Summary
プロトコルは、低温電子トモグラフィーと三次元画像処理を用いた膜タンパク質の構造を決定するためにハイスループットなアプローチを説明します。それは、試料の準備の詳細、データ収集、データ処理や解釈をカバーし、アプローチの代表的なターゲット、HIV - 1エンベロープ糖タンパク質の生産で締めくくります。これらの計算手順は、リモートで作業し、データ処理および構造解析に貢献する研究者や学生を可能にする方法で設計されています。
Abstract
約30年前の発見以来、60以上の万人がヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染している（www.usaid.gov） 。ウイルスが感染し、CD4 + T細胞、それによって壊滅的を破壊する免疫システムを、と後天性免疫不全症候群（AIDS）2を引き起こす。感染は、HIVのエンベロープ糖タンパク質"スパイク"はCD4 + T細胞の表面上のCD4受容体と接触するときに開始されます。この相互作用は、第二の細胞の表面にコレセプター5,9との相互作用を促進するスパイク、コンフォメーション変化を誘導する。 HIVの感染経路におけるこれらのタンパク質相互作用の重要性は、基本的なHIVの研究に深遠な重要性の、そしてHIVワクチンの追求でそれを行います。
より決定する手法の開発を動機HIVの細胞接触と中和の分子スケールの相互作用を理解する必要があります細胞表面の受容体タンパク質と分子はそのブロックの感染との対話HIVスパイクの構造。低温電子断層撮影法と3D画像処理を用いて、我々は最近、〜20Å分解能9,14で、ネイティブのウイルスの表面のような構造を決定する能力を示した。このアプローチは、HIVのエンベロープの構造を解決するために限定されるものではなく、リポソームに再構成された他のウイルスの膜タンパク質とタンパク質に拡張することができます。このプロトコルでは、我々はHIVエンベロープ糖タンパク質、HIVのウイルス粒子を精製し、準備するガラス固化体のサンプルを段階的に進むから始まる、低温電子顕微鏡のデータを収集し、3Dデータのボリュームを再構成し、処理、3Dタンパク質のサブボリュームを平均化し、分類の構造を取得する方法を説明し、蛋白質のモデルを生成するために、結果を解釈する。我々のアプローチの計算的側面は、アクセスとBiowulf GNU / Linuxのパラレルpを使用してリモートで実行できるモジュールに採用されましたNIHのrocessingクラスター（http://biowulf.nih.gov） 。低コストのコンピュータのハードウェアと高速ネットワークのアクセスと組み合わせてこのリモートアクセスは、学校または自宅で仕事を研究者や学生の関与を可能にしました。
Protocol
ここで説明するアプローチは、特定の楽器のセットを、ツールやソフトウェアを使用して開発されました。すべてのラボがこの同じ実験セットアップを使用しないため、努力は可能な限りのアプローチを一般化し、これが不可能な選択肢を提供するために行われました。
1。ガラス固化体のウイルスのサンプルの準備
次のセクションではガラス固化体のグリッドは、FEI VitrobotマークIII、ブロッティングおよびプランジ凍結のロボットを用いて調製されています。 Iancu、 らを参照してください。このシステム7を使用しての詳細なプロトコルのために。ロボットのプランジャーの代替として、ギロチンスタイルや重力プランジャーは6完全に十分である。
セクション1.2。および1.3。電子顕微鏡のグリッドで使用するために設計されたグロー放電装置を置き換えることができますがガタンSolarus 950グロー放電ユニットは、サンプルのグリッドをきれいにし、その親水性を高めるために使用されます。
