Summary
この記事ではendo -または外部寄生を検出するスクリーニングのラットとマウスの様々な手順を説明します。いくつかの診断アッセイが実証され、生きた動物での使用に適したものと動物の安楽死の後に使用されているもの両方。ラットとマウスの寄生虫の同定に役立つように写真が含まれます。
Abstract
内部および外部寄生虫は、実験室のげっ歯類の施設で重要な心配の種である、と多くの研究施設は、いくつかの寄生動物を抱く。寄生虫の動物の調査に着手する前に、二つのことを考慮する必要があります。 One：何を使用すると、収集した情報で作られ、二つになります：どのテストが最も適切です。動物は寄生されていることを知ることは、施設を受け入れるが、動物の治療にして、治療の有効性を判断する必要がしばしばあることなのかもしれません。寄生虫は、ライブまたは安楽死させた動物から採取したサンプルを含む様々な技術を通じて、動物で検出されることがあります。 PCRは、寄生虫のいくつかのタイプのための高感度のテストを許可しているものの、歴史的に、最大の診断感度テストでは、動物の安楽死を必要とした。この記事はの検出エンドおよびマウスとラットにおける外部寄生虫のための手順を示しています。見つかった寄生虫の種類が異なりますが、同様の手順では、他のげっ歯類にも適用可能である。
Protocol
1。内部寄生虫の検査（表1）
1。肛門周囲のテープテスト（また第5節を参照して、これらは通常、同時に実行される）
- ディスペンサーから明らかではなく、つや消し、セロハンテープの長さを削除します。テープは真ん中を（約5cm）に触れることなく一方の端で処理する十分な長さでなければなりません。それは清潔な作業面の端に取り付けると、必要に応じて使用して、一度に数種類の長さを分配する方が簡単な場合があります。
- しっぽをつかんで、ケージのふたの上にケージや場所からマウスを持ち上げて。動物の健康状態がそれを必要とする場合、層流キャビネットまたは生物学的安全キャビネットにこのアクションを実行します。
- ケージから後ろ足を持ち上げて、尾でマウスを抑制する。親指と人差し指の間にテープの端をつかみ、その後、肛門周辺部に数回を含めて、しっかりとマウスの陰にテープの中央を適用する。髪の毛は成功と見なされるにアッセイのためにテープに付着しているために見られるべきである。
- ケージに戻ってマウスを置きます。
- その後、ラベルの付いた清潔なスライドガラス、スライドにテープを適用し、鉱物油の別のドロップの鉱物油の滴を置きます。ガラスカバースリップでカバーしています。
- 光学顕微鏡で10倍と40倍の目標を使用して、顕微鏡のスライドをお読みください。他の寄生虫の卵が時々発見されているものの、肛門周囲のテープテストは、Syphaciaの卵の検出に最適です。
2。糞便浮遊選鉱
- 浮遊液を、平底バイアル（などOvatectorのような錠剤のバイアルまたは糞便浮揚装置）、ペトリ皿、カバーガラス、顕微鏡スライド、およびアプリケータ/攪拌棒を組み立てます。このようなFecasolとしてフローテーションソリューションは、1.20から1.30の比重を持つ必要がありますし、様々なナトリウム塩、砂糖、亜鉛硫酸塩、または、市販のから行うことができる。 （表2）
- 浮力室にケージや動物からの新鮮な（S）2から5まで糞を採取します。糞便は0.9％生理食塩水500μlので糞を潤し、非常に乾燥し、どちらの年齢や糞便を生産する種が原因であれば有益かもしれません。
- 溶存糞便のオーバーフローから作業面を保護するためのペトリ皿にバイアルを置きます。フローテーションメディアとマッシュの少量を加えてよく混ぜる。資料の大部分が残っていないはず。バイアルのエッジ上にメニスカスが形成されるまで浮揚媒体を追加していきます。
- メニスカス上にカバースリップを置き、室温で15分間インキュベートする。寄生虫の卵と、いくつかの原生動物のオーシストは、上部に上昇し、カバーガラスに付着される。
- インキュベーション後、カバースリップを持ち上げ、反転させる。ガラスの顕微鏡スライド上にカバースリップを置きます。
- 光学顕微鏡下で10倍と40倍の目標を使用してスライドを調べます。
- ローテクと実行するのは簡単ですが、一般的に、このテクニックは、マウスやラットでは推奨されません。原則として、それは糞の大きなボリュームを作る動物に適しています。
3。糞便中濃度と遠心分離
- 浮遊液を、遠心管、カバーガラス、顕微鏡スライド、およびアプリケータ/攪拌棒とチューブのキャップを組み立てます。浮遊液は、1.18から1.30の比重を持つ必要がありますし、様々なナトリウム塩、砂糖、亜鉛硫酸塩、または、市販のから行うことができる。 （表2）
- コレクションチューブにケージや動物からの新鮮な（S）2から10まで糞を採取します。糞便は0.9％生理食塩水500μlのと、浮遊液と糞便を潤し、非常に乾燥した、どちらかの年齢や糞便を生産する種が原因である場合は、使用しているが有益であるかもしれません。
- ガラス遠沈管内の適切な浮遊液にサンプルを混ぜる。ボルテックスと機械的な攪拌は、サンプルを混合するために使用することができます。ボルテックスが使用されている場合、スナップキャップが流出し、交差汚染を防ぐために管の頂上に配置する必要があります。日常的に、サンプルは1.18比重の硫酸亜鉛に用意されている、しかし他のソリューションは、さらに（別の準備のチューブ内）でまたは置換して使用することができる。
