Summary
Протокол описывает высокой пропускной подход к определению структуры мембранных белков использованием крио-электронной томографии и 3D обработки изображений. Он содержит подробную информацию об образце подготовки, сбора данных, обработки и интерпретации данных, и заключает с производством представитель мишенью для подходом, ВИЧ-1 Конверт гликопротеин. Эти процедуры расчетов разработаны таким образом, что позволяет исследователям и студентам работать удаленно и вносить вклад в обработку данных и структурного анализа.
Abstract
С момента своего открытия почти 30 лет назад, более 60 миллионов человек были инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (www.usaid.gov) . Вирус заражает и разрушает CD4 + Т-клеток тем самым нанеся тем самым вред иммунной системе, и вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) 2. Инфекция начинается тогда, когда гликопротеин ВИЧ Конверт "шип" вступает в контакт с рецептором CD4 на поверхности CD4 + Т-клеток. Это взаимодействие порождает конформационные изменения в шип, который содействует процессу взаимодействия с клеточной поверхности второго корецептором 5,9. Значение этих белковых взаимодействий в пути ВИЧ-инфекции делает их глубокого значения в области фундаментальных исследований ВИЧ-инфекции, и в погоне за вакциной против ВИЧ.
Необходимо, чтобы лучше понять молекулярного масштаба взаимодействия ВИЧ контакта клеток и нейтрализация мотивированы разработка методики для определенияструктур ВИЧ шип взаимодействия с рецепторами на поверхности клеток белков и молекул, блокирующих инфекцию. Использование крио-электронной томографии и 3D обработки изображений, мы недавно продемонстрировали способность определять такие структуры на поверхности родной вируса, при ~ 20 Å разрешение 9,14. Такой подход не ограничивается разрешения структур ВИЧ Конверт, и может быть распространен и на другие вирусные белки мембран и белков восстанавливаются на липосомы. В этом протоколе, мы опишем, как получить структур ВИЧ конверт гликопротеины, начиная с очищенной вирионы ВИЧ и исходя ступенчато путем подготовки керамических образцах, сбор, крио-электронной микроскопии, разведение и переработка 3D объемы данных, в среднем и классификации 3D subvolumes белка, и интерпретации результатов для производства белка модели. Вычислительные аспекты нашего подхода были адаптированы на модули, которые могут быть доступны и выполняются удаленно, с помощью Biowulf GNU / Linux параллельно рrocessing кластера на NIH (http://biowulf.nih.gov) . Этот удаленный доступ, в сочетании с недорогой компьютерной техники и высокоскоростного доступа к сети, сделало возможным участие исследователи и студенты, работающие в школе или дома.
Protocol
Описанный здесь подход был разработан с использованием определенного набора инструментов, инструментов и программного обеспечения. Потому что все лаборатории не будет использовать эту же экспериментальной установке, была предпринята попытка обобщить подход, при котором это возможно, и в качестве альтернативы, где это было невозможно.
1. Подготовка керамических образцов вирусов
В следующем разделе керамической сетки готовятся с использованием FEI Vitrobot Mark III, промокательной и телемеханики окунуться замораживания. Смотрите Янку, и др.. Подробного протокола об использовании этой системы 7. В качестве альтернативы робота поршень, гильотинные стиль или тяжести поршень вполне достаточно 6.
В разделах 1.2. и 1.3. Gatan Solarus 950 тлеющем разряде единица используется для очистки образца сетки и повысить их гидрофильности, хотя любое устройство, тлеющий разряд предназначен для использования с сетками электронной микроскопии могут быть заменены.
Содержание "> Хотя количество образца объем применяться к сетке перед промокательной и окунуться замораживания должна быть в диапазоне от 2 мкл, вирусов и белково-коллоидных золотых объем в образце смеси варьируется в зависимости от источника. Таким образом, вполне вероятно, что диапазон от вирусов и золото разведения и коэффициенты должны быть проверены и отображается в микроскоп, и идеальной смеси определяется опытным путем. Заметим, что когда данные изображения, приобретенные в разделе 3, от 10 до 20 золотых доверительное маркеров присутствовать для правильного выравнивания серии наклона.Внимание: В этом разделе описывается использование газообразного этана, водорода и кислорода, которые легко воспламеняются. Правильное следует проявлять осторожность при использовании этих газов. Кроме того, необходимо принять меры для обработки образцов вирусов в соответствии с рекомендациями биобезопасности. Наконец, всегда надевайте защитные очки и одежду при работе с жидким азотом (N 2) и этан.
