El diagnóstico de ecto y endoparásitos en ratas y ratones de laboratorio

Summary

Este artículo describe los diversos procedimientos de selección para las ratas y ratones para detectar endo-o ectoparasitismo. Varios ensayos de diagnóstico se ha demostrado, tanto las que son adecuadas para su uso en animales vivos y los que se utilizan después de la eutanasia del animal. Fotografías para ayudar en la identificación de los parásitos de ratas y ratones se incluirán.

Abstract

Parásitos internos y externos siguen siendo una preocupación importante en las instalaciones de roedores de laboratorio, y muchas instalaciones de investigación puerto algunos animales parasitados. Antes de embarcarse en un examen de los animales contra los parásitos, dos cosas deben ser consideradas. Uno: ¿qué va a hacer uso de la información recogida, y dos: que la prueba es la más adecuada. Sabiendo que los animales tienen parásitos puede ser algo que el centro acepta, pero a menudo hay una necesidad de tratar a los animales y luego para determinar la eficacia del tratamiento. Los parásitos pueden ser detectados en los animales a través de varias técnicas, incluyendo las muestras tomadas de animales vivos o sacrificados. Históricamente, las pruebas con mayor sensibilidad diagnóstica necesaria la eutanasia del animal, a pesar de PCR ha permitido que las pruebas de alta sensibilidad para varios tipos de parásitos. En este artículo muestra los procedimientos para la detección de endo-y ectoparásitos en ratones y ratas. Los mismos procedimientos se aplican a otros roedores, aunque las especies de parásitos que se encuentran son diferentes.

Protocol

1. Endoparásitos examen (Tabla 1)

1. Prueba de la cinta perianal (véase también la sección 5, los cuales generalmente se realizan al mismo tiempo)

1. Quite un trozo de claro, no mate, cinta de celofán de un dispensador. La cinta debe ser lo suficientemente largo para manejar por un fondo sin haber tocado la mitad (aproximadamente 5 cm). Puede ser más fácil prescindir de varias longitudes de una sola vez, uniéndolos a la orilla de una superficie de trabajo limpia y usar cuando sea necesario.
2. Levantar un ratón de la jaula y el lugar en la tapa jaula, sujetándolo por la cola. Realizar esta acción en una cabina de flujo laminar o gabinete de bioseguridad, si el estado de salud del animal lo requiere.
3. Restringir el ratón por la cola, levantando las patas traseras de la jaula. Sujete el extremo de la cinta entre los dedos pulgar e índice, a continuación, aplicar la mitad de la cinta con firmeza para el perineo con el ratón, incluyendo el área varias veces perianal. El pelo debe ser visto para ser adherente a la cinta para que el ensayo puede considerarse positivo.
4. Vuelva a colocar el ratón en la jaula.
5. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de vidrio etiquetados limpia, aplique la cinta a la diapositiva, y luego otra gota de aceite mineral. Cubra con una hoja de cubierta de vidrio.
6. Lea el portaobjetos de microscopio con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz. La prueba de la cinta perianal es el mejor en la detección de huevos Syphacia, aunque otros huevos del parásito se encuentran a veces.

2. Flotación fecal

1. Ensamble solución de flotación, un frasco de fondo plano (vial píldora o el dispositivo de flotación fecal como Ovatector), placa de Petri, cubreobjetos, portaobjetos de microscopio, y el aplicador / pega agitación. Solución de flotación, como Fecasol, debe tener un peso específico de 1.20 a 1,30 y se pueden hacer de diferentes sales de sodio, azúcar, sulfato de zinc, o adquiridos comercialmente. (Tabla 2)
2. Recoger 2-5 pellets fecales de la jaula o el fresco del animal (s) en la cámara de flotación. Si las heces son extremadamente secas, ya sea por edad o por las especies productoras de la materia fecal, humedeciendo las heces con 500 l de solución salina al 0,9% puede ser beneficiosa.
3. Colocar el vial en la placa de Petri para proteger la superficie de trabajo de desbordamiento de heces disueltas. Añadir un pequeño volumen de medio de flotación y el puré y revuelva bien. No hay grandes trozos de material debe permanecer. Continúe agregando medio de flotación hasta que se forma un menisco por encima del borde del vial.
4. Coloque la hoja de la cubierta en el menisco y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. Huevos de parásitos y algunos ooquistes de protozoos subirá a la cima y se adhieren a la hoja de la cubierta.
5. Después de la incubación, levante y se invierte el cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio.
6. Examinar el portaobjetos con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz.
7. Aunque de baja tecnología y fácil de realizar, en general, esta técnica no se recomienda para los ratones o ratas. Como regla general, es más adecuada para los animales que producen un mayor volumen de las heces.

