Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tanı Laboratuvarı Sıçanlar ve Fareler Ecto-Endoparasites

doi: 10.3791/2767 Published: September 6, 2011

Summary

Bu makale, endo-veya ectoparasitism algılamak için tarama sıçan ve fareler için çeşitli prosedürler açıklanmaktadır. Birkaç tanı testleri gösterilecektir, canlı hayvanlar üzerinde kullanım için uygundur ve bu hayvanın ötenazi sonra kullanılan hem de. Sıçan ve fare parazitlerin belirlenmesinde yardımcı Fotoğrafları dahil edilecektir.

Abstract

İç ve dış parazitler laboratuar kemirgen tesislerinde önemli bir endişe kaynağı olmayı sürdürmektedir ve birçok araştırma tesisleri, bazı parazitlenene hayvanlar limanı. Parazitler için bir hayvan muayene başlamadan önce, iki şey dikkate alınmalıdır. Bir: ne kullanmalıyım toplanan bilgilerin ve iki olacak: hangi test en uygun. Hayvanlar parazitlenene olduğumuzu bilerek, tesise kabul ettiği bir şey olabilir, ancak çoğu zaman hayvanları tedavi etmek ve daha sonra tedavinin etkinliğini belirlemek için bir ihtiyaç olabilir. Parazitler, canlı ya da ötenazi hayvanlardan alınan numuneler de dahil olmak üzere çeşitli teknikler yoluyla hayvanlarda tespit edilebilir. Tarihsel olarak, PCR çeşitli parazit için yüksek duyarlılık testi izin olmasına rağmen en büyük tanı duyarlılığı ile testleri, hayvanın ötenazi gerekli. Bu makale, algılama endo-fare ve sıçanlarda ektoparazit prosedürleri göstermektedir. Bulunan parazit türleri farklı olsa da aynı işlemleri diğer kemirgenleri uygulanabilir.

Protocol

1. Endoparazit muayene (Tablo 1)

1. Perianal bant testi (ayrıca bakınız Bölüm 5; bu genellikle aynı zamanda yapılır)

  1. Bir dağıtıcı açık, bir uzunluk değil, buzlu, selofan bant çıkarın. Teyp ortasında dokunmadan (yaklaşık 5 cm) bir ucunu işlemek için yeterince uzun olmalıdır. Temiz bir çalışma yüzeyine kenar onlara atfeden ve gerektiği gibi kullanarak, tek seferde birden fazla uzunlukları dağıtmak için daha kolay olabilir.
  2. Kuyruğundan tutarak, fareyi bir kafes ve kafes kapağı yerden kaldırın. Laminer akış kabini veya hayvan sağlık durumu gerektiriyorsa biyogüvenlik kabini bu eylemi gerçekleştirir.
  3. Kafes, arka ayakları kaldırırken, kuyruk fare kısıtlamaktadır. Başparmak ve işaret parmağı arasındaki bandın sonuna tutun, daha sonra perianal bölgede birkaç kez de dahil olmak üzere, sıkıca fare perine orta bant uygulamak. Saç testi için başarılı kabul banda yapışık olarak görülmelidir.
  4. Kafes içinde fare geri yerleştirin.
  5. Etiketli temiz bir cam slayt, mineral yağ başka bir damla bir damla mineral yağ koyun, slayt bant uygulamak. Bir cam kapak slip ile kaplayın.
  6. 10x ve 40x hedeflerine ışık mikroskobu kullanılarak mikroskop lamı okuyun. Diğer parazit yumurtaları bazen olmasına rağmen Syphacia yumurta tespit perianal bant testi, en iyi.

