי חיים המייצרים נפח גדול יותר של צואה.

3. ריכוז צנטריפוגה צואה ו

1. להרכיב פתרון הנפקה, צינור צנטריפוגות, להחליק לכסות, שקופיות מיקרוסקופ, ואת המוליך / מקלות בחישה וכובעים צינור. פתרון הנפקה צריך הסגולי של 1.18-1.30 וניתן עשוי מלחי נתרן שונים, סוכר, אבץ סולפט, או נרכשו מסחרית. (טבלה 2)
2. איסוף 2-10 כדורי צואה מהכלוב או טריים מן החי (ים) לתוך צינור איסוף. אם צואה יבשים מאוד, גם בגלל גיל או מין בהפקת צואה, מלחלחת את הצואה עם 500 μl של 0.9% מלוחים או עם פתרון הנפקה אתה משתמש עשוי להיות מועיל.
3. מערבבים מדגם בפתרון הנפקה המתאים בתוך שפופרת זכוכית צנטריפוגות. תסיסה מכונות עם vortexer ניתן להשתמש כדי לערבב דגימות. אם vortexer משמש, כובעים הצמד צריך להיות ממוקם על צמרות של הצינור כדי למנוע דליפה וזיהום לחצות. באופן שגרתי, דגימות ערוכים 1.18 סולפט הסגולי אבץ, אולם פתרונות אחרים ניתן להשתמש בנוסף (בצינור הכנה נפרד) או החלפה.
4. הוסף פתרון הנפקה נוספת בצינור כל להקים במניסקוס חיובית קלה על צינור אחד. החל להחליק מכסה פלסטיק צינור אחד, ולהבטיח כי במגע מלא עם השפה צינור מורכב. צינור פלייס (ים) לתוך בצנטריפוגה.
5. צנטריפוגה ב RCF כ 616-760 במשך 10 דקות. אם תלושי לכסות הולכים לאיבוד או נשבר במהלך תהליך צנטריפוגה, להחליק כיסוי חדש ניתן להציב על הצינור מדגם ואת הצינור יכול להיות מוטה בעדינות כך המניסקוס נוגע להחליק מכסה חדש. אין צנטריפוגה נוסף הוא הכרחי.
6. הסר לכסות להחליק מהצינור צנטריפוגות ומניחים על שכותרתה, שקופיות זכוכית נקי מיקרוסקופ. אם מספר פתרונות צנטריפוגה שימשו להעריך דגימה אחת צואה, שני תלושי לכסות יוטלו על שקופית זהה.
7. הכתם את השקופית עם יוד. זה מאפשר דוארasier זיהוי של ציסטות.
8. בדוק את השקופית באמצעות מטרות 10x ו 40X על מיקרוסקופ אור.

