Summary
このプロトコルでは、我々は、シトクロムの直接細胞質マイクロインジェクションを説明します
Abstract
アポトーシス、またはプログラムされた細胞死は、細胞が1を死滅することによって保存し、高度に制御された経路である。細胞は細胞傷害性ストレスの広い範囲に到達したときにアポトーシスを引き起こすことができます。これらの侮辱は、最終的にミトコンドリアの膜間腔から細胞質2〜 シトクロム cの放出を引き起こすシグナル伝達カスケードを開始する。ミトコンドリアからのシトクロム cの放出は、カスパーゼ、最終的に3〜4細胞死を実行する主要な細胞内プロテアーゼの急速な活性化をトリガーするキーイベントです。
アポトーシスの経路はミトコンドリア5からのシトクロム c の放出の上流と下流のポイントで規制されている。カスパーゼ活性化の後のミトコンドリア調節を研究するためには、多くの研究者は細胞6月9日にholocytochrome C（ヘムに接続された）タンパク質の細胞質マイクロインジェクションを指示することになっている。 シトクロム c は、通常、ヘムグループの添付ファイルはそれが10月11日アポトーシス活性化できるようにするために必要であるミトコンドリアに局在している。したがって、直接カスパーゼを活性化するために、それはcDNA構築物からシトクロム cの発現がミトコンドリアターゲティングとヘムの添付ファイルにつながる一方、それは細胞質カスパーゼから隔離されるため、holocytochrome Cタンパク質の代わりに、そのcDNAを注入する必要があります。このように、精製したヘムに接続されたシトクロム c 蛋白質の直接細胞質マイクロインジェクションは、細胞とミトコンドリアの損傷を引き起こす有毒な侮辱を使用せずに、ミトコンドリアのシトクロム c の放出とアポトーシスを模倣するために有用なツールです。
この記事では、我々はマウス胚性繊維芽細胞（MEF）と例のような主要な交感神経ニューロンを用いて、細胞内へのシトクロム c 蛋白質のマイクロインジェクションのための方法を説明します。このプロトコルは、アポトーシスの調査のためのシトクロム cの注入に焦点を当てているが、ここに示されている技術も容易に関心のある他のタンパク質のマイクロインジェクションのために適応させることができる。
Protocol
1。マイクロインジェクションの針の生産
- プレハブマイクロインジェクションの針は、市販されている（ 例えば 。エッペンドルフからFemtotips）と一microinjectionsの多数実行されていない場合に便利です。しかし、マイクロインジェクションのために長期的な能力を確立したい人のために、代替手段は薄い壁ホウケイ酸ガラス毛細管と商業ニードルプラーを使用して実験室でマイクロインジェクションの針を生成することです。これはまた、針の形状を変化させることができますさまざまな種類の細胞に有用であることができる。
- ナリシゲPC - 10マイクロインジェクションニードルプラーで、すべての4つの重みを添付し、58.0（第2のヒーター）で相対的な熱の設定でワンステップ引っ張るプログラム（ステップ1の設定）を使用します。結果の2つの針が同じような長さになるように各キャピラリーの中心に発熱体を配置してください。
- いくつかの毛細血管を（関心の各タンパク質の約2毛細血管）を引き出します。
- 針の先端を破損しないようにしている間に容器に針を保管してください。このような発泡体またはBlu -タックなどの材料は、マイクロインジェクションの針を保持するためにコンテナで使用することができます。
2。注射用タンパク質混合物の調製
- 1 M塩化カリウム及びpH7.4の0.1 Mリン酸カリウム（KPI）バッファ（K 2 HPO 4、KH 2 PO 4の等モル混合物）を含む10倍マイクロインジェクションのバッファを準備します。このバッファは、室温での長期保存することができます。
- 注射を可視化するために、ローダミン-デキストランのような蛍光色素を追加する必要があります。水中でthe10xマイクロインジェクションバッファーを希釈し、20〜40 mg / mLのローダミンデキストランを含む5倍のマイクロインジェクション緩衝液を作るためにローダミン-デキストラン粉末を溶解する。
- 4℃暗所でこのソリューション℃にて保存してください。それは、最大100個々のタンパク質溶液製剤の十分なはずです。フルオレセインイソチオシアネート - デキストランのような他の染料は、置き換えることができます。
- 20 mg / mLの濃度に水で精製シトクロム c を溶解することによってシトクロム c の株式を準備します。 -80℃ストアシトクロム c ° Cの長期保管と小さい（〜10μL）アリコートにシトクロム c を格納することにより、凍結融解を避けるため。
- 3μLの水と1 ×緩衝液（100mM KCl、10mMのKPに10 mg / mLのシトクロム cの最終濃度は5μL シトクロム cとローダミン-デキストランを含む2μL5倍のマイクロインジェクションのバッファを組み合わせることにより、注射用10μLのタンパク質混合物を準備する私 、4-8 mg / mLのローダミンデキストラン）。
3。 シトクロム cの細胞質マイクロインジェクション