- Подготовка FEI Vitrobot МаркIII, включив его N 2 газоснабжения, установка увлажнителя картридж и затем заполнить картридж с фильтром деионизированной водой. Включите Vitrobot и установите его климатической камере температуру до 22 ° С, целевой влажности до 100%, промокательной время до 6 секунд, и промокните смещение до -2 мм.
- Включите Gatan Solarus 950 свечение единицы разряда и открытых Н 2 и О 2 канистры, которые поставляют единицы. Предварительная очистка образца камеры, запустив тлеющего разряда в течение 1 мин при 50 Вт.
- Организовать необходимое количество углерода дырявые сетки на стекло покровное, углерод стороной вверх, и места внутри тлеющего разряда образца камеру через верхнюю дверь нагрузки. Чистая сетки, запустив тлеющего разряда в течение 6-10 сек при 25 Вт. (Заметим, что углерод стороне Quantifoil сетки бренда, используемые в настоящем протоколе матовый на вид. Это не будет справедливо для всех коммерческих сетки, так что лучше получить эту информацию у производителя.)
- Место сетку окна (ов) внутри воркуютЛант контейнер миску, и тепловой шпинделя диффузора на центральной чаши, которая находится в охлаждающей жидкости миску. Медленно влить жидкость № 2 в миске до энергичного стихает пузырьков, указывающие равновесие между миску и жидкости. Поддержание жидкого N 2 уровне на протяжении оставшейся части процедуры, заботясь, чтобы не лезли в центральную чашу.
- Подключите один конец шланга к пластиковой канистре этана газа, а другой конец к стеклянной пипетки. Держите кончик стеклянной пипетки в нижней части центральной чаши, установить медленный, устойчивый поток этана, и этан начнется конденсации. Продолжить заполнение до центральной чаши заполнена. Удаление шпинделя от центра чашки.
- Подготовка образцов смеси путем добавления 2 мкл белка золото коллоидное координатных до 10 мкл АТ-2 инактивированные вируса ВИЧ-1 подвески. Аккуратно пипеткой смесь довести fiducials в раствор. Держите на льду.
- Возьмитесь за внешний обод сетки со специализированными Vitrobot пинцетом. Нанести 2 мкл образца смеси углерода сязь сетки. Немедленно поручить роботу, чтобы загрузить образец в увлажненном климатической камере, промокните и окунуться заморозить в жидком этана.
- Передача керамической сетки к сетке коробки. Повторите шаг 1.7. производить необходимое количество сеток. По окончании, затяните винты на сетке поле крышкой (ы), то быстро раздаточной коробки (а) малого жидким азотом сосуд Дьюара транспорта.
2. Загрузка образцов в передаче электронного микроскопа
В этом разделе жидкого N 2 уровня загрузки камеры должны быть проверены бдительно, и жидкий пополнялись по мере необходимости, для обеспечения сетки ящики остаются погруженными. До приведения инструмента в контакт с сеткой, охладить его, погружая его в жидком N 2, пока не уравновешивает с жидкостью. После каждого использования, инструменты должны быть размороженной использованием фена.
На протяжении этого параграфа FEI Tecnai G2 Polara просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) используется в сочетаниис рабочей станции Gatan Cryo. Хотя принцип загрузки образцов под жидким N 2 условий распространяется на всех крио-электронной микроскопии работы, шаги этого раздела являются специфическими для оборудования, используемого в эксперименте. Действия, используемые для различного оборудования будет варьироваться в зависимости от производителя.
ВНИМАНИЕ: В этом разделе всегда носить защитные очки и одежду при работе с жидким N 2.
- Убедитесь, что ТЭМ Compustage не содержит образец картридж, и что отбор образца стержня и вставки стержня ниже 110 К.
- Прохладный и подготовить Cryo Workstation для загрузки сетки в блоке хранения образцов, которая является частью стержня отбор пробы.