- 各チューブにわずかな正のメニスカスを形成するために各チューブに、追加の浮遊液を追加します。各チューブにプラスチック製カバースリップを適用し、チューブのリップと完全に接触が行われていることを確認してください。場所の管（S）遠心分離機に。
- 10分間、約616から760 RCFで遠心。カバースリップを紛失したり、遠心分離処理中に壊れている場合は、新しいカバースリップは、サンプル管に配置することができますし、チューブを穏やかにメニスカスが新しいカバースリップに触れるようにチップを渡したことができます。追加の遠心は必要ありません。
- ラベルの付いた、きれいなガラスの顕微鏡スライド上に遠心管からスリップと場所をカバー取り外します。複数の遠心分離のソリューションを1つの糞試料を評価するために使用された場合は、2つのカバースリップが同じスライド上に配置されることがあります。
- ヨウ素とのスライドを染色。これは、電子を可能に嚢胞のアシエルの識別。
- 光学顕微鏡で10倍と40倍の目標を使用してスライドを調べます。
4。直接蠕虫のための腸の検査と原生動物
- きれいな解剖ボードまたは類似の作業台の上に背側横臥位で安楽死させたマウスやラットの死体を置きます。
- 鉗子を使用して、陰部で腹壁を持ち上げ。はさみを使用して、慎重に陰部の皮膚と筋肉の両方を削除し、腸を露出胸郭のベースに腹側腹壁を切開する。十二指腸（小腸のセグメントは、胃の出口で始まる）から始まり、下行結腸（肛門で終わると通常形成された糞便を含んでいる腸の部分）に続けて、腸を削除します。
- 100ミリリットルをペトリ皿の中で腸を置きます。解剖ボード上の安楽死動物や場所から盲腸と十二指腸の部分を集める。粘膜を公開するために縦に各腸部分を切開する。
- はさみを使って、小さなセクションに残りの腸を切る。かろうじて水没収集した組織をに料理するのに十分な水道水を追加。
- 35〜40℃で最低10分間実験室のオーブンまたはインキュベーターでサンプルの混合物をインキュベートする。これは、管腔の蠕虫を解放し、公開します。サンプルはインキュベートされている間、次の手順を実行します。
- 2つ配置腸部分（十二指腸と盲腸）からサンプルの調製を可能にするために単一のラベルが付いたスライド上の側0.9％生理食塩水側に2滴、。
- 白金耳または同等のものを滅菌し、冷却加熱。
- 十二指腸の粘膜をこすり取ってスライド（すりガラスの端に近い側）の左側に擦過を置きます。
- 盲腸の粘膜をこすり取ってスライドの右側から擦過を置きます。
- カバースリップで擦過して戻る。位相差顕微鏡下で40倍対物レンズを用いてプレパラート）を調べ、識別のために、必要に応じて増加の倍率。寄生虫が検出された場合は、形態に基づいて識別する。
- 料理の内容は、この時点で審査するための準備が整います。解剖顕微鏡下で料理の内容を調べます。徹底的な調査を完了するために皿の中で内容を移動するために必要に応じてプローブまたはアプリケータースティックを使用。蟯虫が存在する場合、それらは小さく、白、毛のようなワームとして表示されます。サナダムシが存在する場合、これらはセグメント化された、フラットワーム（蟯虫のようなスレッドよりも大きい）として表示されます。
- 蠕虫が検出されたか、疑われる場合は、鉗子の小さなペアを使用して試料を収集する。
- パラフィンや鉱物油の滴のラベルが付いた、きれいなガラススライド上に試料をマウントし、試料の上にカバースリップを配置。光学顕微鏡で10倍と40倍の目標を使用してスライドを調べます。
2。外部寄生虫の検査（表3）
5。毛皮は、外部寄生虫の審査（テープテスト）を取り出さなけれ
- ディスペンサーから明らかではなく、つや消し、セロハンテープの長さを削除します。テープは真ん中を（約5cm）に触れることなく一方の端で処理する十分な長さでなければなりません。それは清潔な作業面の端に取り付けると、必要に応じて使用して、一度に数種類の長さを分配する方が簡単な場合があります。
- しっぽをつかんで、ケージのふたの上にケージや場所からマウスやラットを持ち上げます。動物の健康状態がそれを必要とする場合、層流キャビネットまたは生物学的安全キャビネットにこのアクションを実行します。
- マウスまたはラットを抑制する。止血と毛皮を持ち、ゆっくりとマウスの肩甲骨の領域、腹側頸部、腋窩エリア、鼠径部、および背尻から毛をむしる。テープ上に毛皮を置きます。髪の毛は成功と見なされるにアッセイのためにテープに付着しているために見られるべきである。その檻の中のマウスまたはラットの背面に置きます。
- ラベルの付いた清潔なスライドグラス上にミネラルオイルの滴を置き、ミネラルオイルの別のドロップして、テープを適用します。ガラスカバースリップでカバーしています。
- 光学顕微鏡下で10倍と40倍の目標を使用して顕微鏡スライドをお読みください。
- この検査はRadfordia、Myobia、およびMyocoptesなどの毛皮のダニを検出するために最適です。
6。皮膚の擦り傷
- 以下の材料を組み立てる：動物テストするが、鉱物油、顕微鏡スライド、カバースリップ、メス、はさみ。このテストは、生きた動物で実行する場合、彼らが始まる前に麻酔してください。
- 尾の付け根と側頭部の近くに背をお試しください。また、皮膚病変および/または他のサイトをこすり落とすことができる。
- 深く表皮を侵食し、髪の成長の反対方向に手術用メスの刃で皮膚をこすり落とす。スクレイピングする前に被毛をトリミングすることで視覚的な閉塞（過剰髪を）減らすことで、スクリーニングの感度を向上させることがスライド。
