Summary
在这个协议中，我们描述直接胞浆内显微注射细胞色素
Abstract
凋亡或程序性细胞死亡，是一个保守的和高度管制的途径，其中的细胞死亡 ， 1。可以触发细胞凋亡的细胞时遇到一个广泛的细胞毒性强调。这些侮辱启动信号级联反应，最终导致细胞色素 C从线粒体intermembrane空间释放到细胞质2。细胞色素 C从线粒体释放，是一个关键的事件触发迅速激活caspases的，关键的细胞蛋白酶，其最终执行细胞死亡3-4。
细胞凋亡通路是调节细胞色素 C从线粒体释放5点的上游和下游。为了研究线粒体调节caspase活化后，许多研究者纷纷转向直接holocytochrome C（血红素附后）蛋白质进入细胞6-9的胞浆内显微注射。细胞色素 c通常是本地化的线粒体一个血红素组的附件是必要的，使其能够激活细胞凋亡 10-11 。因此，直接激活caspases的，这是必要的，因为细胞色素 C的基因结构表达，而将导致线粒体定位和血红素附件，它将会从胞质caspases的螯合注入holocytochrome C蛋白，而不是其cDNA。因此，直接附加纯化的血红素细胞色素C蛋白的胞浆内显微注射是一个有用的工具，以模仿不使用造成细胞线粒体损伤的有毒侮辱的线粒体细胞色素C释放和凋亡。
在这篇文章中，我们描述了细胞色素 c蛋白进入细胞的显微注射的方法，用小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和主要交感神经元作为例子。虽然这个协议对细胞色素 C注射液对细胞凋亡的调查重点，这里显示的技术也可以很容易地适应注射其他感兴趣的蛋白质。
Protocol
1。生产的微量注射针
- 商业预制的显微注射针（如Eppendorf公司Femtotips）是有用的，如果没有进行大量的microinjections。然而，对于那些希望建立长期的能力，为显微注射，另一种方法是在实验室采用薄壁高硼硅玻璃毛细管和商业针拉马生产的微量注射针。这也使针的形状是多种多样的，可用于不同类型的细胞。
- Narishige PC - 10显微注射针拖轮，将所有4个重量和58.0相对热定型（第二热水器）使用一个单步拉方案（第1步设置）。请务必放置在中心的每一个毛细血管加热元件，使这两个导致针头长度是一个类似的。
- 拉几个毛细血管（约2为每个感兴趣的蛋白质的毛细血管）。
- 商店针在一个容器中，同时确保不损坏针尖。在容器内，可用于材料，如泡沫或Blu - TACK举行显微注射针。
2。注射蛋白质混合物的制备
- 准备了10倍的显微注射缓冲液pH值在7.4 1米氯化钾和0.1 M磷酸钾（KPI），缓冲区（K 2 HPO 4和 KH 2 PO 4摩尔混合物）。这个缓冲区，可以在室温下长期存放。
- 为了形象化注射，这样的荧光染料罗丹明-葡聚糖需要加以补充。在水中稀释the10x显微注射缓冲和罗丹明-葡聚糖粉末溶于5倍的显微注射缓冲液中含有20-40毫克/毫升罗丹明右旋糖酐。
- 商店这个解决方案，在黑暗中，在4 ° C。它应为多达100个个人的蛋白质溶液的准备工作有足够。其它染料，如异硫氰酸荧光素葡聚糖，可以替代。
- 准备溶于水纯化细胞色素 c的浓度为20毫克/毫升细胞色素 c的股票。商店细胞色素 c在-80 ° C下长期贮存和小（〜10μL）分装储存在细胞色素 c，避免反复冻融。
- 准备注射10μL蛋白质混合物2μL5倍显微注射缓冲液3μL水和5μL的细胞色素 C终浓度为10 mg / mL的细胞色素 c在1x缓冲液（氯化钾100毫米，10毫米KP罗丹明-葡聚糖结合我 4-8毫克/毫升罗丹明葡聚糖）。
