Summary
Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di lavorare in remoto e contribuire alla elaborazione dei dati e l'analisi strutturale.
Abstract
Fin dalla sua scoperta quasi 30 anni fa, più di 60 milioni di persone sono state infettate con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) (www.usaid.gov) . Il virus infetta e distrugge le cellule CD4 + T-cellule così paralizzando il sistema immunitario, e provocando una sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) 2. L'infezione inizia quando la glicoproteina Busta HIV "spike" entra in contatto con il recettore CD4 sulla superficie delle cellule CD4 + T-cellule. Questa interazione induce un cambiamento conformazionale della spiga, che promuove l'interazione con una superficie seconda cella co-recettore 5,9. L'importanza di queste interazioni proteina nel pathway infezione da HIV li rende di fondamentale importanza profonda ricerca sull'HIV, e nella ricerca di un vaccino contro l'HIV.
La necessità di comprendere meglio la scala molecolare le interazioni di contatto delle cellule HIV e neutralizzazione motivato lo sviluppo di una tecnica per determinare ilstrutture del picco HIV interagendo con le proteine della superficie cellulare dei recettori e delle molecole che l'infezione blocco. Utilizzando crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D, abbiamo recentemente dimostrato la capacità di determinare tali strutture sulla superficie del virus nativo, a ~ 20 una risoluzione di 9,14. Questo approccio non si limita a risolvere strutture Busta HIV, e può essere esteso ad altre proteine di membrana virale e le proteine ricostituita su un liposoma. In questo protocollo, si descrive come ottenere strutture di glicoproteine busta HIV a partire da purificata virioni HIV e procedendo per gradi attraverso la preparazione dei campioni vetrificata, la raccolta, la crio-microscopia elettronica dei dati, la ricostituzione e l'elaborazione di immagini 3D di volumi di dati, con una media subvolumes e classificare le proteine in 3D, e interpretare i risultati per produrre un modello di proteina. Gli aspetti computazionali del nostro approccio sono stati adattati in moduli che possono essere accessibili ed eseguito da remoto usando il GNU / Linux Biowulf parallelo pgrappolo Processing presso il NIH (http://biowulf.nih.gov) . Questo accesso remoto, in combinazione con hardware a basso costo del computer e accesso ad alta velocità della rete, ha reso possibile il coinvolgimento di ricercatori e studenti che lavorano da scuola o da casa.
Protocol
L'approccio qui descritto è stato sviluppato utilizzando uno specifico insieme di strumenti, utensili e software. Perché tutti i laboratori non si intende utilizzare questa stessa impostazione sperimentale, lo sforzo è stato fatto per generalizzare l'approccio per quanto possibile, e fornire alternative in cui ciò non era possibile.
1. Preparazione di campioni di virus vetrificata
Nella sezione seguente griglie vetrificata sono redatti utilizzando la FEI Vitrobot Mark III, un assorbente e robot congelamento tuffo. Vedi Iancu, et al. Per un protocollo dettagliato sull'utilizzo di questo sistema 7. In alternativa a un pistone robotica, una ghigliottina in stile o gravità pistone è perfettamente sufficiente 6.
Nelle sezioni 1.2. e 1.3. uno Gatan Solarus 950 unità di scarico bagliore è usato per pulire le griglie del campione e aumentare la loro idrofilia, sebbene qualsiasi dispositivo scarica luminescente progettata per l'uso con griglie di microscopia elettronica può essere sostituito.
contenuto "> Anche se la quantità di volume di campione applicato alla griglia prima di immergersi assorbente e il congelamento dovrebbe essere nel range di 2 microlitri, il virus e proteine-Un volume oro colloidale nella miscela campione variano a seconda della fonte. In quanto tale, è probabile che una serie di diluizioni di virus e oro o rapporti dovranno essere testati e ripreso al microscopio, e una miscela ideale determinati empiricamente. noti che, quando i dati di immagine viene acquisita nella sezione 3, tra 10 e 20 d'oro marker fiduciali deve essere presenti per un corretto allineamento della serie tilt.Attenzione: Questa sezione descrive l'uso di etano gassoso, idrogeno e ossigeno che sono altamente infiammabili. Cautela corretta dovrebbe essere presa quando si usano questi gas. Inoltre, occorre prestare attenzione a gestire campioni di virus in conformità alle raccomandazioni biosicurezza. Infine, indossare sempre occhiali e indumenti protettivi quando si maneggia l'azoto liquido (N 2) ed etano.
