Summary
Protokollet beskriver en hög genomströmning metod för att fastställa strukturer av membranproteiner med Cryo-elektron tomografi och 3D bildbehandling. Den omfattar uppgifter om extraktion, datainsamling, databearbetning och tolkning, och avslutar med produktionen av en representant mål för strategin, HIV-1 kuvert glykoprotein. Dessa computational förfaranden är utformade på ett sätt som gör att forskare och studenter att arbeta på distans och bidra till databehandling och strukturell analys.
Abstract
Sedan dess upptäckt nästan 30 år sedan har mer än 60 miljoner människor smittats med humant immunbristvirus (HIV) (www.usaid.gov) . Viruset infekterar och förstör CD4 + T-celler och därmed förödande immunförsvaret och orsakar en förvärvad immunbrist syndrom (AIDS) 2. Infektion påbörjas när hiv Kuvert glykoprotein "Spike" kommer i kontakt med CD4 receptor på ytan av CD4 + T-celler. Denna interaktion inducerar en conformationaländring i spetsen, som främjar interaktion med en andra cellytan co-receptor 5,9. Betydelsen av dessa protein interaktioner i HIV-infektion väg gör dem av djupgående betydelse för grundläggande HIV-forskning, och i strävan efter ett vaccin mot hiv.
Behovet av att bättre förstå molekylär skala interaktioner av hiv cell kontakt och neutralisering motiverade att utveckla en teknik för att bestämmastrukturer av HIV spik interagera med cellyteproteiner proteiner och molekyler som blockerar infektion. Använda Cryo-elektron tomografi och 3D bildbehandling, visade vi nyligen förmågan att avgöra sådana strukturer på ytan av infödda virus, ~ 20 en upplösning 9,14. Denna metod är inte begränsad till att lösa hiv Kuvert strukturer, och kan utvidgas till andra virala membranproteiner och proteiner rekonstruerad på ett liposomer. I detta protokoll beskriver vi hur man får strukturer av hiv kuvert glykoproteiner från renat hiv virioner och fortsätter stegvis genom att förbereda förglasat prover, samla in, kryo-elektronmikroskopi data, rekonstruera och bearbeta 3D-data volymer, i genomsnitt och klassificera 3D protein subvolumes och tolka resultat att producera ett protein som modell. Den kalkylmässiga aspekterna av vår strategi var anpassade i moduler som kan nås och genomföras på distans med hjälp av Biowulf GNU / Linux parallellt processing kluster vid NIH (http://biowulf.nih.gov) . Denna fjärråtkomst i kombination med låga kostnader hårdvara och snabb nätverksåtkomst, har gjort det möjligt att engagera forskare och studenter som arbetar i skolan eller hemma.
Protocol
Den metod som beskrivs här har utvecklats med en specifik uppsättning instrument, verktyg och programvara. Eftersom alla laboratorier inte kommer att använda samma experimentuppställning var ansträngningar för att generalisera det tillvägagångssätt där det är möjligt, och ge alternativ där detta inte var möjligt.
1. Förbereda förglasat virusprov
I följande avsnitt förglasade elnät är beredda att använda FEI Vitrobot Mark III, ett läskpapper och dopp frysning robot. Se Iancu, et al. För en utförlig protokoll om att använda detta system 7. Som ett alternativ till en robot kolven, är en giljotin-stil eller gravitation kolven helt tillräcklig 6.
I avsnitt 1.2. och 1.3. en Gatan Solarus 950 glöd urladdningsenhet används för att rengöra prov nät och öka sin hydrofila, men någon glöd utsläpp anordning som är konstruerad för att användas med elektronmikroskopi nät kan ersättas.
innehåll "> om mängden provvolym tillämpas på nätet innan avtorkning och doppa frysning bör vara i storleksordningen 2 mikroliter, kommer viruset och protein-A guld kolloid volym i provet blandningen varierar beroende på källan. Som sådan det är sannolikt att en rad virus och guld spädningar eller nyckeltal kommer att testas och avbildas i mikroskopet, och en perfekt blandning bestämmas empiriskt. Observera att när bilddata förvärvas i avsnitt 3, mellan 10 och 20 guld referenspunkternas markörer bör vara närvarande för ordentlig lutning serie anpassning.Varning: Detta avsnitt beskriver användning av gasformiga etan, väte och syre som är mycket brandfarliga. Korrekt Försiktighet bör iakttas vid användning av dessa gaser. Dessutom bör man för att hantera viruset prover i enlighet med biosäkerhet rekommendationer. Slutligen alltid bära skyddsglasögon och kläder vid hantering av flytande kväve (N 2) och etan.