3. Concentración de materia fecal y la centrifugación

1. Ensamble solución de flotación, tubo de centrífuga, cubreobjetos, portaobjetos de microscopio, y el aplicador / pega agitación y las tapas del tubo. Solución de flotación deben tener un peso específico de 1.18 a 1.30 y se pueden hacer de diferentes sales de sodio, azúcar, sulfato de zinc, o adquiridos comercialmente. (Tabla 2)
2. Recoger 20-10 bolitas fecales de la jaula o frescos del animal (s) en un tubo de recogida. Si las heces son extremadamente secas, ya sea por edad o por las especies productoras de la materia fecal, humedeciendo las heces con 500 l de solución salina 0,9% o con la solución de flotación que está usando puede ser beneficioso.
3. Mezclar la muestra en una solución de flotación adecuada dentro de un tubo de centrífuga de vidrio. Agitación mecánica con un vórtice puede ser usada para mezclar las muestras. Si se utiliza un vórtice, tapas de presión debe ser colocado en la parte superior del tubo para evitar derrames y la contaminación cruzada. De forma rutinaria, las muestras se preparan en 1,18 sulfato de zinc específica gravedad, sin embargo otras soluciones se pueden utilizar, además de (en un tubo de preparación por separado) o en la sustitución.
4. Añadir la solución de flotación adicional a cada tubo para formar un menisco ligeramente positivo en cada tubo. Aplicar una hoja de cubierta de plástico para cada tubo, y asegurar que el contacto completo con el labio tubo está hecho. Colocar el tubo (s) en la centrífuga.
5. Se centrifuga a aproximadamente 616-760 RCF durante 10 minutos. Si cubres se pierde o se rompe durante el proceso de centrifugación, una hoja de cubierta nueva se puede colocar en el tubo de muestra y el tubo puede ser ligeramente inclinado de manera que el menisco toca la hoja de la cubierta nueva. No centrifugación adicional es necesaria.
6. Retire la tapa de deslizamiento de tubo de centrífuga y colocar en una etiqueta, portaobjetos limpio de vidrio. Si las soluciones de múltiples centrifugación se utilizaron para evaluar una muestra de heces, dos cubreobjetos se puede colocar en la misma diapositiva.
7. Mancha de la diapositiva con el yodo. Esto permite easier la identificación de los quistes.
8. Examinar el portaobjetos con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz.

4. El examen directo de los intestinos de helmintos y protozoos

1. Coloque el ratón o la eutanasia cadáver de rata en decúbito dorsal sobre una tabla de disección limpia o superficie de trabajo similar.
2. Con unas pinzas, levantar la pared abdominal en la zona genital. Con la tijera, cortar cuidadosamente la pared abdominal ventral de la zona genital a la base de la caja torácica quitar la piel y el músculo y la exposición de los intestinos. Quitar los intestinos, comenzando en el duodeno (el segmento de intestino el principio en la salida del estómago) y continuando hasta el colon descendente (el segmento del intestino que termina en el ano y por lo general contiene materia fecal formada).
3. Intestinos dentro de una cápsula de Petri de 100 ml. Recoger una parte del ciego y el duodeno de los animales sacrificados y el lugar en una tabla de disección. Incisión en cada segmento intestinal a lo largo para exponer la mucosa.
4. Con la tijera, cortar el intestino restantes en pequeñas secciones. Agregar suficiente agua del grifo para el plato que apenas sumergir el tejido recolectado.
5. Incubar la mezcla de muestras a 35-40 ° C en un horno de laboratorio o incubadora para un mínimo de 10 minutos. Esto va a liberar y exponer helmintos luminal. Mientras que la muestra se está incubando, llevar a cabo los siguientes pasos.
6. Coloque dos gotas de solución salina al 0,9% lado a lado en una sola diapositiva etiquetados, para permitir la preparación de las muestras a partir de dos segmentos de intestino (duodeno y ciego).
7. Esterilizar el calor y enfriar un asa de inoculación o equivalente.
8. Raspar la mucosa del duodeno y el lugar de las raspaduras en la parte izquierda de la diapositiva (lado más cercano al borde esmerilado).
9. Raspar la mucosa del ciego y el lugar de la muestra de células de la parte derecha de la diapositiva.
10. Arriba el raspado con una hoja de cubierta. Examine diapositivas preparadas con el objetivo de 40x con un microscopio de contraste de fase), la ampliación aumentará a medida que sea necesario para su identificación. Si se detectan parásitos, identificar sobre la base de la morfología.
11. El contenido plato estará listo para su examen por este punto. Examinar el contenido plato bajo un microscopio de disección. Utilizar una sonda o varilla de aplicación si es necesario para mover el contenido en el plato para completar un examen minucioso. Si lombrices están presentes, aparecen como pequeñas, blanco, pelo-como los gusanos. Si tenias están presentes, aparecen como gusanos segmentados, planos (más grande que los oxiuros en forma de hilo).
12. Si los helmintos se detecta o se sospecha, recolectar la muestra con un pequeño par de pinzas.
13. Montar la muestra en una etiqueta, portaobjetos de vidrio limpio en una gota de aceite de parafina o minerales y el lugar una hoja de cubierta en la parte superior de la muestra. Examinar el portaobjetos con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz.