- Preparare FEI Vitrobot di MarkIII, ruotando sul suo N 2 gas, l'installazione della cartuccia umidificatore e poi riempire la cartuccia con acqua deionizzata filtrata. Accendere Vitrobot e impostare la temperatura della camera climatica a 22 ° C, umidità obiettivo al 100%, tempo assorbente per 6 secondi, e asciugare compensato a -2 mm.
- Accendere il Solarus Gatan 950 unità luce di scarico e aperto H 2 ed O 2 contenitori che alimentano l'unità. Pre-camera pulita campione eseguendo scarica luminescente per 1 min a 50 Watt.
- Disporre il numero desiderato di griglie di carbonio bucata su un vetrino di vetro, carbonio lato, e posto all'interno della camera campione bagliore di scarico attraverso la porta di carico superiore. Pulire le griglie eseguendo scarica luminescente per 6-10 secondi a 25 Watt. (Si noti che il lato di carbonio delle griglie marchio Quantifoil utilizzati in questo protocollo sono in apparenza opaca. Questo non è vero per tutte le reti commerciali, quindi è meglio per ottenere queste informazioni dal produttore).
- Luogo casella della griglia (i) all'interno di coolant ciotola contenitore e diffusore termico mandrino sulla tazza centrale che si trova all'interno della ciotola refrigerante. Versare lentamente N 2 liquido nella ciotola fino a quando l'bolle vigoroso, che indica equilibrio tra coppa e liquido. Mantenere liquido N 2 livello per tutto il resto della procedura, avendo cura di tenere fuori dalla coppa centrale.
- Collegare un'estremità di un tubo di plastica per la bomboletta di gas etano e l'altra estremità ad una pipetta di vetro. Tenete punta della pipetta di vetro a fondo della tazza centrale, stabilire un lento e costante flusso etano ed etano inizierà a condensazione. Continuare a riempire fino a quando la coppa centrale è piena. Rimuovere dalla tazza del mandrino centrale.
- Preparare miscela campione aggiungendo 2 microlitri proteina-A oro colloide fiduciali al 10 L AT-2 inattivato HIV-1 sospensione di virus. Delicatamente pipetta miscela di portare fiducial in soluzione. Tenere su ghiaccio.
- Afferrare il bordo esterno di una griglia con le pinzette Vitrobot specializzate. Applicare 2 l di miscela campione di carbonio side di griglia. Immediatamente istruire robot per caricare campione in umidificata camera climatica, macchia e congelare immergersi in etano liquido.
- Trasferimento griglia vetrificata alla casella della griglia. Ripetere il punto 1.7. per produrre il numero desiderato di griglie. Al termine, serrare le viti sul coperchio griglia della finestra (s) e poi trasferire rapidamente i box (i) alla piccola trasporto dewar di azoto liquido.
2. Campioni Caricamento microscopio elettronico a trasmissione
In questa sezione, il liquido N 2 livello nel vano di carico deve essere monitorata vigile, e rifornito di liquido, se necessario, per assicurare che le scatole griglia rimanere immerse. Prima di portare uno strumento in contatto con una griglia, si raffredda immergendo nel liquido N 2 fino a che non equilibra con il liquido. Dopo ogni uso, gli attrezzi devono essere scongelati con una pistola ad aria calda.
In questa sezione il FEI Tecnai G2 Polara microscopio elettronico a trasmissione (TEM) è usato in congiunzionecon una workstation Gatan Cryo. Mentre il principio di campioni di carico di cui liquidi N 2 condizioni è applicabile a tutti i crio-microscopia elettronica lavoro, i passaggi di questa sezione sono specifiche per le attrezzature utilizzate nell'esperimento. La procedura utilizzata per diverse apparecchiature varierà da produttore.
ATTENZIONE: In questa sezione, indossare sempre occhiali e indumenti protettivi quando si maneggiano liquidi N 2.