- Förbered FEI Vitrobot MarkIII genom att vrida på sin N 2 gasförsörjning, installera luftfuktare patronen och sedan fylla patronen med filtrerat avjoniserat vatten. Ström på Vitrobot och ställa dess temperatur klimatkammare till 22 ° C, mål fukt till 100%, läskpapper tid till 6 sek, och blot offset till -2 mm.
- Slå på Gatan Solarus 950 glöd urladdningsenhet och öppen H 2 och O 2 kanistrar som försörjer enheten. Pre-ren exemplar kammare genom att köra sken ansvarsfrihet för 1 min vid 50 watt.
- Ordna önskat antal Holey kol nät på ett glas täckglas, kol uppåt och rum inne glöd urladdning exemplar kammare genom den övre luckan. Rengör nät genom att köra sken ansvarsfrihet för 6-10 sek vid 25 watt. (Observera att kolet sidan av Quantifoil varumärket nät används i detta protokoll är matt i utseende. Detta kommer inte vara sant för alla kommersiella nät så det är bäst att få denna information från tillverkaren.)
- Placera gallret box (er) i COOLant container skål, och termisk diffusor spindel på det centrala koppen som sitter i kylvätskan skål. Häll långsamt flytande N 2 i skålen tills kraftfulla bubblande avtar, vilket indikerar jämvikt mellan skål och vätska. Behåll flytande N 2 nivå under resten av förfarandet, var noga med att hålla den borta från den centrala koppen.
- Fäst ena änden av en plastslang till etan gasbehållaren, och den andra änden till ett glas pipett. Håll glaspipett tips till botten av centrala kopp, upprätta en långsam, stadig etan flöde och etan börjar kondenseras. Fortsätt att fylla tills den centrala koppen är full. Ta bort spindeln från centrala kopp.
- Förbered prov blandningen genom att tillsätta 2 mikroliter protein-A guld kolloid referenspunkternas till 10 mikroliter AT-2 inaktiverat hiv-1 virussuspension. Försiktigt pipett blandning för att få fiducials i lösning. Håll på is.
- Ta tag i yttre kanten av ett rutnät med den specialiserade Vitrobot pincett. Applicera 2 mikroliter av provet blandning av kol side på nätet. Omedelbart instruera roboten att ladda provet i fuktas klimatkammare, blot och doppa frysa i flytande etan.
- Överföring förglasat nätet till nätet rutan. Upprepa steg 1,7. att producera önskat antal galler. När du är klar, dra åt skruvarna på nätet låda lock (er) sedan snabbt överföra box (er) till små flytande kväve transporter Dewar.
2. Proverna i transmissionselektronmikroskop
Under detta avsnitt bör den flytande N 2-nivå i lastnings kammaren övervakas vaksamt, och flytande fylls efter behov, för att säkerställa att nätet lådor kvar nedsänkt. Innan föra ett verktyg i kontakt med ett galler, låt det svalna genom att sänka ned den i flytande N 2 tills den jämvikt med med vätskan. Efter varje användning ska verktyg tinas med hjälp av en varmluftspistol.
Under detta avsnitt FEI Tecnai G2 Polara transmissionselektronmikroskop (TEM) används tillsammansmed en Gatan Cryo Workstation. Även om principen om proverna i flytande N 2 villkor gäller alla Cryo-elektronmikroskopi arbete, stegen i detta avsnitt är specifika för den utrustning som används i experimentet. De steg som används för olika utrustning kommer variera beroende på tillverkare.
VARNING: Under hela det här avsnittet, alltid bära skyddsglasögon och skyddskläder vid hantering av flytande N 2.
- Se till att TEM Compustage inte innehåller ett exemplar patron, och att provet valet staven och insättning spö ligger under 110 K.
- Cool och förbereda Cryo arbetsstation för lastning nät till forvaring block, som ingår i urvalet staven.
- Överför den kylda (<110 K) valet spö från mikroskop för att Cryo Workstation.
- Skjut val stav fram emot att sätta urval blocket till kvävgas bad på Cryo arbetsstation. Ta bort alla exemplar patroner från lager blocket med hjälp av specialiserade Cartridge hantering pincett. Placera gallret box (er) vid lastning arbetsstationer och lossa lock (s) med en skruvmejsel.
- Använd pincett för att ta bort nätet från nätet lådan och placera i patronen. Använd den specialiserade C-klipp placering verktyg för att sätta in en C-klipp ovanpå nätet, säkra elnätet i patronen.
- Upprepa steg 2,5. tills önskat antal nät finns i patroner. Överför kassetter till individ val block.