- Передача охлаждением (<110 К) выбор прут из микроскоп, чтобы Cryo Workstation.
- Стержень Слайд выбор вперед, чтобы вставить выбора блока на азот баня на рабочей станции Cryo. Удалите все образцы патронов из блока хранения с использованием специализированныхartridge обработки щипцами. Место сеткой окно (а) в загрузке рабочих станций и ослабьте крышку (ы) с помощью отвертки.
- Используйте пинцет, чтобы удалить сетку из окна сетки и место в картридже. Использование специализированных C-клип размещения инструмента для депозита C-клип на вершине сетки, закрепив сетку в картридже.
- Повторите шаг 2.5. пока требуемое количество сетки в картриджах. Передача образца патронов к выбору блоков.
- Подготовка Cryo Workstation для удаления образца стержень выбора. Слайд выбор прут обратно снимаем выделение блока из азота ванну. Снимаем выделение жезл от станции Cryo и приложите к ТЕА.
3. Приобретение крио-электронной микроскопии
В этом разделе FEI Пакетный томография программный интерфейс используется для создания пакетного файла, который хранит координаты всех сетке позиции интересов. Когда указанию пользователя, программное обеспечение пакетной томография вернемся к каждой из позиций и будет координироватьнаклона серии приобретения через цифровой Микрофотография. Если эта программа не доступна, пакет Leginon программное обеспечение жизнеспособного свободным, открытым исходным кодом, альтернативной 13. Изображений было сделано в 200 кэВ, используя Gatan изображений фильтр (GIF) с пост-GIF 2К х 2К CCD камера (Gatan).
- Позиция Compustage так, что пучок электронов проходит через вакуум. Переключить на большом увеличении (34kX) Режим экспозиции и выполнять прямые выравнивания.
- Совместите без потерь пик на энергии фильтр. (Это обеспечивает энергию, фильтр с ссылкой для электронов с нулевыми потерями энергии.)
- Перемещение Compustage к сетке области с участием углерода. В странах с низким увеличением (4.5kX) Режим поиска, используйте Wobbler функцией наклона этап назад и вперед между + / -15 °. Между тем настроить Z-оси этапе положение, пока минимальным сдвигом этапе не наблюдается. (Этот этап позиции примерно в eucentric высота). Отключить Wobbler, когда ни на одном этапе сдвиг наблюдается.
- Использование автоматизированных Eucentric е Высота помазание для уточнения eucentric высоте. (Эта процедура использует кросс-корреляции для получения более точной eucentric высоту, чем в шаге 3.3). Eucentric высота автоматически сохраняются для дальнейшего использования программного обеспечения томографии Batch.
- Найти область интереса с участием около 5:57 вирионов, и не менее десяти доверительное маркеров. Добавить это стартовая позиция в файле томографии партии.
- Повторите шаги 3.4. и 3.5. пока требуемое количество позиций обозначены. Определить пакетные параметры (± 60 ° с шагом 2 ° наклон, 1-2 электронной / 2 / наклона зрения) и запустить пакет.
4. Реконструкция крио-электронной томограммы
- Выравнивание наклона серии с помощью автоматических координатных основе выравнивания в RAPTOR 1.
- Реконструкция томограммы использованием R-взвешенный прогноз еще в IMOD 8. Стандартный формат файлов для результате объемы данных файла MRC, с расширением файла. MRC.
В данном разделе используются индивидуальные расширение IMOD, что позволяет пользователю назначить вириона subvolumes в томограммы. В разделе 6 пользовательских вириона границы используются как поверхности, по которой шипы выбираются автоматически.
- Открытое IMOD и нагрузки томограмма заполняется вирионов.
- Перейдите по Z-оси томограммы до центральной срез через одну из вирионов находится. Убедитесь, что центр тяжести вириона выявлено не было. После этого депозита вириона маркером. Этот маркер будет использоваться автоматизированные утилиты сегментации вириона в разделе 6.
- Продолжить тяжести обозначение, пока все объемы вириона идентифицированы.
- Закрыть томограмму и сохранить маркер множество, определяющее вириона центроиды. Повторяйте, пока вирионы были назначены во всех томограммы.
- Использование IMOD, вниз-образец subtomograms вириона по четыре раза.