- Assicurarsi che Compustage TEM non contiene una cartuccia campione, e che il campione selezione asta e l'inserimento asta sono inferiore a 110 K.
- Raffreddare e preparare Workstation Cryo per il caricamento griglie in campione e di stoccaggio, che fa parte della canna selezione del campione.
- Trasferire il raffreddamento (<110 K) asta di selezione da microscopio per Cryo Workstation.
- Selezione asta di scorrere in avanti per inserire blocchi selezione in bagno di azoto su Workstation Cryo. Rimuovere tutte le cartucce campione dal blocco di storage utilizzando specializzate cartridge gestione pinze. Luogo casella della griglia (i) nel caricamento workstation e allentare il coperchio (s) con un cacciavite.
- Utilizzare le pinzette per rimuovere dalla rete casella della griglia e il luogo in cartuccia. Utilizzare il specializzate C-clip strumento di collocamento di depositare un C-clip sulla parte superiore della griglia, griglia di protezione in cartuccia.
- Ripetere il punto 2.5. fino al numero desiderato di griglie sono in cartucce. Trasferimento delle cartucce a campione e selezione.
- Preparare Workstation Cryo per la rimozione di asta provino di selezione. Far scorrere asta selezione di nuovo per rimuovere blocco di selezione da bagno di azoto. Rimuovere asta di selezione da Cryo Workstation e allegare alla TEM.
3. L'acquisizione di crio-microscopia elettronica dei dati
Durante questa sezione, il FEI Batch Tomografia interfaccia software è usato per creare un file batch che memorizza le coordinate di tutte le posizioni in griglia di interesse. Quando richiesto dall'utente, il software Tomografia Batch riesaminerà ciascuna delle posizioni e coordineràinclinazione acquisizione serie tramite Micro-digitale. Se questo software non è disponibile, il pacchetto software Leginon è vitale gratuito, open source alternativa 13. Imaging è stato fatto a 200 keV, utilizzando un filtro Gatan Imaging (GIF) con un post-GIF 2K x 2K CCD (Gatan).
- Compustage posizione tale che a fascio di elettroni passa attraverso il vuoto. Passa a elevato ingrandimento (34kX) Modalità esposizione ed eseguire allineamenti diretti.
- Allinea a zero la perdita di energia di picco del filtro. (Questo fornisce il filtro di energia con un punto di riferimento per gli elettroni con zero perdita di energia.)
- Spostare il Compustage in una zona griglia con carbone. In basso ingrandimento (4.5kX) modalità di ricerca, utilizzare la funzione Wobbler per inclinare la scena avanti e indietro tra + / -15 °. Nel frattempo regolare l'asse Z posizione scena fino spostamento stadio minimo si osserva. (Questa posizione lo stadio circa all'altezza eucentrica). Disabilita Wobbler quando non cambio palco si osserva.
- Utilizzare il f automatico Altezza eucentrica unzione per affinare l'altezza eucentrica. (Questa routine utilizza correlazione incrociata per ottenere una altezza più accurata eucentrica rispetto al punto 3.3). Altezza eucentrica viene memorizzato automaticamente dal software di riferimento in seguito Tomografia batch.
- Trovare una zona di interesse con circa 3-6 virioni, e non meno di dieci marcatori fiduciali. Aggiungi questa posizione in griglia al file tomografia batch.
- Ripetere i passaggi 3.4. e 3.5. fino al numero desiderato di posizioni sono designati. Definire i parametri batch (± 60 ° con incrementi di 2 ° di inclinazione, 1-2 e-/ A 2 / view inclinazione) ed eseguire il batch.
4. Ricostruire crio-elettroni tomogrammi
- Allineare serie inclinazione automatica tramite fiduciali basato allineamento RAPTOR 1.
- Ricostruire tomografie con R-ponderato proiezione indietro nel IMOD 8. Il formato di file standard per i volumi di dati risultante è il file MRC, con estensione. MRC.
Questa sezione utilizza un'estensione personalizzata di IMOD che permette all'utente di designare subvolumes all'interno del virione tomogramma. Nella sezione 6, definiti dall'utente confini virione sono utilizzati come superficie lungo la quale i picchi vengono selezionati automaticamente.