- スライド上で油の滴を置きます。スライドの表面にブレードを（サンプルが添付された）拭いて油滴にサンプルを適用します。必要に応じてスライドし、カバースリップ上に追加の油を追加。
- 光学顕微鏡下で10倍と40倍の目標を使用して顕微鏡スライドをお読みください。
- 皮膚のレイプは、一般的にDemodexを （および皮膚糸状菌）を検出するために使用されます。
7。 pelageの直接検査
- 解剖顕微鏡のステージ上で安楽死させたマウスやラットを置きます。
- 一部の髪をしてアプリケータースティックまたは類似の楽器を使用して約10倍で、毛皮の毛を調べ、毛幹の基部を観察。
- 目や耳介、耳介の間に、肩甲骨の間に、顎の下、および鼠径部や腋窩領域の間で、脳神経領域を調べます。また、全体の死体を調べることができる。
- 任意の外部寄生虫や鉗子の小さなペアを使用して見られる不審な材料を集める。外部寄生虫は、多くの場合、フケや毛幹の基部に直接皮膚に黄色の蝋状の蓄積のようになります。
- パラフィンや鉱物油の滴で清浄なガラススライド上に試料をマウントし、試料の上にカバースリップを配置。光学顕微鏡下で10倍と40倍の目標を使用してスライドを調べます。
3。代表的な結果：
以下の寄生虫を識別する添付ファイルを参照してください：（注：これらの手順は、糞便中に入ったり皮膚や毛皮の上の任意の卵、寄生虫、または嚢胞の存在を検出する、これらの一部のみを以下にリストされている）
Endoparasites：
| ネズミ蟯虫 （卵、ワーム） | Chilomastix bettencourti |
| Syphacia obvelata（卵、ワーム） | Hexamastixムリス |
| Aspiculuris tetraptera（卵、ワーム） | Retortamonas SP。 |
| Rodentolepisナナ （卵、ワーム） | ジアルジア属。 |
| Tritrichomonasムリス | Spironucleusムリス |
| アメーバムリス |
外部寄生虫：
| Myocoptes musculinis | Radfordiaアフィニス |
| Myocoptes musculinis | Radforidaキリギリス亜目 |
| Myobiaの筋 |
| テープテスト | 糞便浮遊選鉱 | FCC | 直接試験1 | PCR | |
| 原生動物 | - | + | + + | + + + | + + + / NA 2 |
| 後生動物 | |||||
| 蟯虫 | + / - 3 | + / - 4 | + 4 | + + + | + + + |
| サナダムシ5 | - | + | + + | + + + | NA |
| 他の回虫5 | - | + | + + + | + + + | NA |
（1）このメソッドは、動物の安楽死を必要とします。
（2）すべての原生動物のための現在利用可能なPCR検出方法が不足しています。
（3）このメソッドは、Syphacia属を検出するために最も適切です。
（4）このメソッドは、Aspiculurisを検出する可能性が高くなる、とSyphaciaを検出する可能性が低くなります。
5蟯虫以外のサナダムシ、回虫は、近代的な実験用マウスおよびラットでは非常にまれです。
内部寄生虫及び適切な検出方法の表1。クラス。いくつかのメソッドは、動物の安楽死を必要とします。 NAは、メソッドは、現在これらの寄生虫に対して使用できないことを示します+質問の寄生虫の検出方法の適合性を示す、と - 。手法は、その寄生虫のために推奨されていないことを示します。
| ソリューション | 特定の重力 | 1L H 2 Oあたりの成分 |
| ナトリウム塩化 | 1.20 | 311グラムの塩化ナトリウム |
| 硝酸ナトリウム | 1.20 | 338グラムの硝酸ナトリウム |
| 硝酸ナトリウム | 1.30 | 616グラムの硝酸ナトリウム |
| シュガー | 1.20 | 1170グラムのショ糖1 |
| シェザーの砂糖 | 1.27から1.30 | 1563グラムのショ糖1 |
| 亜鉛硫酸 | 1.18 | 493グラムの硫酸亜鉛 |
（1）これらのソリューションは、冷凍や防腐剤としてフェノール9ミリリットルの添加を必要とする。
表2。糞便浮遊液（Smith らから。）
| 毛皮は（テープテスト）を取り出さなけれ | 皮膚のこすり1 | 直接試験1 | PCR | |
| シラミ | - | - | + + | NA |
| ダニ | + | + | + + + | + + + / NA 3 |
| ノミ4 | - | - | + | NA |
| ダニ4 | - | - | + + | NA |
それは生きている動物で実行する場合は、1。このメソッドは、麻酔を必要とします。
（2）このメソッドは、動物の安楽死を必要とします。
（3）ダニのすべての種のための現在利用可能なPCR検出方法が不足しています。
（4）ノミやダニは、近代的な実験動物施設では極めてまれです。
外部寄生虫と、適切な検出方法の表3。クラス。いくつかのメソッドは、動物の安楽死を必要とする、そして他の方法は、麻酔が生きている動物で、それらを実行するために必要になります。 NAは、メソッドは、現在これらの寄生虫に対して使用できないことを示します。 NAは、メソッドは、現在これらの寄生虫に対して使用できないことを示します+質問の寄生虫の検出方法の適合性を示す、と - 。手法は、その寄生虫のために推奨されていないことを示します。