ブロッティングとプランジ凍結する前にグリッドに適用されるサンプルの量の量は2μLの範囲内にある必要がありますコンテンツ">が、サンプル混合物中のウイルスやタンパク質-金コロイドのボリュームは、ソースによって異なります。そのようなものとして、それはウイルスと金希釈または比の範囲がテストし、顕微鏡で画像化される必要がある可能性が高い、と理想的な混合物は、経験的に決定。（注）画像データが10と20の間に、3節で獲得された際に、金フィデューシャルマーカーするべきこと適切な傾斜のシリーズの位置合わせのために存在する。注意：このセクションでは、非常に燃えやすい気体エタン、水素、および酸素の使用を説明する。これらのガスを使用するときに適切な注意を払う必要があります。さらに、生物学的安全性の勧告に従ってウイルスのサンプルを処理するために注意すべきである。液体窒素（N 2）及びエタンを処理する際に最後に、必ず保護メガネおよび作業服を着用。
- FEI Vitrobotマークを準備する加湿器のカートリッジを取り付けると、そのN 2ガ スの供給をオンにして、フィルタ処理された脱イオン水でカートリッジを充填することによりIII。 Vitrobotの電源をオンにして、22にその気候室の温度を設定-2 mmのオフセット° C、100％に目標湿度、6秒にブロッティング時間、ブロット。
- ガタンSolarus 950グロー放電ユニットとユニットを供給するオープンH 2とO 2缶の電源を入れます。 50ワットで1分間グロー放電を実行することにより、プリクリーン試料室。
- カバーガラス、上カーボンサイド、およびトップローディングドアからグロー放電の試料室内の場所での穴あきカーボングリッドの希望数を手配する。 25ワットで60〜10秒間のグロー放電を実行することにより、クリーンなグリッド。 （それは製造者からこの情報を入手するのが最善の方法ですので、このプロトコルで使用されているQuantifoilブランドグリッドの炭素側が外観にマットであることに注意してください。これは商業目的のグリッドに対してtrueにはなりません。）
- 優しい声で言う内部の場所のグリッドボックス（ES）lantコンテナのボウル、およびクーラントのボウルの中で座っている中央のカップの熱拡散板のスピンドル。ゆっくりとボウルと液体の間の平衡を示す、勢いのある泡が落ち着くまで、ボウルに液体N 2を注ぐ。液体N手順の残りの部分で2レベル、それを中央のコップの外に保つように注意しながらを維持する。
- エタンのガス缶、ガラスピペットにもう一方の端にプラスチックホースの一方の端を取り付けます。中央のカップの底にガラスピペットの先端を保持し、ゆっくりと、着実にエタンのフローを確立し、エタンが凝縮開始されます。中央のコップがいっぱいになるまで書き込みを続けます。中央のコップからスピンドルを取り外します。
- 不活化HIV - 1ウイルス懸濁液A - 2で10μLを2μLタンパク質 - 金コロイド基準を追加することにより、サンプル液を調製する。ゆっくりと溶液中にフィデューシャルを持って来るために混合物をピペットで。氷上に置きます。
- 特殊なVitrobotピンセットでグリッドの外側の縁をつかみます。炭素のために、サンプル混合物の2μLを適用するグリッドのIDE。すぐに液体エタンで加湿、人工気象室、ブロットおよびプランジ凍結にサンプルをロードするためにロボットに指示する。
- グリッドボックスにガラス固化体のグリッドを転送する。ステップ1.7を繰り返します。グリッドの必要な数を生成する。終了したら、グリッドボックスの蓋（s）のネジがその後すぐに少量の液体窒素輸送デュワーにボックス（複数可）に転送締めます。
2。透過型電子顕微鏡にサンプルをロード
このセクション全体で、ローディングチャンバ内の液体N 2レベルは用心深く監視し、必要に応じて液体補充、グリッドボックスが浸さ留まっているようにしてください。グリッドと接触ツールを持ち込む前に、それは液体と平衡化するまで液体窒素でそれを沈めることによって、それを冷却する。それぞれの使用後は、ツールが熱い空気銃を使用して解凍してください。
このセクション全体FEI Tecnai G2 Polara透過型電子顕微鏡（TEM）を組み合わせて使用されますガタンクライオワークステーションを持つ。ロード液体の下にサンプルをN 2の条件の原則は、すべての低温電子顕微鏡の仕事に適用可能である一方で、このセクションの手順では、実験で使用される機器に固有のものです。別の機器に使用される手順はメーカーによって異なります。
注意：液体N 2を処理する際には、このセクション全体で、常に保護メガネと服を着用。