- 直前にマイクロインジェクションに、℃のマイクロインジェクションの針を詰まらせる可能性のある粒子状物質を分離するために4℃で10分間16,000 gでシトクロム cおよびマイクロインジェクションバッファーの混合物を遠心分離。
- 遠心操作中に、空気の圧力が構築できるようにするインジェクターをオンにします。
- 顕微鏡ステージの中央に細胞の皿を置き、セルにフォーカスを設定します。細胞をインキュベーター外で保持される時間の量を最小限に抑えるために、細胞は通常、30分以内にインキュベーターに戻されます。
- キャピラリーの平滑末端へのタンパク質の混合物の上面からピペット0.5から1μL。チューブの底に遠心分離されているすべての粒子をピペッティングしないように注意してください。分以内に、タンパク質混合物は毛細管現象を介して針の先端に配布します。
- マイクロマニピュレータと位置の先端が約45 °の角度で、顕微鏡の透過光を通過するように針のキャピラリーホルダーにしっかりと針を取り付けます。
- それは視野の中心に直接置かれているように、針の先端の位置を調整します。センター針をするために、顕微鏡の接眼レンズをのぞきながら、針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。針の影が見えるはずです。その影が唯一の針先がセルの上に中央揃えされていることを示す、視野の半分に見られるようにニードルを調整します。
- 連続フローモードにインジェクターを設定し、20に作動圧力を設定する - 100 hPaのを。それぞれの針は、別の作動圧力を必要とするかもしれません、と使用圧力は、おそらく一定の流れを維持するためにマイクロインジェクションの手順の間に調整が必要になります。
- ちょうど細胞上に位置する粗ノブを使って針を下ろします。これを行うには、ちょうど細胞上の位置に顕微鏡の焦点面を上げる。針の先端にフォーカスがあるまで、粗いノブを使用してセルに向かって針を下ろします。
- 再中央針の視野内の先端と顕微鏡対物を変更することにより、倍率を増加させる。
- 徐々に細かいマニピュレータノブuntiを使用して針を下げるlは針がわずかに細胞の焦点面より上です。
- ローダミンの赤色の蛍光を見ることによって、タンパク質の混合物の流れを確認してください。タンパク質混合物は薄い、定数ストリームとして針を終了する必要があります。針が危険にさらされている場合またはフローがあまりにも強い場合に針を交換して再ロードする必要があります。時には、ガラスキャピラリーの先端はクローズされ、フローが針から見られない。この問題が発生した場合は、針を交換するか、または慎重にゆっくりと破裂針の先端に培養皿の底にそれを下げる。
- それは約45 °の角度でセル方向を向いているように、針の先端を合わせます。セルに向かって移動しながらの滑らかな動きで、針を下ろします。第二滑らかな動きで、すぐに細胞からそれを削除するには、針の方向を反転させます。
- が正常に注入された細胞は、しばしばわずかに膨潤し、細胞内の赤色蛍光ローダミンを視覚化することによって確認することができます。時折、セルが誤って表示される核に注入されます。
- 約50から100の細胞が注入されるまで、顕微鏡のステージを調整することによって、細胞を注入し続ける。顕微鏡ステージを移動するとき、それは細胞の上部をクリアするようにマイクロインジェクションの針を上げてください。
4。代表的な結果：
シトクロム cの細胞質マイクロインジェクションは、アポトーシス中にミトコンドリアから放出を模倣しています。このように、予想通り、線維芽細胞は急速にウシシトクロム c（図1A）の細胞質マイクロインジェクションによりアポトーシスを起こす。酵母シトクロム c はカスパーゼ12を活性化することはできないので単独で注射の手順は、細胞死の責任ではないことを保証するために、酵母シトクロム cの注入は、重要なコントロールとして機能します。
興味深いことに、有糸分裂後交感神経ニューロンは、細胞質シトクロム c（図1B）8,13に対して非常に耐性があります。私たちの研究室では、内因性カスパーゼ阻害剤のXIAPは、ニューロン14のカスパーゼ活性化の鍵阻害剤であることを確認しています。したがって、 シトクロム c の注射後に死ぬためにニューロンは、XIAPは、まず不活性化する必要があります。例えば、XIAPへのシトクロム cのマイクロインジェクション- / -交感神経ニューロンは、これらの細胞におけるカスパーゼ活性化とアポトーシス（図2）を可能にする十分です。
図1。 シトクロム cの細胞質マイクロインジェクションは、急速に線維芽細胞の死ではなく、神経細胞を誘導する。 A）野生型MEFには、または（B）生後5日目の野生型交感神経ニューロンは、注入された細胞をマークするためにローダミン-デキストランと一緒にウシシトクロム c（に10 mg / mL）でマイクロインジェクションした。画像はセルの同じフィールドの直後に注射（0時間）を表示、または指定された時間に。矢印は、注入された細胞を示す。スケールバー、20μmである。
図2。 XIAP欠損ニューロンは、細胞質シトクロム c のマイクロインジェクションの影響を受けやすくなっています 。 XIAPノックアウトマウスから生後5日目交感神経のニューロンは、注入された細胞をマークするためにローダミン-デキストランと一緒にウシシトクロム c（に10 mg / mL）でマイクロインジェクションした。画像は、同じ細胞をすぐに次の注入のフィールド（0時間）、またはシトクロム c のマイクロインジェクション後の5時間（5時間）を示す。スケールバー、20μmである。