- Förbered Cryo arbetsstation för borttagning av prov urval stång. Skjut val stav tillbaka för att ta bort markeringen kvarter från kväve bad. Ta bort urval spö från Cryo Workstation och fäster TEM.
3. Förvärva Cryo-elektronmikroskopi uppgifter
Under detta avsnitt är FEI Batch Tomography programvara gränssnitt som används för att skapa en batch-fil som lagrar koordinaterna för alla rutnät positioner av intresse. När uppdrag av användaren, kommer Batch Tomography programvaran återkomma varje positioner och kommer att samordnalutning serie förvärv via digitala mikroskop. Om detta program inte är tillgänglig, är Leginon programpaket livskraftig fri, öppen källkod alternativ 13. Imaging gjordes på 200 keV, med hjälp av en Gatan Imaging Filter (GIF) med en post-GIF 2K x 2K CCD-kamera (Gatan).
- Position Compustage så att elektronstrålen passerar genom vakuum. Växla till hög förstoring (34kX) Exponeringsläge och utföra direkta anpassningar.
- Passa noll förlust peak på energi filter. (Detta ger den energi filtret med en referens för elektroner med noll energiförluster.)
- Flytta Compustage till en ruta med kol. I låg förstoring (4.5kX) Sökläge använder Wobbler funktionen att luta scenen fram och tillbaka mellan + / -15 °. Under tiden justera Z-axeln fas position tills minimala scenen skift observeras. (Detta placerar scenen ungefär eucentric höjd). Inaktivera Wobbler när ingen skede skift observeras.
- Använd den automatiserade Eucentric Höjd f smörjelse att förfina eucentric höjd. (Denna rutin använder korskorrelation att få en mer exakt eucentric höjd än i steg 3.3). Eucentric höjd lagras automatiskt för senare användning av Batch Tomography programvara.
- Hitta ett område av intresse med ca 3-6 virioner, och inte mindre än tio referenspunkternas markörer. Lägg till detta nät möjlighet att partiet tomografi filen.
- Upprepa steg 3,4. och 3,5. tills önskat antal positioner är utsedda. Definiera parti parametrar (± 60 ° med 2 ° lutning steg, 1-2 e-/ A 2 / tilt vy) och kör batch.
4. Rekonstruera Cryo-elektron tomograms
- Rikta lutning serien med automatisk referenspunkternas-baserad anpassning på RAPTOR 1.
- Rekonstruera tomograms med R-viktade back projektion i imod 8. Standarden filformat för den resulterande datavolymer är MRC-fil med filändelsen. MRC.
Detta avsnitt använder en anpassad utbyggnad av imod som tillåter användaren att utse virionens subvolumes inom tomogram. I avsnitt 6, är användardefinierade virionens gränser används som en yta längs vilken spikes automatiskt.
- Öppna imod och ladda en tomogram befolkade med virioner.
- Navigera längs z-axel tomogram tills den centrala skiva genom ett av virioner ligger. Kontrollera att virionens centroiden har identifierats. Efter detta, deponera en virionens markör. Denna markör kommer att användas av den automatiserade virionens segmentering verktyget i avsnitt 6.
- Fortsätt centroiden beteckning tills alla virionens volymer identifieras.
- Stäng tomogram och spara markör som definierar virionens centroids. Upprepa tills virioner har utsetts i alla tomograms.
- Använda imod, ned-prov virionens subtomograms med en faktor fyra.
- Denoise virioner med kant förbättra anisotropa diffusion implementeras som i imod.
- Ämne virioner av oövervakade membran segmentering med hjälp av en energi-baserad tredimensionell metod (enligt Bartesaghi et al. 2005) 3.
- Spikes identifieras på platser på segmenterade virionens ytor som motsvarar den lokala maxima över samband mellan viss plats och ett syntetiskt symmetrisk spik-liknande volym. De orter över en viss tröskel läggs till en lista över koordinater för förmodade spika subvolumes.
6. Klassificera och genomsnittet av de partiklar
- Beräkningsmässigt extrahera tomogram subvolumes (100 x 100 x 100 voxlar) på varje plats som identifierades i steg 5,8. (Detta görs utan denoising eller binning). Den resulterande samling subvolumes innehåller spetsen proteiner som kommer att klassificeras och genomsnitt i följande steg.
- Determine riktlinjerna av den långa axeln i spetsen med hjälp av den normala till automatiskt segmenterade membranet på var varje spik. Denna metod ger ursprungliga beräkningarna för två av de tre Eulers vinklar.
- Randomize resterande på plats rotation för att förhindra eventuella partiskhet i senare anpassningar.