2. Fekal flotasyon

  1. Flotasyon çözüm, düz tabanlı bir flakon (örneğin Ovatector olarak ilaç şişesi ya da dışkı yüzdürme cihaz), petri, kapak kayma, mikroskop lamı, ve aplikatör / karıştırma çubukları birleştirin. Fecasol olarak Yüzdürme çözüm, 1,20-1,30 bir özgül ağırlık olmalı ve çeşitli sodyum tuzları, şeker, çinko sülfat, ya da ticari olarak satın yapılmış olabilir. (Tablo 2)
  2. Flotasyon odasına 2-5 kafes fekal pelet veya hayvan (lar) taze toplayın. Dışkı 500 ul% 0.9 serum fizyolojik ile dışkı nemlendirme, aşırı kuru ya yaş veya dışkı üreten türler nedeniyle faydalı olabilir.
  3. Çözünmüş dışkı taşması çalışma yüzeyini korumak için petri flakon yerleştirin. Küçük hacimli flotasyon orta ve püresi ekleyin ve iyice karıştırın. Materyal büyük parça yok kalmalıdır. Flakonun kenar üzerinde bir menisküs formları kadar flotasyon orta eklemeye devam edin.
  4. Menisküs kapak kayma yerleştirin ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Parazit yumurta ve bazı protozoon ookistleri üst yükselişi ve kapak kayma uyacaktır.
  5. Inkübasyondan sonra, asansör ve kapak kayma ters. Kapak kayma cam bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin.
  6. Işık mikroskobu altında 10x ve 40x hedefleri kullanarak slayt inceleyin.
  7. Genel olarak düşük teknoloji ve kolay gerçekleştirmek için olsa da, bu tekniğin, fareler ya da sıçanlar için tavsiye edilmez. Bir kural olarak, büyük hacimli bir dışkı üreten hayvanlar için daha uygundur.

3. Fekal konsantrasyon ve santrifüj

  1. Flotasyon çözüm, santrifüj tüp, kapak kayma, mikroskop lamı, ve aplikatör / karıştırma çubukları ve boru kapakları birleştirin. Flotasyon çözüm 1,18-1,30 bir özgül ağırlık olmalı ve çeşitli sodyum tuzları, şeker, çinko sülfat, ya da ticari olarak satın yapılmış olabilir. (Tablo 2)
  2. Bir toplama tüpünün içine kafes 2-10 fekal pelet veya taze hayvan (lar) toplayın. Dışkı veya flotasyon solüsyonu ile tuzlu% 0.9 500 ul ile dışkı nemlendirme, son derece kuru, ya, yaş ya da dışkı üreten türlerin bağlı iseniz kullandığınız yararlı olabilir.
  3. Cam bir santrifüj tüpüne içinde uygun bir flotasyon çözümü örnek karıştırın. Bir vortexer Mekanik ajitasyon örnekleri karıştırmak için kullanılıyor olabilir. Vortexer kullanılması durumunda, çıtçıt kapakları dökülme ve çapraz kontaminasyonu önlemek için tüp tepelerine yerleştirilmiş olmalıdır. Rutin, örnekler, ancak diğer çözümlere ek olarak kullanılabilir (ayrı bir hazırlık tüp) veya ikame edilebilir, 1.18 özgül ağırlık çinko sülfat hazırlanır.
  4. Her tüp üzerinde hafif bir pozitif menisküs oluşturmak için her tüpüne ek flotasyon çözüm ekleyin. Her tüp için plastik bir kapak kayma uygulayın ve tüp dudak ile tam bir temas yapılırsa emin olun. Yeri tüp (ler) santrifüj.
  5. 10 dakika boyunca yaklaşık 616-760 RCF santrifüjleyin. Kapak fişleri, santrifüj işlemi sırasında kayıp ya da kırık ise, yeni bir kapak kayma örnek tüp yerleştirilir ve tüp hafifçe menisküs yeni kapak kayma değecek şekilde uçlu olabilir. Hiçbir ek santrifüj gereklidir.
  6. Etiketli, temiz cam mikroskop lamı üzerinde kayma ve santrifüj tüpüne yeri kapağını çıkarın. Birden fazla santrifüj çözümleri tek bir dışkı örneği değerlendirmek için kullanılmış olsaydı, iki kapak fişleri aynı slaytta yer olabilir.
  7. Iyot ile slayt Leke. Bu e izin verirKistlerin Asier tanımlama.
  8. 10x ve 40x hedeflerine ışık mikroskobu kullanılarak slayt inceleyin.