2. Ectoparásito examen (Tabla 3)

5. Piel arrancar el examen de los ectoparásitos (prueba de la cinta)

1. Quite un trozo de claro, no mate, cinta de celofán de un dispensador. La cinta debe ser lo suficientemente largo para manejar por un fondo sin haber tocado la mitad (aproximadamente 5 cm). Puede ser más fácil prescindir de varias longitudes de una sola vez, uniéndolos a la orilla de una superficie de trabajo limpia y usar cuando sea necesario.
2. Levantar un ratón o una rata de la jaula y el lugar en la tapa jaula, sujetándolo por la cola. Realizar esta acción en una cabina de flujo laminar o gabinete de bioseguridad, si el estado de salud del animal lo requiere.
3. Restringir el ratón o la rata. Sujete la piel con pinzas hemostáticas y suavemente arrancar la piel de la zona escapular del ratón, la región cervical ventral, la zona axilar, región inguinal, y la cola dorsal. Coloque la piel en la cinta. El pelo debe ser visto para ser adherente a la cinta para que el ensayo puede considerarse positivo. Coloque el ratón o la rata de nuevo en su jaula.
4. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de vidrio etiquetados limpia, aplicar la cinta, y luego otra gota de aceite mineral. Cubra con una hoja de cubierta de vidrio.
5. Lea el portaobjetos de microscopio con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz.
6. Este examen es mejor para detectar los ácaros piel, como los Radfordia, Myobia y Myocoptes.

6. Raspado de la piel

1. Montar los siguientes materiales: animal a ensayar, aceite mineral, portaobjetos, cubreobjetos, bisturí y tijeras. Si esta prueba se debe realizar en animales vivos, deben ser anestesiados antes de comenzar.
2. Muestra el dorso cerca de la base de la cola y la región temporal de la cabeza. Por otra parte, las lesiones cutáneas y / o en otros sitios puede ser raspada.
3. Profundamente raspar la piel con el bisturí en la dirección opuesta del crecimiento del pelo, a erosionar la epidermis. Recorte de la capa de pelo antes de raspar puede mejorar la sensibilidad de detección mediante la reducción de la obstrucción visual (exceso de vello) en eldiapositivas.
4. Coloque una gota de aceite en la diapositiva. Aplicar la muestra de la gota de aceite limpiando la hoja (con la muestra adjunta) en la superficie de la diapositiva. Agregue el aceite adicional a la diapositiva, si es necesario, y cubrir con un cubreobjetos.
5. Lea el portaobjetos de microscopio con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz.
6. La raspadura de piel generalmente se utiliza para detectar Demodex (y hongos dermatofitos).

7. El examen directo de pelaje

1. Coloque el ratón o la rata sacrificados en el escenario de un microscopio de disección.
2. Examine los pelos de la piel en aproximadamente 10 veces con un aplicador o un instrumento similar a una parte del cabello y observar la base del tallo del pelo.
3. Examine la región craneal, entre los ojos y pabellones auriculares, entre los pabellones, entre las escápulas, debajo de la mandíbula, y las zonas inguinales y axilares. Por otra parte, toda la canal puede ser examinado.
4. Recoger cualquier material sospechoso o ectoparásitos verse con un pequeño par de pinzas. Ectoparásitos con frecuencia puede verse como la caspa o una acumulación de cera amarilla en la base del tallo del cabello o directamente sobre la piel.
5. Montar la muestra en un portaobjetos de vidrio limpio en una gota de aceite de parafina o minerales y el lugar una hoja de cubierta en la parte superior de la muestra. Examinar el portaobjetos con los objetivos de 10x y 40x en un microscopio de luz.