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Discussion
直接細胞の細胞質へのシトクロム cのマイクロインジェクションは、アポトーシスの後のミトコンドリア調節の研究を可能にするユニークで強力なツールです。重要なのは、この手法は、細胞やミトコンドリアの損傷を引き起こす薬剤を使用せずに、ミトコンドリアのアポトーシスの下流の直接活性化することができます。
このプロトコルは、アポトーシスの研究のためのシトクロム cのマイクロインジェクションに焦点を当てているが、ここに示す蛋白質のマイクロインジェクションの一般原則は、関心のある他のタンパク質にも使用できます。例えば、いくつかの研究者はそのようなアポトーシス13,15の研究におけるシトクロム cやc - Junなど特定のタンパク質を、標的とする抗体のマイクロインジェクションを使用している。
マイクロインジェクション時の最も一般的な難しさは、手順の実行中にマイクロインジェクションの針の目詰まりです。針が目詰まりした場合、片方が針の開口部をブロックして粒子を追放するために針を介して強力な圧力パルスを送信するマイクロインジェクターの"クリーン"機能を使用することができます。多くの場合、針をクリーニングするニードルの詰まりを取るのに十分です。しかし、染料は"クリーン"が、すぐに中に針を終了する確認された場合は再度停止、これは、微量注入器で使用圧力が低すぎる可能性があることを示しています。針からの連続的な流れが再び見られるまで、このケースでは、使用圧力を増加させる。針のクリーニングは常に針ほとんどを交換する必要があります、その場合には、フローを復元しません。注入材料自体が貴重な場合は特に、代替手段として使用することができるテクニックの1つは、静かに組織培養皿の底に対するマイクロインジェクションの針の先端を壊す伴います。慎重に行う場合、これは針の開口部を拡大することができ、流れを復元します。しかし、針の開口部に大きな亀裂は、セルの表示をわかりにくく、培養皿への色素の大量放出の原因となります。
残念ながら、すべての細胞型は、マイクロインジェクションされることが可能です。いくつかの細胞は（例えば小脳顆粒ニューロン）マイクロインジェクションには小さすぎます。他の細胞（例えば、成人の心筋細胞）、十分な大きさながら、注入手順を耐えることができず、制御の注射でさえ死ぬ。酵母シトクロム c はカスパーゼを活性化することができないので、上記のように、酵母シトクロム cのマイクロインジェクションは、有用なコントロールとして機能します。それは、マイクロインジェクションの手順自体に起因する場合を除き、酵母シトクロム cで微量注入細胞はアポトーシスを起動しません。最後に、一部の細胞は（例えば、線維芽細胞）マイクロインジェクションに耐えることができるがために彼らの平らな形態の注入が困難になる可能性があります。その結果、マイクロインジェクションの針が注入される各セルを組織培養皿の底に壊れる危険性があります。
自動または手動マニピュレーターは、長所と短所を持っている各システムで、蛋白質のマイクロインジェクションに使用することができます。いずれかのマイクロインジェクションの針が自動的にセルを挿入するため低下させるためにz軸のレベルを設定できるため、自動化されたマニピュレーターが便利です。その高さは細胞培養の単分子層で類似している細胞を注入する場合に特に便利です。しかし、コートディッシュ上で培養された細胞（例えば神経細胞がコラーゲンをコートしたディッシュに播種）のために、これらの培養物の三次元性質は、退屈な、特定のz軸のレベルを設定することができます。針が急速に各セルの特定の高さに調整できるので、これらの培養物の場合は、手動マニピュレーターが有利である。
マイクロインジェクションは、克服するのが難しい技術であることができると練習が必要になります。さらに、マイクロインジェクションの手法は、いくつかの制限があります。例えば、組織培養皿中の細胞のわずかな割合を注入することができます。従って、全体の文化が収集されている生化学的製剤には（ウェスタンブロット用など、細胞溶解物）単独で注入された細胞の正確な表現ではありません。代わりに、ほとんどの実験は、単一細胞レベルで完了する必要があります。しかし、ここで紹介する基本的な技術が習得されれば、一つは他の方法を用いて答えることができる仮説をテストするための実験の固有のセットを実行することができます。
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Disclosures
動物のすべての実験手順は、ノースカロライナ大学の動物実験使用の委員会によって承認された。
Acknowledgments
この作品は、MDにNIHの助成金NS042197によってサポートされていました。 AJKは、助成金T32GM008719とF30NS068006によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
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