- Applicera Euler vinklar subvolumes, sedan translationally anpassa subvolumes till sina cylindriskt genomsnitt jordens medeltemperatur att säkerställa att de alla har samma masscentrum.
- Ta bort 10% av subvolumes som korrelerar sämst med den uppdaterade globala genomsnittet. Detta görs för att ta bort densiteter löper störst risk att bli felaktigt identifierade spikar.
- Rikta in och klassificera spik volymer utan att använda externa referenser och med god redovisningssed av de saknade kil (enligt Bartesaghi et al. 2008) 4. Successivt förfina subvolume väglinjer och klassificera spik volymer vid varje iteration.
- Tre gånger symmetri bör tydligt observeras i ett tidigt skede av klassificeringen, och vid den fjärde iteration, är 3-faldig symmetri införas. Vid varje runda, är de mest väldefinierade klasser genomsnitt och användas som referens för nästa omgång.
- Normalt ~ 4000 spikar bör väljas för varje dataset. Slutlig täthet kartor erhålls efter ~ 5-12 förfining rundor och kommer att innehålla bidrag från ~ 50% av sub-volymer i varje dataset.
7. Samordna montering
- Densiteten kartorna som följer steg 6,8 öppnas i UCSF Chimera 12.
- Producera en simulerad 20 En karta över röntgen-koordinater med hjälp av Chimera eller asylnätverket 10.
- Dock koordinater i slumpmässiga riktningar. Använda Chimera inbyggda i brantaste-stigning lokal optimering, passar koordinater genom att utföra multiplar om 100 brantaste stigningen steg tills konvergens uppnås.
8. Representativa resultat
Använda 3D-snitt och samordna montering, en variation av HIV och SIV Env spik strukturer har lösts. Redovisas i Figur 3A är strukturen av kuvertet spik från HIV-1-stam, Bal (lila). Spetsen har tre gånger symmetri med måtten ~ 120 A mätt från membranet till spik apex och en maximal bredd på ~ 150 A, som smalnar ner till ~ 35 A vid basen av spik. Som framgår av Figur 3B, genom att kombinera densiteten kartan för trimeric Env bestämmas med hjälp av cryo-elektron tomografi med crystallographically bestämd struktur för monomera gp120 (röd, som härrör från det preliminära budgetförslaget ID, 2NY7), kunde vi få en fungerande molekylär modell för trimeric kuvertet glykoprotein komplex (PDB ID, 3DNN) 9.
Vårt förhållningssätt gör det också möjligt för den strukturella analysen av komplex som bildas mellan trimeric ENV och en mängd gp120-specifikt proteinfragment och antikroppar. Ett exempel på detta, där Env är komplex med den brett neutraliserande B12 Fab visas i figur 4A (hela komplexet visas i lila). I denna figur är den extra täthet motsvarande B12 sett projicerar utåt från spik, och parallellt med membranet. Strukturella tolkningar av sådant komplex kan utökas till molekylär nivå genom att montera densiteten kartor med atom-koordinater för delar av spik, bundna till motsvarande ligand. Som framgår i figur 4B, när denna densitet kartan är försedd med koordinater gp120 spik protein (röd, som härrör från det preliminära budgetförslaget ID, 2NY7) bunden av B12 Fab (vit), den relativa riktlinjerna för de tre gp120 kärnor kan urskiljas (PDB ID, 3DNL). Dessa konformationsanalys relationer är lärorikt för att förstå hur sådana ligander interagerar med spik och störa virusaktivitet. Några andra strukturer unliganded och liganded Env som har lösts av den metod som presenteras här inklUde de HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S och SIVmac239, den ternära komplex mellan HIV-1 Bal ENV, sCD4 och 17b Fab, och SIV CP-Mac Env komplex till 7D3 antikroppar 9,14.
Figur 1 Från virussuspension till 3D-struktur:. Konceptuella steg i kryo-elektronmikroskopi och 3D-rekonstruktion.
Figur 2. (A) En representant skiva från en tomogram av HIV-1 virus. (B) en enda HIV-1-virus, med kärnan och ytan spikar visas schematiskt.
Figur 3. (A) tredimensionell struktur av HIV-1 BaL kuvert glykoprotein (yta spikar) som visas på ytan av viralt membranet. (B) Molekylär modell för trimeRIC spikar bestäms genom att lägga tre kopior av strukturer för monomera gp120 (röd), som person med röntgenkristallografi i tätheten kartan 9.