4. Doğrudan bağırsak helmint için muayene ve protozoa

  1. Temiz bir diseksiyon kurulu veya benzeri bir çalışma yüzeyi sırt yatma ötenazi fare veya sıçan karkas yerleştirin.
  2. Forseps kullanarak, genital bölge, karın duvarı kaldırın. Makaslar kullanılarak, dikkatle, genital bölgede, hem deri ve kas kaldırma ve bağırsaklarda ortaya göğüs kafesi tabanı ventral karın duvarı insizyon. Duodenum başlayarak (mide çıkışında bağırsak başından segment) ve inen kolon (bağırsak, anüs sona erer ve genellikle oluşan dışkı içeren segment) devam bağırsak çıkarın.
  3. Bağırsaklarda 100 ml Petri kabı yerleştirin. Çekum ve duodenum diseksiyon kurulu ötenazi hayvan ve yerden bir kısmını toplayın. Mukoza maruz uzunlamasına her intestinal segment İnsizyon.
  4. Makaslar kullanılarak, küçük bölümler halinde kalan bağırsak kesti. Ancak batığın toplanan doku çanak yeterli musluk suyu ekleyin.
  5. 35-40 ° C'de 10 dakika en az bir laboratuvar fırın veya inkübatör örnek karışımı inkübe edin. Bu özgürleştirmek ve luminal helmint gösterecektir. Inkübe olsa da, aşağıdaki adımları yürütmek.
  6. Place iki bağırsak kesimleri (duodenum ve çekum) örneklerin hazırlanması için izin etiketli tek bir slaytta% 0.9 salin yan tarafında iki damla.
  7. Sterilize Isı ve aşılamak bir döngü veya eşdeğeri serin.
  8. Duodenum mukozası kazıyın ve slayt (buzlu cam kenarına yakın tarafı) sol tarafta kazıntı yerleştirin.
  9. Çekum mukoza kazıyın ve slayt sağ tarafta kazıntı.
  10. Bir kapak kayma kazıntı Top. Bir faz kontrast mikroskop altında 40x objektif kullanılarak hazırlanan slayt) inceleyin; tanımlama için gerekli olarak artış büyütme. Parazitler tespit edilirse, morfolojisine göre tanımlar.
  11. Çanak içeriği bu noktada inceleme için hazır olacak. Diseksiyon mikroskobu altında çanak içeriğini inceleyin. Detaylı bir muayene tamamlamak için çanak içinde içeriğini taşımak için gerekli ya da aplikatör sopa gibi bir prob kullanın. Kıl kurdu mevcut olmaları durumunda, bu küçük, beyaz, saç gibi solucanlar gibi görünecektir. Tenyalar varsa, bu segmente, yassı solucanlar (ipliksi kıl kurdu daha büyük) olarak görünecektir.
  12. Helmint tespit ya da şüphesi varsa, küçük bir çift forseps kullanarak numune toplamak.
  13. Parafin veya mineral yağı bir damla etiketli, temiz bir cam slayt Mount numune ve numune üstüne bir kapak kayma yerleştirin. 10x ve 40x hedeflerine ışık mikroskobu kullanılarak slayt inceleyin.

2. Ectoparasite muayene (Tablo 3)

5. Kürk ektoparazit sınavı (bant testi) sakatat

  1. Bir dağıtıcı açık, bir uzunluk değil, buzlu, selofan bant çıkarın. Teyp ortasında dokunmadan (yaklaşık 5 cm) bir ucunu işlemek için yeterince uzun olmalıdır. Temiz bir çalışma yüzeyine kenar onlara atfeden ve gerektiği gibi kullanarak, tek seferde birden fazla uzunlukları dağıtmak için daha kolay olabilir.
  2. Kuyruğundan tutarak fare veya sıçan, kafes ve kafes kapağı yerden kaldırın. Laminer akış kabini veya hayvan sağlık durumu gerektiriyorsa biyogüvenlik kabini bu eylemi gerçekleştirir.
  3. Fare veya sıçan dizginleyin. Hemostat ile kürk tutun ve hafifçe farenin skapular alan, ventral servikal bölgede, aksiller bölge, inguinal bölge ve dorsal kıç kürk koparmak. Kürk kaset üzerine yerleştirin. Saç testi için başarılı kabul banda yapışık olarak görülmelidir. , Kafes içinde, fare ya da sıçan geri yerleştirin.
  4. Mineral yağ etiketli temiz bir cam slayt üzerinde bir damla Yeri; mineral yağ başka bir damla, sonra bant uygulamak. Bir cam kapak slip ile kaplayın.
  5. Işık mikroskobu altında 10x ve 40x hedefler kullanılarak mikroskop lamı okuyun.
  6. Bu sınav Radfordia, Myobia ve Myocoptes gibi kürk akarları tespit etmek için en iyisidir.