- Aperto IMOD e caricare un tomogramma popolato con virioni.
- Navigare lungo l'asse Z della tomogramma fino a quando la fetta centrale attraverso uno dei virioni si trova. Verificare che il baricentro virione è stato identificato. Dopo questo modo, depositare un marker virione. Questo indicatore sarà utilizzato dal programma di utilità automatizzati di segmentazione virione nella sezione 6.
- Continuare fino a quando la designazione centroide tutti i volumi virione sono identificati.
- Chiudere tomogramma e salvare insieme marcatore che definisce centroidi virione. Ripetere fino a virioni sono stati designati in tutte le tomografie.
- Utilizzando IMOD, down-campione subtomograms virione di un fattore di quattro.
- Virioni Denoise margini di miglioramento con la diffusione anisotropa come attuata in IMOD.
- Virioni riserva di segmentazione della membrana non supervisionato con una energia a base di approccio tridimensionale (dettagliate in Bartesaghi et al. 2005) 3.
- Picchi sono identificati in luoghi sulla superficie del virione segmentato corrispondente ai massimali locale di correlazione incrociata tra la posizione particolare e un sintetico simmetrica spike-come volume. Quelle posizioni sopra una determinata soglia sono aggiunti a un elenco di coordinate per putativo subvolumes picco.
6. Classificazione e la media delle particelle
- Computazionalmente estrarre il subvolumes tomogramma (100 x 100 x 100 voxel) in ogni sede che è stato identificato nel passaggio 5.8. (Questo viene fatto senza denoising o binning). L'insieme risultante di subvolumes contengono le proteine picco che sarà classificato e media nei seguenti passi.
- Determine gli orientamenti dell'asse longitudinale della punta con la normale alla membrana automaticamente segmentate in corrispondenza della posizione di ogni picco. Questo approccio fornisce stime iniziali per due dei tre angoli di Eulero.
- Randomize il restante posto rotazione per evitare possibili distorsioni nella allineamenti successivi.
- Applicare angoli di Eulero per subvolumes, poi traduzionali allineare il subvolumes alla loro media cilindrica media globale per garantire che tutti condividono lo stesso centro di massa.
- Togliere il 10% dei subvolumes che correlano la maggior parte male con la media aggiornata globale. Questo viene fatto per rimuovere densità a maggior rischio di essere erroneamente identificato punte.
- Allineare e classificare i volumi di picco senza l'utilizzo di riferimenti esterni e con la contabilità corretta del cuneo mancanti (dettagliate in Bartesaghi et al. 2008) 4. Progressivamente affinare allineamenti sottovolume e classificare i volumi picco ad ogni iterazione.
- Triplice simmetria dovrebbe essere chiaramente osservato nelle prime fasi di classificazione, e alla quarta iterazione, 3-simmetria viene imposto. Ad ogni giro, il più ben definite classi media e utilizzato come riferimento per il prossimo giro.
- Tipicamente ~ 4000 chiodi dovrebbero essere selezionati per ogni set di dati. Mappe di densità finale si ottengono dopo ~ 12/05 giri raffinatezza e conterrà contributi di circa il 50% di sub-volumi in ogni set di dati.
7. Coordinare raccordo
- Le mappe di densità risultante dal 6,8 step si aprono in 12 UCSF Chimera.
- Produrre una simulazione di 20 Å mappa di raggi X le coordinate utilizzando Chimera o EMAN 10.
- Dock coordinate in orientamenti casuali. Utilizzando Chimera costruito in ripida salita, ottimizzazione locale, in forma coordinate eseguendo multipli di 100 gradini più ripida salita fino a convergenza si ottiene.