Figur 4. (A) tredimensionella strukturen av HIV-1 BaL kuvert glykoprotein i komplex med Fab-fragmentet av ett brett neutraliserande antikroppar, B12. (B) Molekylär modell för de komplexa bestäms genom att lägga tre kopior av strukturer för monomera gp120-B12 Fab komplex som person med röntgenkristallografi i tätheten kartan 9.
Discussion
Cryo-elektronmikroskopi och tredimensionella klassificering och genomsnitt metoder som presenteras här gör det möjligt att bestämma tredimensionella strukturer av komplex kuvertet glykoprotein till ~ 20 en resolution. Montering av röntgen koordinater monomera komponenter till densiteten kartorna gör det möjligt för strukturella tolkningar på molekylär nivå. Fortsatta förbättringar i lågkostnadsländer datautrustning i kombination med utvecklingen inom öppen källkod vetenskapliga verktyg och spridningen av infrastruktur möjliggör tidigare otänkbara vetenskapligt samarbete strävanden. Vi drar nytta av denna utveckling och visar att avancerade vetenskapliga metoder kan föras inom räckhåll för elever i många åldrar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar biologiska produkter delen av aids och cancer virus program, SAIC Frederick, Inc, för renat tillhandahålla, AT-2 behandlade HIV-1-virus, Steven Fellini och kollegor för hjälp med användning av högpresterande beräkningsresurser kapacitet Biowulf Linux-kluster vid NIH, Bethesda, MD (http://biowulf.nih.gov) , FEI Company för hjälp med elektronmikroskopi och Ethan Tyler för experthjälp med siffror. Detta arbete stöddes av medel från Centrum för cancerforskning vid National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-A Holey Carbon Grids | Quantifoil Micro Tools | - | 200 mesh |
| Protein A gold colloid | University of Utrech - The Netherlands | - | 10 nm diameter |
| HIV-1 BaL | National Institutes of Health | - | ~ 1011 virions/mL |
| Cryo-EM storage box | Pacific Grid Tech | GB-4R | 4-hole, round |
| Vitrobot Mark III | FEI | - | 6 second blot time, -2 mm offset, 100% humidity |
| Tecnai G2 Polara transmission electron microscope | FEI | - | 200 keV |
| Gatan Imaging Filter | Gatan | - | - |
| Gatan Post-GIF CCD | Gatan | - | 2K x 2K pixels |
| Gatan Cryo Workstation | Gatan | - | - |
| Gatan Solarus 950 Plasma Cleaning System | Gatan | - | Oxygen and Hydrogen plasmas |
| C - clips | FEI | ZIT0634 | - |
| Biowulf computing cluster | National Institutes of Health | - | http://biowulf.nih.gov/ |
| UCSF Chimera | University of California - San Francisco | - | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
| IMOD | University of Colorado - Boulder | - | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |
| EMAN | Baylor College of Medicine | - | http://blake.bcm.tmc.edu/eman/ |
| RAPTOR | Stanford University | - | http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm |
References
- Amat, F. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).
- Bowen, D. L., Lane, H. C., Fauci, A. S. Immunopathogenesis of the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Intern. Med. 103, 704-709 (1985).
- Bartesaghi, A., Sapiro, G., Subramaniam, S. An Energy-Based Three-Dimensional Segmentation Approach for the Quantitative Interpretation of Electron Tomograms. IEEE. T. Image. Process. 14, 1314-1323 (2005).
- Bartesaghi, A. Classification and 3D averaging with missing wedge correction in biological electron tomography. J. Struct. Biol. 162, 437-450 (2008).
- Harris, A. Trimeric HIV-1 gp140 immunogens and native HIV-1 envelope glycoproteins display the same closed and open quaternary molecular architectures. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11440-11445 (2011).
- Harris, R. J., Adrian, M. Preparation of thin-film frozen-hydrated/vitrified biological specimens for cryoelectron microscopy. Methods Mol. Biol. 117, 31-48 (1999).
- Iancu, C. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1, 2813-2819 (2006).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. J. Struct. Biol. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data using IMOD. 116, 71-76 (1996).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455, 109-113 (2008).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: Semiautomated Software for High-Resolution Single-Particle Reconstructions. J. Struct. Biol. 128, 82-97 (1999).
- Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nat. Rev. Microbiol. 7, 666-675 (2009).
- Pettersen, E. F. UCSF Chimera - A Visualization System for Exploratory Research and Analysis. J. Comput. Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Suloway, C. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41-60 (2005).
- White, T. Molecular architectures of trimeric SIV and HIV-1 envelope glycoproteins on intact viruses: strain-dependent variation in quaternary structure. PLoS. Pathog. 6, e1001249-e1001249 (2010).