- そのTEMのCompustageは、試料カートリッジが含まれていない、と標本選択棒と挿入棒は110 K以下であることを確認してください
- クールとサンプルセレクションロッドの一部である標本のストレージブロック、中にグリッドをロードするためのクライオワークステーションを準備する。
- クライオワークステーションに顕微鏡から冷却（<110 K）選択のロッドを転送する。
- クライオワークステーションでの窒素浴に選択ブロックを挿入するために前方に選択のロッドをスライドさせます。特化cを使用してストレージブロックからすべての試料カートリッジを取り外しますartridge処理鉗子。場所のグリッドワークステーションのロードでボックス（ES）とドライバーで蓋（s）を緩めます。
- グリッドボックスとカートリッジの位置からグリッドを削除するには、ピンセットを使用してください。カートリッジ内のグリッドを確保、グリッドの上にCクリップを堆積させるために特化したC -クリップの配置ツールを使用してください。
- ステップ2.5を繰り返します。グリッドの希望数は、カートリッジになるまで。試料の選択ブロックにカートリッジを転送する。
- 標本選択の棒の除去のためのクライオワークステーションを準備します。窒素浴から選択ブロックを削除するために戻って選択ロッドをスライドさせます。クライオワークステーションから選択ロッドを取り外して、TEMに取り付けます。
3。低温電子顕微鏡のデータを取得
このセクションの間に、FEIバッチトモグラフィーソフトウェアのインタフェースは、関心のあるすべてのグリッド位置の座標を格納するバッチファイルを設定するために使用されます。ユーザーが指示されたとき、バッチトモグラフィーソフトウェアは、各ポジションを再検討し、調整を行うデジタル顕微鏡写真を介してチルトシリーズの取得。このソフトウェアを使用できない場合は、Leginonソフトウェアパッケージは、実行可能なフリー、オープンソースの代替13です。イメージングは、後のGIF 2K × 2KのCCDカメラ（ガタン）でガタンイメージングフィルタ（GIF）を使用して、200 keVで行われた。
- 電子ビームは真空中を通過することCompustageような位置。高倍率（34kX）露出モードに切り替え、直接アライメントを実行します。
- エネルギーフィルタのゼロ損失のピークの位置を合わせます。 （これはゼロエネルギー損失を持つ電子の参照を持つエネルギーのフィルタが用意されています。）
- カーボンを搭載したグリッド領域にCompustageを移動します。低倍率（4.5kX）検索モードでは、+ / -15℃の間を行ったり来たりステージを傾けて動揺する人の機能を使用してください。最小限の段のシフトが観察されるまで、その一方で、Z軸ステージの位置を調整します。 （これは、ユーセントリックの高さで約ステージを配置）。何段のシフトが観察されていないときにカッとなることを無効にします。
- 自動ユーセントリック高さfを使用しますユーセントリックの高さを調整するために塗油。 （このルーチンは、ステップ3.3でより正確なユーセントリックの高さを取得するために相互相関を使用しています）。ユーセントリックの高さは、バッチトモグラフィーソフトウェアによって、後で参照するために自動的に保存されます。
- およそ3〜6ビリオン、およびno未満10未満基準マーカーをフィーチャーした関心領域を見つける。バッチトモグラフィーのファイルには、このグリッドの位置を追加。
- 手順3.4を繰り返します。と3.5。位置の希望数が指定されるまで。バッチパラメータを（2 °傾斜刻みで± 60 °、1-2電子/Å2 /チルトビュー）を定義し、バッチを実行します。
4。再建低温電子断層像
- RAPTOR 1で自動基準ベースの位置合わせを用いたチルトシリーズを合わせます。
- IMOD 8でR -重み付け逆投影を使用して断層像を再構築。結果のデータボリューム用の標準ファイル形式はファイル拡張子を持つ、MRCファイルです。MRC。
このセクションでは、ユーザーが断層内でビリオンのサブボリュームを指すことが可能なIMODのカスタマイズされた拡張子を使用しています。第6節では、ビリオンの境界を定義したユーザは、スパイクが自動的に選択されているに沿って面として使用されています。