8. Rappresentante Risultati
Utilizzando media 3D e coordinare montaggio, una varietà del virus HIV e SIV Env strutture picco sono stati risolti. Presentato nella Figura 3A è la struttura del picco busta dal ceppo HIV-1, BAL (viola). Il picco è triplice simmetria con dimensioni di circa 120 A, misurata dalla membrana all'apice picco, e una larghezza massima di circa 150 Å che si assottiglia fino a ~ 35 Å alla base del picco. Come si vede in Figura 3B, combinando la mappa di densità per trimeriche Env determinato mediante crio-elettroni tomografia con la struttura crystallographically determinato per monomerico gp120 (rosso, derivato dal PDB ID, 2NY7), siamo stati in grado di ottenere un modello di lavoro molecolare per la trimeriche glicoproteina complessa busta (PDB ID, 3DNN) 9.
Il nostro approccio consente anche per l'analisi strutturale di complessi formati tra trimeriche Env e una serie di specifiche proteine gp120e frammenti di anticorpi. Un esempio di questo, in cui è complessato Env con l'ampio neutralizzare b12 Fab è mostrato in Figura 4A (l'intero complesso è mostrato in viola). In questa figura, la densità più corrispondente alla b12 è visto proiettare verso l'esterno dalla punta, e in parallelo alla membrana. Interpretazioni strutturali di tali complessi può essere estesa a livello molecolare inserendo le mappe densità con coordinate atomiche per porzioni di punta, legato al ligando corrispondente. Come si vede in Figura 4B, quando questa mappa densità è dotato di coordinate della proteina gp120 picco (rosso, derivato dal PDB ID, 2NY7) vincolato da b12 Fab (bianco), gli orientamenti delle tre gp120 core si possono individuare (PPB ID, 3DNL). Queste relazioni conformazionali sono istruttivi per capire come ligandi quali interagiscono con il picco e interferire con l'attività dei virus. Alcune altre strutture di unliganded e liganded Env che sono stati risolti con il metodo presentato qui include quelli di HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S e SIVmac239, il complesso ternario tra HIV-1 Bal Env, sCD4 e la Fab 17 ter, e SIV CP-Mac Env complessato per l'anticorpo 7D3 9,14.
Figura 1 Dalla sospensione virale al 3D struttura:. Passi concettuale in crio-microscopia elettronica e la ricostruzione 3D.
Figura 2. (A) Una fetta rappresentante di una tomografia di HIV-1 virioni. (B) Un singolo virione di HIV-1, con le punte core e superficie mostrato schematicamente.
Figura 3. (A) Struttura tridimensionale della glicoproteina Busta HIV-1 Bal (picchi di superficie) come visualizzato sulla superficie della membrana virale. (B) Modello molecolare per la Trimepicchi ric determinato mettendo tre copie delle strutture per monomerico gp120 (rosso) derivato da cristallografia a raggi X nella densità mappa 9.
Figura 4. (A) Struttura tridimensionale del virus HIV-1 glicoproteina Busta BAL in complesso con il frammento Fab di un anticorpo ampiamente neutralizzanti, b12. (B) Modello molecolare del complesso determinato da collocare tre copie delle strutture per monomerico gp120-B12 complesso Fab derivato dalla cristallografia a raggi X nella densità mappa 9.
Discussion
Il crio-microscopia elettronica e tridimensionale classificazione e metodi di media qui presentati consentono la determinazione di strutture tridimensionali dei complessi glicoproteina busta per ~ 20 Å di risoluzione. Montaggio di raggi X coordinate dei componenti monomerici alle mappe di densità permette di interpretazione strutturale a livello molecolare. Continui miglioramenti a basso costo apparecchiature informatiche, combinato con evoluzioni in strumenti open source scientifica e la proliferazione di infrastrutture di rete renderà possibile idee scientifiche inimmaginabili collaborativo. Approfittiamo di questi sviluppi e mostrare che avanzate tecniche scientifiche possono essere portati alla portata degli studenti di tutte le età.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo la sezione Prodotti Biologici del programma virus dell'AIDS e del cancro, SAIC Federico, Inc, per la fornitura di purificato, AT-2 trattati con HIV-1 virus, Steven Fellini e colleghi per l'assistenza con l'utilizzo della capacità di calcolo ad alte prestazioni della Biowulf cluster Linux a NIH, Bethesda, MD (http://biowulf.nih.gov) , FEI Company per l'assistenza con il microscopio elettronico, e Ethan Tyler per l'assistenza esperta con figure. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Center for Cancer Research del National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
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