4. בדיקה ישירה של המעיים עבור helminths ו פרוטוזואה

1. מניחים את העכבר מורדמים או פגר עכברוש שכיבה על הגב קרש החיתוך נקי או משטח עבודה דומה.
2. בעזרת מלקחיים, להרים את דופן הבטן באזור איברי המין. בעזרת מספריים, לחתוך בזהירות את דופן הבטן הגחון מאזור איברי המין לבסיס בית החזה הסרת הן לעור שרירים חשיפת המעיים. הסר את המעיים, החל התריסריון (קטע של תחילת המעי ביציאה של הקיבה) וממשיכים המעי הגס היורד (קטע של המעי אשר מסתיים בפי הטבעת, ובדרך כלל מכיל צואה נוצרו).
3. מקום המעיים צלחת פטרי 100 מ"ל. איסוף חלק cecum ו התריסריון מן החיה את המקום ואת מורדמים על לוח לנתח. לחתוך כל קטע המעי לאורך לחשוף את רירית.
4. בעזרת מספריים, חותכים את המעיים הנותרים לחלקים קטנים. הוספת מספיק מים מהברז כדי בצלחת לצלול בקושי את הרקמה שנאספו.
5. דגירה את התערובת מדגם ב 35-40 מעלות צלזיוס בתנור מעבדה או חממה עבור מינימום של 10 דקות. זה יהיה לשחרר ולחשוף helminths luminal. אמנם המדגם הוא דוגרים, לבצע את הפעולות הבאות.
6. מניחים שתי טיפות של תמיסת מלח בצד 0.9% לצד בשקופית שכותרתו אחת, כדי לאפשר הכנת דגימות שני פלחי מעיים (התריסריון ו cecum).
7. מחממים לעקר מגניב לולאה inoculating או שווה ערך.
8. לגרד את רירית של תריסריון והמקום מהצרצורים בצד השמאלי של השקופית (בצד הקרוב לקצה חלבית).
9. לגרד את רירית של cecum ואת המקום מהצרצורים מ בצד ימין של השקופית.
10. למעלה את מה שאגר עם תלוש כיסוי. בדוק שקופיות שהוכנו באמצעות המטרה 40X תחת מיקרוסקופ לעומת שלב); הגדלה להגדיל כנדרש לצורך זיהוי. אם טפילים מזוהים, לזהות המבוסס על מורפולוגיה.
11. התכנים תבשיל יהיה מוכן לבדיקה על ידי בנקודה זו. בדוק את תוכן צלחת תחת מיקרוסקופ לנתח. השתמש בדיקה או מקל המוליך לפי הצורך להעביר תוכן בתוך צלחת להשלמת בדיקה יסודית. אם ותולעי סיכה נוכחים הם יופיעו קטן, לבן שיער כמו תולעים. אם תולעי נמצאים, הם יופיעו, מפולח תולעים שטוחות (גדול יותר החוט כמו ותולעי סיכה).
12. אם helminths מזוהים או חשד, לאסוף את הדגימה באמצעות זוג קטן של מלקחיים.
13. הר הדגימה בשקופית, שכותרתו זכוכית נקי טיפת שמן פרפין או מינרלים במקום להחליק על גבי העטיפה של הדגימה. בדוק את השקופית באמצעות מטרות 10x ו 40X על מיקרוסקופ אור.

2. Ectoparasite בדיקה (לוח 3)

5. פרווה לתלוש בדיקה עבור ectoparasites (מבחן קלטת)

1. הסרת אורך ברור, לא חלבית, סרט צלופן מהמתקן. סרט צריך להיות ארוך מספיק כדי להתמודד על ידי מקצה אחד בלי לגעת באמצע (כ 5 ס"מ). זה יכול להיות קל יותר לוותר באורכים שונים בעת ובעונה אחת, צירופם קצה משטח עבודה נקי ושימוש כנדרש.
2. הרם עכבר או עכברוש מהכלוב שלה מקום על מכסה את הכלוב, מחזיק אותו בזנב. לבצע פעולה זו בארון זרימה למינרית או ארון biosafety אם מצבו הבריאותי של בעל החיים דורש את זה.
3. לרסן את העכבר או החולדה. אחוז פרווה עם hemostats בעדינות לתלוש פרווה מאזור השכמה של העכבר, באזור צוואר הרחם הגחון, באזור בית השחי, אזור המפשעה, הגב ואת הישבן. מניחים את הפרווה בקלטת. שיער צריך לראות כדי להיות חסיד לקלטת עבור assay כדי להיחשב מוצלח. מניחים את העכבר או בחזרה חולדה בכלוב שלה.
4. מקום טיפה של שמן מינרלי בשקופית שכותרתו כוס נקייה: להחיל את הקלטת, אז עוד טיפה של שמן מינרלי. מכסים להחליק כיסוי זכוכית.
5. קרא את השקופית באמצעות מיקרוסקופ מטרות 10x ו 40X תחת מיקרוסקופ אור.
6. בדיקה זו היא הטובה ביותר לאיתור קרדית פרווה כגון Radfordia, Myobia ו Myocoptes.