- Denoise вирионов использованием краю повышения анизотропной диффузии как это реализовано в IMOD.
- Тема вирионов к неконтролируемой сегментации мембраны использованием энергии основе трехмерный подход (подробно в Bartesaghi и соавт. 2005) 3.
- Шипы, выявленных на местах на поверхности вириона сегментированных соответствующие локальным максимумам взаимной корреляции между конкретной местности и синтетических симметричной спайк-как объем. Эти места выше заданного порога будут добавлены в список координат для предполагаемого subvolumes шип.
6. Классификация и усреднения частиц
- С вычислительной точки экстракт томограмма subvolumes (100 х 100 х 100 вокселей) на каждом месте, которое было определено в пункте 5.8. (Это делается без шумоподавления или биннинга). В результате коллекция subvolumes содержат белки, которые шип будет классифицироваться и в среднем в следующих шагах.
- Determine ориентации длинной оси шип с помощью обычных для автоматического сегментированных мембраны по месту нахождения каждого шипа. Такой подход обеспечивает первоначальные оценки для двух из трех углов Эйлера.
- Randomize оставшиеся на месте вращения, чтобы предотвратить любые возможные отклонения в последующих рядов.
- Применить углы Эйлера для subvolumes, то трансляционно выровнять subvolumes их цилиндрически усредненный глобальный средний, чтобы они все одни и те же центра масс.
- Удалить 10% subvolumes, которые коррелируют наиболее плохо с обновленным среднем в мире. Это делается для удаления плотности подвергаются наибольшему риску быть ошибочно шипы.
- Выравнивание и классифицировать шип объемах без использования внешних ссылок и при надлежащем учете отсутствует клин (подробно в Bartesaghi и соавт. 2008) 4. Постепенно уточнить подтома выравнивания и классифицировать шип объемы на каждой итерации.
- Три-кратной симметрии должны быть четко наблюдается в ранней стадии классификации, а на четвертой итерации, 3-кратной симметрии накладывается. В каждом раунде, наиболее четко определенных классов усредняются и используются в качестве ссылки для следующего раунда.
- Как правило ~ 4000 шипы должны быть выбраны для каждого набора данных. Заключительные карты плотности получаются после ~ 5-12 раундов изысканность и будет включать в себя вклад от ~ 50% к югу от объемов в каждом наборе данных.
7. Координат установки
- Плотность карты в результате шагом 6,8 открыты в UCSF Химера 12.
- Продукция моделируется 20 карту рентгеновского координат с использованием химер или ЭМАН 10.
- Док координаты в случайных направлениях. Использование химерами, построенный в крутое восхождение локальной оптимизации, пригодные координаты, выполняя, кратных 100 крутой подъем шагов до сходимости.
8. Представитель Результаты
С помощью 3D усреднения и координировать фурнитуры, разнообразие ВИЧ и ВИО Env шип структур были решены. Представленные на рисунке 3А структуры Конверт шип от ВИЧ-1 штамма, БЛ (фиолетовый). Шип состоит из трех-кратной симметрии размером ~ 120 Å при измерении от мембраны к вершине спайка, а максимальная ширина ~ 150 Å, который сужается до ~ 35 Å на базе шип. Как видно на рис 3B, комбинируя плотности карту тримерной Env определяется с помощью крио-электронной томографии с кристаллографически определяется структура мономерных gp120 (красный, полученный из PDB ID, 2NY7), мы смогли получить рабочую молекулярной модели для тримерной комплекса гликопротеина оболочки (PDB ID, 3DNN) 9.
Наш подход позволяет также структурный анализ комплексов, образующихся между тримерной Env и различных gp120-специфического белкафрагменты и антител. Примером этого, в которой Env образует комплекс с широкой нейтрализации b12 Fab показан на рисунке 4A (весь комплекс показан фиолетовым цветом). На этом рисунке, дополнительный плотность, соответствующую b12 видно проектирования наружу из колоса, и параллельно мембране. Структурные интерпретации таких комплексов может быть распространено на молекулярном уровне путем установки карты с плотностью атомных координат для части колоса, связанных с соответствующим лигандом. Как видно на рисунке 4В, при этом плотность карта оснащена координаты белка gp120 шип (красный, полученный из PDB ID, 2NY7) связаны b12 Fab (белый), относительной ориентации три gp120 ядер можно различить (PDB ID, 3DNL). Эти конформационные отношения поучительно для понимания того, как такие лиганды взаимодействуют с шипом и мешают вирусной активности. Некоторые другие структуры unliganded и liganded Env, которые были решены методом, представленные здесь вклудэ те ВИЧ-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S и SIVmac239, тройной комплекс между ВИЧ-1 Бал Env, sCD4 и Fab 17, б, и SIV CP-Mac Env в комплексе с антителами 7D3 9,14.