Discussion
実験室で作業する場合、安全性は常に問題になるはず。動物を扱う場合に適切な保護具を着用すると前と後の消毒薬を使用してワークステーションを清掃することを忘れないでください。これらのメソッドは、主に、すなわちを検討し、彼らはエキゾチックなまたは非常に稀寄生虫だけでなく、より一般的な蟯虫と毛皮のダニを検出できる場所に実験用げっ歯類のいずれかの寄生虫を見つけるために設計されています。彼らは他の種にも等しく適用可能であるが、野生のげっ歯類は、上記の方法で評価されない、などの肝臓、皮下組織、脳などの場所で追加の寄生虫があるかもしれません。
Disclosures
著者らは、上記のテストを含むチャールズリバー、診断テストや試薬の供給者、すべての従業員です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5” length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5” |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5”, serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8160 | Rat tooth |
| Metal probe | VWR international | Cat#25778-000 | |
| Hemostats | Vantage | V97-48 | |
| Applicator sticks | Puritan | 6in Applicators, Ref#807 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ51, Schott, ACE1 | |
| Petri dish | VWR international | 100mm, Cat#3401PDNL | |
| Cover slips | VWR international | Micro cover glass, Cat#48366-067 | |
| Slides | VWR international | VistaVision microscope slides Cat#16004-368 | |
| Inoculating loop | VWR international | Cat#50815-040 | |
| Light microscope | Olympus Corporation | Model#BX41TF | |
| Laboratory oven | Quincy Lab Inc. | Model 10 Lab Oven | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Vortexer | VWR international | Mini-Vortexer | |
| Test tube | Kimble Chase | 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15 | |
| Cover slips | VWR international | Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049 | |
| White caps | VWR international | Cat#60869-089 | |
| Iodine | Rowley biochemical institute | Cat#SO-364 | |
| Zinc sulfate | Sigma-Aldrich | Cat#1000917519, Z4750-500G | |
| Sucrose | Mallinckrodt Baker Inc. | Cat#8360-06 | |
| Phenol | EMD Millipore | Cat#PX0510-1 | |
| Cellophane tape | Staples | Invisible tape, Cat#504712 | |
| Mineral oil | Mallinckrodt Baker Inc. | Cat#6358 |
References
- Baker, D. G. Chapter 23. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
- Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. , Blackwell. 303-398 (2007).
- Owen, D. G. Parasites of Laboratory Animals. 12, Royal Society of Medicine. (1992).
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- Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. , Blackwell. 1-13 (2007).
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