3. Los resultados representativos:

Ver los ficheros asociados la identificación de los parásitos siguientes: (Nota: estos procedimientos se detecta cualquier tipo de huevo, helmintos o quistes presentes en las heces o en la piel y el pelo, y sólo unos pocos de estos se enumeran a continuación)

Endoparásitos:

Syphacia muris (huevo, gusano)	Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (huevo, gusano)	Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera (huevo, gusano)	Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (huevo, gusano)	Giardia spp.
Tritrichomonas muris	Spironucleus muris
Entamoeba muris

Ectoparásitos:

Myocoptes musculinis	Radfordia affinis
Myocoptes musculinis	Radforida ensifera
Myobia musculi

	Cinta de prueba	Flotación fecal	FCC	Un examen directo	PCR
Protozoos	-	+	+ +	+ + +	+ + + / NA 2
Metazoos
Lombriz intestinal	+ / - 3	+ / - 4	+ 4	+ + +	+ + +
Tenia 5	-	+	+ +	+ + +	NA
Ascárides otros cinco	-	+	+ + +	+ + +	NA

^1. Este método requiere la eutanasia del animal.
^2. No hay métodos de detección de PCR disponibles actualmente para todos los protozoarios.
^3. Este método es el más apropiado para detectar Syphacia spp.
^4. Este método es más probable detectar Aspiculuris, y menos probabilidades de detectar Syphacia.
^5. Tenias y lombrices que no sean los oxiuros son muy raros en los ratones y las ratas de laboratorio moderno.

Tabla 1. Clase de endoparásitos y el método de detección apropiado. Algunos métodos requieren la eutanasia del animal. NA indica método no está disponible actualmente para estos parásitos + indica la idoneidad del método para la detección del parásito en cuestión, y -. Indica que el método no es recomendado para ese parásito.

Solución	Peso específico	Ingredientes por 1 litro de H 2 O
Cloruro de sodio	1.20	311 g de cloruro de sodio
Nitrato de sodio	1.20	338 g de nitrato de sodio
Nitrato de sodio	1.30	616 g de nitrato de sodio
Azúcar	1.20	1170 g de sacarosa 1
Azúcar Sheather	1.27-1.30	1563 g de sacarosa 1
De sulfato de zinc	1.18	493 g de sulfato de zinc

^1. Estas soluciones requieren refrigeración o la adición de 9 ml de fenol como conservante.

Tabla 2. Soluciones de flotación fecal (de Smith et al.)

	Piel arrancar (prueba de la cinta)	Raspado de la piel 1	Un examen directo	PCR
Los piojos	-	-	+ +	NA
Los ácaros	+	+	+ + +	+ + + / NA 3
Las pulgas 4	-	-	+	NA
Las garrapatas 4	-	-	+ +	NA

^1. Este método requiere anestesia si se va a realizar en un animal vivo.
^2. Este método requiere la eutanasia del animal.
^3. No hay métodos de detección de PCR disponibles actualmente para todas las especies de ácaros.
^4. Las pulgas y garrapatas son extremadamente raras en las modernas instalaciones de animales de laboratorio.

Tabla 3. Clase de ectoparásitos y el método de detección apropiado. Algunos métodos requieren la eutanasia del animal, y otros métodos que requieren anestesia para llevarlas a cabo en animales vivos. NA indica método no está disponible actualmente para estos parásitos. NA indica método no está disponible actualmente para estos parásitos + indica la idoneidad del método para la detección del parásito en cuestión, y -. Indica que el método no es recomendado para ese parásito.

Discussion

Cuando se trabaja en un laboratorio, la seguridad siempre debe ser una preocupación. Recuerde que debe usar el equipo protector apropiado cuando se trabaja con los animales y para limpiar su estación de trabajo con desinfectante antes y después. Estos métodos están diseñados principalmente para encontrar los parásitos de los roedores de laboratorio en los lugares examinados, es decir, son capaces de detectar los parásitos exóticos o muy raras, así como los oxiuros más comunes y los ácaros de la piel. A pesar de que son igualmente aplicables a otras especies, roedores silvestres pueden tener parásitos adicionales en lugares como el hígado, tejido subcutáneo y el cerebro, no se evalúa por los métodos anteriores.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting board	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Cat #36114
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5910, G204	23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6808, G207	5”
Forceps-Curved	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8254 (M1/21004)	4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8160	Rat tooth
Metal probe	VWR international	Cat#25778-000
Hemostats	Vantage	V97-48
Applicator sticks	Puritan	6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope	Olympus Corporation	SZ51, Schott, ACE1
Petri dish	VWR international	100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips	VWR international	Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides	VWR international	VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop	VWR international	Cat#50815-040
Light microscope	Olympus Corporation	Model#BX41TF
Laboratory oven	Quincy Lab Inc.	Model 10 Lab Oven
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Vortexer	VWR international	Mini-Vortexer
Test tube	Kimble Chase	15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips	VWR international	Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps	VWR international	Cat#60869-089
Iodine	Rowley biochemical institute	Cat#SO-364
Zinc sulfate	Sigma-Aldrich	Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#8360-06
Phenol	EMD Millipore	Cat#PX0510-1
Cellophane tape	Staples	Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil	Mallinckrodt Baker Inc.	Cat#6358