6. עור מגרד

1. להרכיב את החומרים הבאים: בעלי חיים להיבדק, שמן מינרלי, שקופיות מיקרוסקופ, להחליק לכסות, אזמל, ומספריים. אם המבחן הזה הוא להתבצע על בעלי חיים, הם צריכים להיות מורדם לפני תחילת.
2. מדגם dorsum ליד בסיס הזנב ובאזור הזמני של הראש. לחלופין, נגעים בעור ו / או באתרים אחרים עשויים להיות מגורד.
3. עמוק לגרד את העור בסכין אזמל בכיוון הנגדי של צמיחת השיער, לשחוק את האפידרמיס. זמירה את המעיל שיער לפני גירוד עשוי לשפר את הרגישות ההקרנה על ידי הפחתת חסימה ויזואלית (שיער עודף) עלשקופיות.
4. מניחים טיפת שמן בשקופית. החל את המדגם עד טיפת שמן על ידי מנגב את הלהב (עם מדגם המצורפת) על פני השקופית. הוספת שמן נוסף לשקופית במידת הצורך, עם למעלה להחליק כיסוי.
5. קרא את השקופית באמצעות מיקרוסקופ מטרות 10x ו 40X תחת מיקרוסקופ אור.
6. לגרד את העור משמש בדרך כלל כדי לזהות Demodex (ופטריות dermatophytic).

7. בדיקה ישירה של pelage

1. מניחים את העכבר עכברוש מורדמים או על הבמה של מיקרוסקופ לנתח.
2. בדוק את שערות הפרווה ב 10X כ באמצעות מקל המוליך או מכשיר דומה לחלק את השיער ולבחון את הבסיס של השערה.
3. בדוק את אזור הגולגולת, בין העיניים pinnae, בין pinnae, בין השכמות, מתחת בלסת, באזורים מפשעתי ואת בית השחי. לחלופין, פגר כולה עשויה להיבחן.
4. איסוף כל ectoparasites או חומר חשוד לראות באמצעות זוג קטן של מלקחיים. Ectoparasites לעיתים קרובות נראים כמו קשקשים או הצטברות שעווה צהובה בבסיס של מוט שיער או ישירות על העור.
5. הר הדגימה בשקופית זכוכית נקי טיפה של שמן פרפין או מינרלים במקום להחליק על גבי העטיפה של הדגימה. בדוק את השקופית באמצעות מטרות 10x ו 40X תחת מיקרוסקופ אור.

3. נציג תוצאות:

ראו קבצים מצורפים זיהוי טפילים הבאים: (הערה: נהלים אלה יזהה כל ביצה, helminth, או בהווה ציסטה בצואה או על עור ופרווה, רק מעטים אלה מוצגים להלן)

Endoparasites:

Syphacia muris (ביצה, תולעת)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (ביצה, תולעת)	Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera (ביצה, תולעת)	Retortamonas sp.
Rodentolepis נענע (ביצה, תולעת)	טפילים spp.
Tritrichomonas muris	Spironucleus muris
Entamoeba muris

Ectoparasites:

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia musculi

	מבחן Tape	צואה הנפקה	ה-FCC	הבחינה ישיר 1	PCR
פרוטוזואה	-	+	+ +	+ + +	+ + + / NA 2
Metazoa
מרצעית	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
שרשור 5	-	+	+ +	+ + +	NA
תולעים עגולות אחרים 5	-	+	+ + +	+ + +	NA

^1. שיטה זו מחייבת המתת חסד של החיה.
^2. אין שיטות זיהוי PCR זמין כעת עבור כל protozoan.
^3. שיטה זו היא המתאימה ביותר כדי לזהות Syphacia spp.
^4. שיטה זו יהיה סיכוי רב יותר לאיתור Aspiculuris, ואת הסיכוי לזהות Syphacia.
^5. תולעי סרט תולעים עגולות ותולעי סיכה אחר מאשר הם נדירים מאוד בעכברים וחולדות מעבדה המודרנית.