3。细胞质显微注射细胞色素 c
- 之前，以显微注射，离心16,000克的细胞色素 C和显微注射缓冲的混合物为10分钟，在4 ° C至单独的任何微粒物质可能堵塞显微注射针。
- 在离心过程中，微量允许气压建立。
- 放在显微镜阶段的中心一碟的细胞和细胞的重点。为了尽量减少时间，细胞外的孵化器，的数量，细胞通常返回在30分钟内的孵化器。
- 吸取0.5-1微升到钝端的毛细管顶面的蛋白质混合物。小心不要吸管已离心管底部的粒子。一分钟内，蛋白质混合物将分发到针尖通过毛细作用。
- 毛细管持有人的显微和位置，因此，其尖端通过在显微镜透射光经过约45 °角的针针连接牢固。
- 调整针尖的位置，使其位于视野中心直接。中心针，用显微针移动，同时通过显微镜目镜。针的阴影应该是可见的。使只看到它的身影在视野的一半，表明针尖以上的细胞为中心，调整针。
- 设置的微量连续流动模式，并设定工作压力为20 - 100百帕。每一针，可能需要不同的工作压力，工作压力可能会需要在显微注射过程中的调整，以保持一个稳定的的流量。
- 下针，使用粗旋钮位置正上方的细胞。要做到这一点，提高显微镜的焦平面位置正上方的细胞。然后重点是降低对使用粗旋钮细胞的针，直到针尖。
- 中心视野范围内的针尖，并增加通过改变显微镜物镜的放大倍率。
- 慢慢放下针使用罚款操纵旋钮unti升针略高于细胞焦平面。
- 检查红色荧光的罗丹明蛋白质混合物的流动。蛋白质混合物应退出针薄，络绎不绝。针应更换和重新加载如果针被攻破或如果流量是过于强烈。有时，是封闭的玻璃毛细管尖端和无流针。如果发生这种情况，更换针头或仔细降低到培养皿的底部针尖轻轻破裂。
- 针尖，这是对一个细胞在大约45 °角指向的位置。然后用一个平滑的运动，降低针，而走向细胞。与第二个平滑的运动，立即扭转针的方向，从细胞中移除。
- 一个成功的注入细胞往往会略微膨胀，可以通过可视化细胞内的红色荧光的罗丹明确认。有时，将意外注入细胞中的细胞核，这将是可见的的。
- 继续注资，通过调整显微镜阶段，直到约50-100细胞注入细胞。当移动显微镜阶段，一定要提高显微注射针，以便它清除细胞的顶部。
4。代表性的成果：
胞浆内显微注射细胞色素 C从线粒体细胞凋亡过程中模仿其释放。因此，正如所料，成纤维细胞迅速进行胞浆内显微注射的牛细胞色素 c（图1A）后，细胞凋亡。为了确保单独注射过程不负责细胞死亡，注射酵母细胞色素 c作为一个重要的控制的，因为酵母细胞色素 c是无法激活caspases 的 12 。
有趣的是，有丝分裂后的交感神经元胞浆细胞色素c（ 图 1B）8,13显着的抗。我们的实验室已经确定了内源性caspase抑制剂XIAP的是一个 14神经细胞caspase活化的关键抑制剂。因此，神经元细胞色素C注射液后死亡，XIAP的必须先成为灭活。例如，显微注射到XIAP - / -交感神经元细胞色素 C是足以让在这些细胞中caspase活化和细胞凋亡（图2）。
图1。细胞质显微注射细胞色素 C诱导成纤维细胞迅速死亡，但没有神经元。一）野生型MEFs或（B）出生后5野生型交感神经元牛细胞色素C（10毫克/毫升），连同罗丹明-葡聚糖标记注射细胞显微注射。图像显示细胞后立即注射（0小时）相同的领域，或在指定的时间。箭头指示注入细胞。比例尺，20微米。
图2。 XIAP的缺陷神经元容易胞浆细胞色素 C显微注射。产后第5天XIAP的基因敲除小鼠的交感神经元，与牛的细胞色素 C（10毫克/毫升），连同罗丹明-葡聚糖标记注射细胞显微注射。图像显示，同一领域的细胞立即注射后（0小时），或细胞色素 c显微注射后5小时（5小时）。比例尺，20微米。