Рисунок 1 С вирусной суспензии в 3D структуры. Концептуальные шаги в крио-электронной микроскопии и 3D-реконструкции.
Рисунок 2. (А) представитель ломтик от томограммы ВИЧ-1 вирионов. (B) одного ВИЧ-1 вириона с поверхностью ядра и шипы, схематически.
Рисунок 3. () Трехмерная структура ВИЧ-1 БЛ Конверт гликопротеина (поверхности шипы), как показано на поверхности вирусной оболочки. (B) Молекулярная модель ТРАЙМRIC шипы определяется путем помещения в трех экземплярах структур для мономерных gp120 (красный), полученные методом рентгеновской кристаллографии в плотности карте 9.
Рисунок 4. () Трехмерная структура ВИЧ-1 БЛ гликопротеин Конверт в комплексе с Fab фрагмент широко нейтрализующих антител, b12. (B) Молекулярная модель для комплекса определяется путем помещения в трех экземплярах структур для мономерных gp120-В12 Fab комплекс полученные рентгеновской кристаллографии в плотности карте 9.
Discussion
Крио-электронной микроскопии и трехмерных классификация и методы усреднения, представленные здесь позволяют для определения трехмерной структуры гликопротеина оболочки комплексов до ~ 20 Å разрешении. Установка рентгеновского координат мономерных компонентов с плотностью карты позволяет структурной интерпретации на молекулярном уровне. Постоянное уточнение в недорогих вычислительных оборудование в сочетании с достижениями в области с открытым исходным кодом научных инструментов и распространения сетевой инфраструктуры позволяют ранее немыслимых научных совместные усилия. Воспользуемся этими событиями и показать, что передовые научные методы могут быть предъявлены в течение недоступном для студентов многих веков.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Биологический раздел Продукты СПИДа и рака вирусной программы, SAIC Фредерик, Inc, для обеспечения очищенной, АТ-2 лечение ВИЧ-1, вирусы, Стивен Феллини и коллег за помощь с использованием высокопроизводительных вычислительных возможностей Biowulf Linux кластера на NIH, Bethesda, MD (http://biowulf.nih.gov) , FEI компании за помощь при электронной микроскопии, и Этан Тайлер за экспертную помощь и цифр. Эта работа была поддержана за счет средств Центра по исследованию рака в Национальный институт рака, Национальный институт здоровья, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
- Amat, F. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
- Bowen, D. L., Lane, H. C., Fauci, A. S. Immunopathogenesis of the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Intern. Med. 103, 704-709 (1985).
- Bartesaghi, A., Sapiro, G., Subramaniam, S. An Energy-Based Three-Dimensional Segmentation Approach for the Quantitative Interpretation of Electron Tomograms. IEEE. T. Image. Process. 14, 1314-1323 (2005).
- Bartesaghi, A. Classification and 3D averaging with missing wedge correction in biological electron tomography. J. Struct. Biol. 162, 437-450 (2008).
- Harris, A. Trimeric HIV-1 gp140 immunogens and native HIV-1 envelope glycoproteins display the same closed and open quaternary molecular architectures. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11440-11445 (2011).
- Harris, R. J., Adrian, M. Preparation of thin-film frozen-hydrated/vitrified biological specimens for cryoelectron microscopy. Methods Mol. Biol. 117, 31-48 (1999).
- Iancu, C. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1, 2813-2819 (2006).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. J. Struct. Biol. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data using IMOD. 116, 71-76 (1996).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, 109-113 (2008).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions. J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).
- Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nat. Rev. Microbiol. 7, 666-675 (2009).
- Pettersen, E. F. UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Suloway, C. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).
- White, T. Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure. PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).