1. טבלת מחזור endoparasite ואת שיטת הזיהוי המתאים. חלק מהשיטות ידרוש המתת חסד של החיה. NA מציין שיטה אינה זמינה עבור טפילים אלה + מציין התאמתו של השיטה לגילוי של הטפיל המדובר, ו -. מציינת כי השיטה אינה מומלצת טפיל זה.

פתרון	משקל סגולי	מצרכים 1 ליטר לכל H 2 O
נתרן כלורי	1.20	311 גרם נתרן כלורי
נתרן חנקתי	1.20	338 גרם נתרן חנקתי
נתרן חנקתי	1.30	616 גרם נתרן חנקתי
סוכר	1.20	1170 גרם סוכרוז 1
Sheather של סוכר	1.27-1.30	1563 גרם סוכרוז 1
אבץ סולפט	1.18	493 גרם אבץ סולפט

^1. פתרונות אלה דורשים קירור או תוספת של 9 מ"ל פנול כחומר משמר.

טבלה 2. פתרונות הנפקה צואה (מ סמית et al.)

	פרווה לתלוש (מבחן קלטת)	העור מגרד 1	הבחינה ישיר 1	PCR
כנים	-	-	+ +	NA
קרדית	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
פרעושים 4	-	-	+	NA
קרציות 4	-	-	+ +	NA

^1. שיטה זו דורשת הרדמה אם היא תבוצע על החי.
^2. שיטה זו מחייבת המתת חסד של החיה.
^3. אין שיטות זיהוי PCR זמין כעת עבור כל מין של קרדית.
^4. פרעושים וקרציות הם נדירים ביותר במתקנים מודרניים בעלי חיים במעבדה.

3. טבלת מחזור ectoparasite ואת שיטת הזיהוי המתאים. חלק מהשיטות ידרוש המתת חסד של החיה, ושיטות אחרות ידרוש הרדמה לבצע אותם בבעלי חיים. NA מציין שיטה אינה זמינה עבור טפילים אלו. NA מציין שיטה אינה זמינה עבור טפילים אלה + מציין התאמתו של השיטה לגילוי של הטפיל המדובר, ו -. מציינת כי השיטה אינה מומלצת טפיל זה.

Discussion

כאשר עובד במעבדה, בטיחות צריכה להיות תמיד דאגה. זכור ללבוש ציוד מגן מתאים כאשר עובדים עם בעלי חיים כדי לנקות תחנת העבודה שלך עם חומר חיטוי לפני ואחרי. שיטות אלה נועדו בעיקר כדי למצוא טפילים של מכרסמים במעבדה במקומות שנבדקו, כלומר, הם יכולים לזהות אקזוטיים או טפילים נדירים ביותר, כמו גם את ותולעי סיכה יותר נפוצים קרדית פרווה. למרות שהם חלים גם על מינים אחרים, מכרסמים בר ייתכן טפילים נוספים במקומות כגון subcutis הכבד, המוח, לא הוערכו על ידי השיטות הנ"ל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting board	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Cat #36114
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5910, G204	23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6808, G207	5”
Forceps-Curved	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8254 (M1/21004)	4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8160	Rat tooth
Metal probe	VWR international	Cat#25778-000
Hemostats	Vantage	V97-48
Applicator sticks	Puritan	6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ51, Schott, ACE1
Petri dish	VWR international	100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips	VWR international	Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides	VWR international	VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop	VWR international	Cat#50815-040
Light microscope	Olympus Corporation	Model#BX41TF
Laboratory oven	Quincy Lab Inc.	Model 10 Lab Oven
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Vortexer	VWR international	Mini-Vortexer
Test tube	Kimble Chase	15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips	VWR international	Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps	VWR international	Cat#60869-089
Iodine	Rowley biochemical institute	Cat#SO-364
Zinc sulfate	Sigma-Aldrich	Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#8360-06
Phenol	EMD Millipore	Cat#PX0510-1
Cellophane tape	Staples	Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#6358