- IMODを開き、ビリオン移入断層像を読み込みます。
- ビリオンのいずれかを経由して中央のスライスが配置されるまで、断層像のZ -軸に沿って移動します。ビリオンの重心が同定されていることを確認します。そうすることの後に、ビリオンのマーカーを入金。このマーカーは、6節で自動化されたビリオンのセグメンテーションのユーティリティによって使用されます。
- すべてのビリオンのボリュームが識別されるまで、重心の指定を継続する。
- 断層像を閉じて、ビリオンの重心を定義するマーカーセットを保存します。ビリオンは、すべての断層で指定されるまで繰り返します。
- 4つの要因によってIMOD、ダウンサンプルのビリオンsubtomogramsの使い方。
- エッジ強化異方性拡散を用いたノイズ除去のビリオンは、IMODで実装。
- エネルギーベースの3次元のアプローチ（2005年Bartesaghi らに詳述）3を用いた教師なし膜のセグメンテーションの対象ビリオン。
- スパイクは、特定の場所と合成対称スパイク状のボリュームの間の相互相関の極大値に対応するセグメント化されたビリオンの表面上の位置で識別されます。指定したしきい値上記のこれらの場所は、推定上のスパイクのサブボリュームの座標のリストに追加されます。
6。粒子を分類し、平均
- 計算の手順5.8で識別された位置で断層像のサブボリュームを（100 × 100 × 100ボクセル）を解凍します。 （これはノイズ除去またはビニングなしで行われます）。サブボリュームの結果のコレクションには、次のステップに分類し、平均するスパイク蛋白質が含まれています。
- D各スパイクの位置で自動的にセグメント化された膜に、通常のを使用してスパイクの長軸のetermineの方向。このアプローチは、3つのオイラー角の二つの初期推定値を提供します。
- その後のアラインメントに何らかの偏りを防ぐために、残りのインプレースの回転をランダム化する。
- サブボリュームにオイラー角を適用し、その後、翻訳後、それらすべての株式を大量の同じ中心を確実にするために円筒状に平均世界平均にサブボリュームの位置を合わせます。
- 更新された世界平均で最も悪い相関サブボリュームの10％を削除します。これは、誤って識別されたスパイクであることのリスクが最も高い密度を除去するために行われます。
- 整列と外部参照を使用せずに、欠落しているウェッジの適切な会計処理（Bartesaghi ら 、2008年に詳述）4スパイクボリュームを分類する。徐々にサブボリュームのアライメントを調整し、各反復でのスパイクのボリュームを分類する。
- 三回対称性を明確に区分の初期段階で観察されるべきである、と4回目の繰り返しで、3倍の対称性が課されている。各ラウンドで、最も明確に定義されたクラスは平均され、次のラウンドのためのリファレンスとして使用。
- 一般的に〜4000のスパイクは、データセットごとに選択する必要があります。最終的な密度マップは、〜5月12日洗練のラウンド後に得られると各データセットのサブボリュームの約50％からの貢献が含まれます。
7。フィッティングを調整する
- ステップ6.8から生じる密度マップは、UCSFキマイラ12に開かれます。
- X線のシミュレートさ20Åのマップを生成するには、キメラまたはEMAN 10使って座標。
- ドックは、ランダムな方向に調整します。キメラ使用すると、収束が得られるまでは100急勾配上昇ステップの倍数を実行して、最急降下 - アセントローカル最適化、適合座標系で構築されています。
8。代表的な結果
3Dアベレージングを使用し、フィッティングを調整、HIVとSIV Envのスパイクの様々な構造が解決されています。図3Aで示したがHIV - 1株、BAL（紫）からエンベロープのスパイクの構造です。スパイクは、3倍のようなスパイク頂点に膜から測定〜120Åの大きさと対称性、およびスパイクの底で〜35 Åに先細り〜150Åの最大幅を持っています。として単量体gp120のための結晶学的に決定された構造（赤、PDB ID、2NY7から派生）と低温電子断層撮影法を用いて決定した三量体Envのための密度マップを組み合わせることにより、図3Bに示すように、我々は作業用の分子モデルを得ることができた三量体のエンベロープ糖蛋白質複合体（PDB ID、3DNN）9。