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Discussion
直接进入细胞胞浆内显微注射细胞色素 C是一种独特而强大的的工具，它允许后线粒体调控细胞凋亡的研究。更重要的是，这种技术可以让没有使用导致细胞或线粒体损伤的代理的直接激活线粒体凋亡下游。
虽然这个协议对微量注射细胞色素 C对细胞凋亡的研究重点，这里显示的蛋白质显微注射法的一般原则也可以用于其他感兴趣的蛋白质。例如，一些研究者已经使用微量注射抗体针对特定的蛋白质，如细 胞色素 c或c - Jun在细胞凋亡的研究13,15 ，。
显微注射过程中最常见的困难是在手术过程中的显微注射针堵塞。如果针头变得堵塞，可以使用“干净”的微量的功能，通过针发送强大的压力脉冲驱逐颗粒阻塞针头的开放。通常情况下，清洁的针足以疏通针。但是，如果染料被视为退出针，但在一个“干净”立即停止再次，这表明，微量的工作压力可能太低。在这种情况下，增加工作压力，直到再次被视为一个连续流从针。清洁针头并不总是恢复流动，在这种情况下，针最有可能需要更换。一个技术，它可以作为一种替代，特别是如果注射材料本身是宝贵的，涉及轻轻地打破了对组织培养皿底部的显微注射针的尖端。如果仔细做，这样可以扩大针的开放，将恢复流动。然而，在针开放的大裂缝会导致染料的大量释放到培养皿中，模糊了细胞的看法。
不幸的是，并非所有类型的细胞能够被显微注射。有些细胞（如小脑颗粒神经元）显微注射过小。其他细胞（如成人心肌），而足够大，不能承受注射过程和与控制注射，甚至死亡。如上所述，酵母细胞色素 c的显微注射服务， 因为酵母细胞色素c是无法激活caspases的作为一个有效的控制。细胞与酵母细胞色素 c显微注射不会激活细胞凋亡，除非它是由于显微注射过程本身。最后，某些细胞（如纤维母细胞）能承受显微注射，但可能难以注入，因为他们的平面形态。因此，有一种风险，即每个细胞注入的显微注射针将打破对组织培养皿的底部。
自动或手动micromanipulators可用于蛋白显微注射，每个系统的优点和缺点。自动化micromanipulators是方便，因为注射细胞的显微注射针自动降低，可以设置一个Z轴的水平。注入细胞，其高度是整个细胞培养单层类似时，这是特别有用。然而，涂菜培养的细胞（如神经细胞胶原涂层菜肴镀），立体性，使这些文化设置一个特定的Z轴水平繁琐。对于这些文化，手工micromanipulators是有利的，因为针可迅速调整到每个单元的具体高度。
显微注射可以是一个困难的技术掌握和实践需要。此外，显微注射技术有一定的局限性。例如，只有在组织培养皿中的细胞的比例很小，可以被注入。因此，在整个文化收集生化制剂（如细胞裂解液进行Western blot）不是一个单独注入细胞准确地表述。相反，大多数实验需要在单细胞水平上完成。然而，一旦这里介绍的基本技术都掌握，可以执行一套独特的实验测试用其他方法不能回答的假设。
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Disclosures
所有的动物实验程序批准的机构动物护理和使用委员会在北卡罗莱纳大学。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS042197到MD支持。 AJK支持补助T32GM008719和F30NS068006。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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