6. Cilt kazıma

  1. Aşağıdaki maddelerden birleştirin: hayvan test edilmesi, mineral yağ, mikroskop lamı, kapak kayma, neşter ve makas. Bu test, canlı hayvanlar üzerinde yapılacak ise, onlar başlamadan önce anestezi olmalıdır.
  2. Kuyruk ve baş temporal bölgede baz istasyonu yakınında dorsum Örnek. Alternatif olarak, deri lezyonları ve / veya diğer sitelere kazınmış olabilir.
  3. Derinden epidermisin aşındırmak için neşter bıçağı ile cilt, saç büyüme ters yönde kazıyın. Kazıma için önce saç kat Kırpma görsel tıkanıklığı (aşırı saç) azaltarak tarama hassasiyeti artırabilirkaydırın.
  4. Slaytta petrol bir damla yerleştirin. Yağ damlası için örnek slayt yüzey üzerinde bıçak (örnek ekli) silerek uygulayınız. Gerekirse slayt ve bir kapak kayma ile ek yağ ekleyin.
  5. Işık mikroskobu altında 10x ve 40x hedefler kullanılarak mikroskop lamı okuyun.
  6. Genellikle deri kazıma Demodex (ve dermatophytic mantar) saptamak için kullanılır.

7. Pelage, Direk inceleme

  1. Diseksiyon mikroskobu aşamada ötenazi fare veya sıçan yerleştirin.
  2. Saç parçası bir aplikatör çubuk veya benzeri bir alet kullanarak yaklaşık 10X postu kılları inceleyin ve saç gövdesine temel gözlemlemek.
  3. Gözleri ve pinnae pinnae arasında, skapula arasında, çene altında, kasık ve koltuk altı alanlar arasında, kraniyal bölge inceleyin. Alternatif olarak, bütün karkas incelenebilir.
  4. Herhangi bir ektoparazit ya da küçük bir çift forseps kullanarak görülen şüpheli materyal toplayın. Ektoparazitlere genellikle kepek ve saç mil dibinde ya da doğrudan cilt üzerinde sarı bir balmumu birikimi gibi görünebilir.
  5. , Parafin ya da mineral yağı bir damla temiz bir cam slayt Mount numune ve numune üstüne bir kapak kayma yerleştirin. Işık mikroskobu altında 10x ve 40x hedefleri kullanarak slayt inceleyin.

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Aşağıdaki parazitler tespit ekli dosyaları bakınız: (Not: Bu prosedürler, dışkı ya da deri ve kürk herhangi bir yumurta, helmint, ya da kist mevcut algılar; bunlardan sadece bir kaçı aşağıda listelenmiştir)

Endoparasites:

Syphacia muris (yumurta, solucan) Chilomastix bettencourti
Syphacia obvelata (yumurta, solucan) Hexamastix muris
Aspiculuris tetraptera (yumurta, solucan) Retortamonas sp.
Rodentolepis nana (yumurta, solucan) Giardia spp.
Tritrichomonas muris Spironucleus muris
Entamoeba muris

Ektoparazitlere:

Myocoptes musculinis Radfordia affinis
Myocoptes musculinis Radforida ensifera
Myobia musculi
  Şerit testi Fekal flotasyon FCC Doğrudan sınav 1 PCR
Tek hücreliler - + + + + + + + + + / NA 2
Hayvanların
Kıl kurdu + / - 3 + / - 4 + 4 + + + + + +
Tenyası 5 - + + + + + + NA
Diğer yuvarlak solucan 5 - + + + + + + + NA

1. Bu yöntem hayvanın ötenazi gerektirir.
2. Her protozoa için şu anda mevcut PCR yöntemi yoktur.
3. Bu yöntem Syphacia türleri tespit etmek için en uygun olanıdır.
4. Bu yöntem Aspiculuris tespit etmek için daha büyük olasılıkla, ve Syphacia tespit etmek için daha az muhtemel olacaktır.
5 tenyalar ve diğer yuvarlak solucan kıl kurdu daha modern laboratuar fareler ve sıçanlar çok nadirdir.

Endoparazit ve uygun algılama yöntemi Tablo 1. Sınıf. Bazı yöntemler hayvanın ötenazi gerekecektir. NA yöntem şu anda bu parazitler için kullanılabilir olmadığını gösterir + yöntemi söz konusu parazitin tespiti için uygunluğu gösterir ve yöntem bu parazit için tavsiye edilmez olduğunu gösterir.

Çözüm Özgül ağırlık 1L H 2 O her Malzemeler
Sodyum klorür 1,20 311 g sodyum klorür
Sodyum nitrat 1,20 338 gram sodyum nitrat
Sodyum nitrat 1,30 616 g sodyum nitrat
Şeker 1,20 1170 g sakaroz 1
Sheather Kullanıcı şekeri 1.27-1.30 1563 g sakaroz 1
Çinko sülfat 1,18 493 g çinko sülfat

1. Bu çözümler soğutma ya da ek bir koruyucu olarak fenol 9 ml gerektirir.

Tablo 2 Fekal flotasyon çözümleri (Smith ve ark.)