我々のアプローチはまた、三量体Envのとgp120の特異的タンパク質の様々な間で形成される複合体の構造解析が可能フラグメントおよび抗体。 envを広く中和B12のFabとの複合化されているこの例は、図4A（コンプレックス全体が紫色で示されている）に示されています。この図では、B12に対応する追加の密度がスパイクから、およびパラレル膜に外側に突出し見られている。このような複合体の構造的解釈は、対応するリガンドに結合したスパイクの部分のための原子座標を持つ密度マップを、適合させることにより分子レベルに拡張することができます。図4Bに示すように、この密度マップは、B12のFab（白）に拘束されるgp120のスパイクタンパク質（PDB IDから派生した、赤、、2NY7）の座標を搭載しているときに、三のgp120コアの相対的な配向は、とに識別（PDBすることができますID、3DNL）。これらのコンフォメーションの関係は、そのようなリガンドは、スパイクと相互作用し、ウイルスの活動を妨害する方法を理解するために有益です。法によって解決されているリガンド非結合とリガンドEnvのいくつかの他の構造はここに含むを発表UDEのそれらのHIV - 1 R3A、SIV CP - MAC、SIVmneE11SとSIVmac239、HIV - 1 Envのバル、sCD4と17bとのFabとの間の三者複合体、およびSIV CP -マックenvは7D3抗体9,14に複合。
図1ウイルス懸濁液から3次元構造へ：。低温電子顕微鏡と3次元再構成における概念的なステップ。
図2 HIV - 1ビリオンの断層像からの（A）代表的なスライス。 （B）コアと表面のスパイクを持つ単一のHIV - 1ビリオンは、模式的に示す。
図3。のようなウイルス膜の表面に表示されるHIV - 1 BALエンベロープ糖蛋白質（表面のスパイク）の（A）三次元構造。 trime用（B）分子モデル密度マップ9にX線結晶解析によって導出された単量体gp120の（赤）のための構造の3つのコピーを配置することによって決定さRICスパイク。
図4。広く中和抗体のFab断片、B12との複合体でのHIV - 1 BALエンベロープ糖タンパク質の（A）三次元構造。 （B）複合体の分子モデルは、密度マップ9にX線結晶解析によって導出された単量体のgp120 - B12のFab複合体の構造体の3つのコピーを配置することで決定。
Discussion
低温電子顕微鏡や三次元の分類と平均化の方法がここに〜20Å分解能のエンベロープ糖タンパク質複合体の三次元構造の決定を可能にして提示。 X線のフィッティングは、密度マップへの単量体成分の座標を分子レベルで構造的な解釈が可能になります。オープンソースの科学的なツールやネットワークインフラの普及の進展と組み合わせた低コストのコンピューティング機器の継続的な改善が可能以前に想像を絶する科学的な共同の努力を行う。我々は、これらの開発の利点を活用し、高度な科学技術が多くの年齢の学生の手の届くところにもたらすことができることを示している。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々はHIV - 1ウイルス、スティーブンフェリーニと同僚に扱わ- 2 AT Biowulfの高性能計算機能の使用の支援については、精製を提供するため、エイズやがんウイルスプログラム、SAICフレデリック、Incの生物製剤課に感謝NIH、ベセスダ、MDでのLinuxクラスタ（http://biowulf.nih.gov）の数字を持つ専門家の支援のため、電子顕微鏡の支援のためのFEI社、そしてイーサンタイラー。この作品は、国立がん研究所、国立衛生研究所、ベセスダ、MDのがん研究のためのセンターからの資金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
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