Kürk sakatat (bant testi) Cilt kazıma 1 Doğrudan sınav 1 PCR
Lice - - + + NA
Akarlar + + + + + + + + / NA 3
Pire 4 - - + NA
Keneler 4 - - + + NA

Bir canlı hayvan üzerinde yapılacak ise 1 Bu yöntem, anestezi gerektirir.
2. Bu yöntem hayvanın ötenazi gerektirir.
3. akar her tür için mevcut PCR yöntemi yoktur.
4. pire ve kene modern laboratuar hayvanları tesislerinde son derece nadirdir .

Ectoparasite ve uygun algılama yöntemi Tablo 3. Sınıf. Bazı yöntemler hayvanın ötenazi ve diğer yöntemler anestezi canlı hayvan bunları gerçekleştirmek için gerekli olacaktır. NA yöntem şu anda bu parazitler için kullanılabilir değildir gösterir. NA yöntem şu anda bu parazitler için kullanılabilir olmadığını gösterir + yöntemi söz konusu parazitin tespiti için uygunluğu gösterir ve yöntem bu parazit için tavsiye edilmez olduğunu gösterir.

Discussion

Bir laboratuvarda çalışırken, güvenlik her zaman endişe edilmelidir. Hayvanları ile çalışırken uygun koruyucu ekipman ve giyim için, önce ve sonra dezenfektan ile iş istasyonu temiz unutmayın. Bu yöntemler öncelikle yerlerde herhangi bir laboratuvar kemirgenler parazitler bulmak için tasarlanmış incelenmiş, yani, son derece nadir parazitler daha yaygın kıl kurdu ve kürk akarları gibi egzotik tespit veya. Diğer türler için de geçerlidir olmasına rağmen, vahşi kemirgenler, yukarıdaki yöntemlerden tarafından değerlendirilir, karaciğer subkutiste ve beyin gibi yerlerde ek parazitler olabilir.

Disclosures

Yazarlar Charles River, yukarıda açıklanan testler de dahil olmak üzere tanısal testler ve reaktifler, bir tedarikçi tüm çalışanları.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cutting board Thermo Fisher Scientific, Inc. Cat #36114
Small scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910, G204 23mm blades, 3.5” length, straight
Medium scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6808, G207 5”
Forceps-Curved Roboz Surgical Instruments Co. RS-8254 (M1/21004) 4.5”, serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting Roboz Surgical Instruments Co. RS-5238 Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-8160 Rat tooth
Metal probe VWR international Cat#25778-000
Hemostats Vantage V97-48
Applicator sticks Puritan 6in Applicators, Ref#807
Dissecting microscope Olympus Corporation SZ51, Schott, ACE1
Petri dish VWR international 100mm, Cat#3401PDNL
Cover slips VWR international Micro cover glass, Cat#48366-067
Slides VWR international VistaVision microscope slides Cat#16004-368
Inoculating loop VWR international Cat#50815-040
Light microscope Olympus Corporation Model#BX41TF
Laboratory oven Quincy Lab Inc. Model 10 Lab Oven
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-12R
Vortexer VWR international Mini-Vortexer
Test tube Kimble Chase 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15
Cover slips VWR international Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049
White caps VWR international Cat#60869-089
Iodine Rowley biochemical institute Cat#SO-364
Zinc sulfate Sigma-Aldrich Cat#1000917519, Z4750-500G
Sucrose Mallinckrodt Baker Inc. Cat#8360-06
Phenol EMD Millipore Cat#PX0510-1
Cellophane tape Staples Invisible tape, Cat#504712
Mineral oil Mallinckrodt Baker Inc. Cat#6358

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, D. G. Chapter 23. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  2. Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 303-398 (2007).
  3. Owen, D. G. Parasites of Laboratory Animals. 12, Royal Society of Medicine. (1992).
  4. Pritchett, K. R. Chapter 22. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Diseases Vol. 2, Academic Press. (2007).
  5. Smith, P. H., Wiles, S. E., Malone, J. B., Monahan, C. M. Chapter 1. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. Blackwell. 1-13 (2007).
  6. Wasson, K. Chapter 21. The Mouse in Biomedical Research: Diseases. Fox, J. Vol. 2, Academic Press. 517-550 (2007).
Tanı Laboratuvarı Sıçanlar ve Fareler Ecto-Endoparasites
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).More

Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice. J. Vis. Exp. (55), e2767, doi:10.3791/2767 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter