Summary
في هذا البروتوكول ، ونحن تصف microinjection مباشرة من هيولي السيتوكروم
Abstract
موت الخلايا المبرمج ، أو موت الخلية المبرمج ، هو مسار الحفظ ودرجة عالية من التنظيم من قبل الخلايا التي تموت 1. يمكن أن تسبب موت الخلايا المبرمج عندما تصادف خلايا طائفة واسعة من الضغوط السامة للخلايا. هذه الإهانات بدء شلالات الإشارات التي تسبب في نهاية المطاف اطلاق سراح ج السيتوكروم من مساحة intermembrane الميتوكوندريا إلى السيتوبلازم 2. إطلاق سراح ج السيتوكروم من الميتوكوندريا هي الحدث الرئيسي الذي يقوم بتشغيل التنشيط السريع للcaspases ، والبروتياز الرئيسية الخلوية التي تنفذ في نهاية المطاف موت الخلية 3-4.
وينظم المسار من موت الخلايا المبرمج في نقاط المنبع والمصب للإفراج ج السيتوكروم من الميتوكوندريا 5. من أجل دراسة اللائحة بعد الميتوكوندريا تفعيل caspase ، تحولت العديد من المحققين إلى microinjection هيولي مباشرة holocytochrome ج (الهيم المرفقة) البروتين في الخلايا 6-9. عادة يكون موضعيا ج السيتوكروم إلى الميتوكوندريا حيث تعلق مجموعة الهيم هو ضروري لتمكينها من تنشيط الخلايا 10-11. لذلك ، لتنشيط caspases مباشرة ، فمن الضروري لحقن البروتين ج holocytochrome بدلا من [كدنا] ، وذلك لأن في حين أن التعبير عن السيتوكروم ج من يبني [كدنا] سيؤدي في استهداف الميتوكوندريا والتعلق الهيم ، وسيتم عزلها فإنه من caspases عصاري خلوي. وبالتالي ، فإن microinjection المباشر عصاري خلوي من الهيم المرفقة تنقية البروتين ج السيتوكروم هو أداة مفيدة لتقليد الميتوكوندريا الافراج ج السيتوكروم وموت الخلايا المبرمج من دون استخدام الشتائم السامة التي تسبب تلف الخلايا والميتوكوندريا.
في هذه المقالة ، نحن تصف طريقة لmicroinjection ج السيتوكروم من البروتين في الخلايا ، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) والخلايا العصبية المتعاطفة الابتدائية ، والأمثلة على ذلك. في حين يركز هذا البروتوكول على حقن ج السيتوكروم من أجل التحقيق في موت الخلايا المبرمج ، ويمكن أيضا التقنيات المعروضة هنا يمكن تكييفها بسهولة للmicroinjection من البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.
Protocol
1. إنتاج إبر Microinjection
- الإبر microinjection الجاهزة متوفرة تجاريا (على سبيل المثال. Femtotips من إيبندورف) ومفيدة إذا كان أحد لا يؤدي عدد كبير من microinjections. ومع ذلك ، بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في اقامة علاقات طويلة الاجل لقدرات microinjecting ، بديلا هو إنتاج الإبر microinjection في المختبر باستخدام رقيقة الجدار البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية ومجتذب إبرة التجارية. كما يسمح هذا الشكل من الإبر لتكون متنوعة ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لأنواع مختلفة من الخلايا.
- مع الإبرة Narishige بولير PC - 10 Microinjection ، إرفاق جميع الاوزان الاربعة واستخدام برنامج خطوة واحدة في سحب (الخطوة 1 الإعداد) مع إعداد الحرارة النسبية 58.0 في (NO.2 سخان). تأكد من وضع عنصر التدفئة في مركز كل الشعرية بحيث الإبر ، الذي أسفر هي مدة مماثلة.
- سحب عدة الشعيرات الدموية (حوالي 2 الشعيرات الدموية لكل من البروتين الفائدة).
- الإبر تخزينها في حاوية في حين يجري التأكد من عدم الاضرار طرف الإبرة. ويمكن استخدام مواد مثل رغوة أو بلو المسمار في حاويات لعقد الإبر microinjection.
2. إعداد خلطات للحقن البروتين
- تعد منطقة عازلة microinjection 10X يحتوي على 1 كلوريد البوتاسيوم و 0.1 M فوسفات البوتاسيوم M (KPI) العازلة (خليط متساوي المولية من K 2 هبو 4 و KH 2 PO 4) في درجة حموضة 7.4. ويمكن تخزين هذا المخزن المؤقت طويل الأمد في درجة حرارة الغرفة.
- لتصور الحقن ، وصبغة الفلورسنت مثل رودامين - ديكستران يحتاج إلى إضافته. تمييع the10x العازلة microinjection تذوب في الماء ورودامين - ديكستران مسحوق لجعل منطقة عازلة microinjection 5X محلول يحتوي على 20-40 ملغ / مل رودامين ديكستران.
- تخزين هذا الحل في الظلام في 4 درجات مئوية. ينبغي أن يكون كافيا ليصل الى 100 فرد الاستعدادات حل البروتين. يمكن الأصباغ الأخرى ، مثل ديكستران ثيوسيانات - فلوريسئين بديل.
- ج إعداد السيتوكروم الأسهم عن طريق إذابة السيتوكروم ج تنقية المياه في لتركيز 20 ملغ / مل. ج السيتوكروم في مخزن -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل وتجنب تخزين تجميد أذاب دورات عن طريق تخزين ج السيتوكروم في aliquots (~ 10 ميكرولتر) الصغيرة.
- إعداد خليط من البروتين 10 ميكرولتر للحقن عن طريق الجمع بين 2 ميكرولتر microinjection العازلة التي تحتوي على رودامين - 5X ديكستران المياه مع 3 و 5 ميكرولتر ج السيتوكروم ميكرولتر لتركيز النهائي من 10 ج السيتوكروم ملغ / مل في 1X العازلة (100 ملي بوكل ، 10 ملي KP ط ، 4-8 ملغ / مل رودامين ديكستران).
3. هيولي من Microinjection ج السيتوكروم
- قبيل microinjection ، خليط من أجهزة الطرد المركزي ج السيتوكروم والعازلة في microinjection ز 16000 لمدة 10 دقائق على 4 درجات مئوية في فصل أي الجسيمات التي قد تسد microinjection الإبر.
- أثناء الطرد المركزي ، بدوره على microinjector للسماح لبناء ضغط الهواء.
- وضع طبق من الخلايا في وسط مرحلة المجهر وتعيين التركيز على الخلايا. لتقليل كمية الوقت الذي يتم الاحتفاظ الخلايا خارج الحاضنة ، يتم إرجاع عادة الخلايا الحاضنة في غضون 30 دقيقة.
- ماصة 0،5-1 ميكرولتر من السطح العلوي من خليط من البروتين في نهاية حادة من الشعيرات الدموية. كن حذرا حتى لا ماصة أي الجزيئات التي تم طرد إلى أسفل الأنبوب. في غضون دقيقة ، سيتم توزيعها على خليط من البروتين طرف الإبرة من خلال العمل الشعري.
- إرفاق الإبرة بقوة لصاحب الشعرية من micromanipulator ووضع الإبرة حتى طرفها يمر الضوء ينتقل من المجهر على ما يقرب من زاوية 45 درجة.
- ضبط الموقف من طرف الإبرة بحيث أنه يقع مباشرة في مركز مجال الرؤية. إلى مركز الإبرة ، استخدم micromanipulator للتحرك الإبرة ، بينما يبحث من خلال العدسة المجهر. يجب أن تكون مرئية الظل الإبرة. ضبط الإبرة بحيث يتم النظر فقط في ظله نصف مجال الرؤية ، مشيرا الى انه يتم توسيط طرف إبرة فوق الخلايا.
- تعيين microinjector إلى وضع التدفق المستمر وتعيين ضغط العمل ل2-10 هكتوبسكال. قد تتطلب كل إبرة ضغط العمل المختلفة ، وضغط العمل وسوف يحتاج على الارجح خلال التكيف الداخلي microinjection للحفاظ على تدفق مستمر.
- انخفاض الإبرة باستخدام مقبض الخشنة إلى موضع تماما فوق الخلايا. للقيام بذلك ، ورفع مستوى التنسيق في مجهر إلى موضع تماما فوق الخلايا. ثم أقل الإبرة نحو الخلايا باستخدام مقبض الخشنة حتى غيض إبرة في التركيز.
- إعادة مركز رأس الإبرة داخل مجال الرؤية وزيادة التكبير عن طريق تغيير الهدف المجهر.
- انخفاض ببطء الإبرة باستخدام مقبض تتلاعب غرامة untiل الإبرة فقط أعلى قليلا من المستوى البؤري للخلايا.
- التحقق من تدفق خليط من البروتين من خلال النظر في مضان أحمر رودامين. وينبغي أن يكون البروتين المخلوط تخرج الإبرة كما دفق ، رقيقة ثابتة. يجب أن يتم استبدال الإبر وإعادة تحميلها في حالة خطر الإبرة أو إذا كان تدفق بعيدة قوية جدا في بعض الأحيان ، يتم إغلاق غيض من الزجاج الشعرية ويعتبر أي تدفق من الإبرة. إذا كان هذا يحدث ، استبدل الإبرة أو أقل بعناية إلى أسفل الطبق الثقافة لتمزق بلطف غيض من الإبرة.
- موقف طرف الإبرة بحيث يكون لافتا نحو خلية تقريبا في زاوية 45 درجة. ثم مع حركة واحدة على نحو سلس ، وانخفاض الإبرة في الوقت الذي يتجه باتجاه الخلية. مع الحركة على نحو سلس الثاني ، عكس الحال في اتجاه الإبرة لإزالتها من الخلية.
- وهناك حقن الخلايا بنجاح في كثير من الأحيان تنتفخ قليلا ، ويمكن التأكد من وضع الرؤية ورودامين أحمر فلوري داخل الخلية. أحيانا ، سيتم حقن خلية بطريق الخطأ في النواة ، والتي سوف تكون مرئية.
- يواصل حقن الخلايا عن طريق ضبط مرحلة المجهر حتى يتم حقن الخلايا عن 50-100. عند الانتقال من مرحلة المجهر ، يجب التأكد من رفع إبرة microinjection بحيث يزيل الجزء العلوي من الخلايا.
4. ممثل النتائج :
وmicroinjection هيولي من يقلد ج السيتوكروم من الميتوكوندريا صدوره خلال موت الخلايا المبرمج. وهكذا ، كما هو متوقع ، سريعا الخلايا الليفية على الخضوع microinjection عصاري خلوي من الأبقار السيتوكروم ج (الشكل 1A). لضمان إجراء الحقن وحدها ليست مسؤولة عن موت الخلايا ، وحقن من الخميرة السيتوكروم ج بمثابة السيطرة مهم ، لأن الخميرة السيتوكروم ج غير قادر على تفعيل caspases 12.
ومن المثير للاهتمام ، بعد الإنقسامية الخلايا العصبية المتعاطفة تقاوم بشكل ملحوظ لعصاري خلوي السيتوكروم ج (الشكل 1B) 8،13. وقد حددت مختبرنا أن المانع caspase الذاتية XIAP هو المانع الرئيسي للتنشيط الخلايا العصبية في caspase 14. وهكذا ، على الخلايا العصبية ليموت بعد الحقن ج السيتوكروم ، يجب XIAP بهذا يصبح المعطل. على سبيل المثال ، من microinjection ج السيتوكروم في xiap -- / -- الخلايا العصبية المتعاطفة غير كافية للسماح تنشيط caspase وموت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا (الشكل 2).
الشكل 1. microinjection هيولي من السيتوكروم ج يدفع الموت السريع في الخلايا الليفية ، ولكن ليس الخلايا العصبية. أ) من النوع البري MEFs أو (B) وبعدها يوم 5 microinjected البرية من نوع الخلايا العصبية المتعاطفة مع الأبقار السيتوكروم ج (10 ملغ / مل) مع رودامين - ديكستران بمناسبة حقن الخلايا. تظهر الصور في نفس الحقل على الفور من حقن الخلايا التالية (0 ساعة) ، أو في الأوقات المحددة. الأسهم تشير إلى حقن الخلايا. مقياس بار ، و 20 ميكرومتر.
الشكل 2. XIAP التي تعاني من نقص الخلايا العصبية تكون عرضة للحشوية microinjection السيتوكروم ج. وبعدها microinjected يوم 5 الخلايا العصبية من المتعاطفين مع الفئران خروج المغلوب XIAP البقري السيتوكروم ج (10 ملغ / مل) مع رودامين - ديكستران بمناسبة حقن الخلايا. تظهر الصور في نفس الحقل على الفور من حقن الخلايا التالية (0 ساعة) ، أو 5 ساعات بعد microinjection ج السيتوكروم (5 ساعة). مقياس بار ، و 20 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وmicroinjection من ج السيتوكروم مباشرة في سيتوبلازم الخلايا هي أداة فريدة وقوية والذي يسمح للدراسات من اللائحة بعد الميتوكوندريا من موت الخلايا المبرمج. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية لتفعيل المصب مباشرة لموت الخلايا المبرمج من الميتوكوندريا من دون استخدام العوامل التي تسبب تلف الخلايا أو الميتوكوندريا.
في حين أن هذا البروتوكول قد ركزت على microinjection من ج السيتوكروم لإجراء دراسات عن الخلايا ، ويمكن أيضا للمبادئ العامة للmicroinjection البروتين هو موضح هنا يمكن استخدام البروتينات لغيرها من المصالح. على سبيل المثال ، استخدمت بعض المحققين microinjection من الأجسام المضادة التي تستهدف بروتينات بعينها ، مثل السيتوكروم ج ج يونيو أو في دراسات الخلايا 13،15.
صعوبة الأكثر شيوعا خلال microinjection هو انسداد الإبر microinjection أثناء العملية. إذا كان انسداد الإبرة ، يمكن للمرء استخدام "نظيف" وظيفة على microinjector الذي يرسل نبضة ضغوط قوية من خلال إبرة لطرد الجسيمات عرقلة افتتاح الإبرة. في كثير من الأحيان ، وتنظيف إبرة يكفي لتنشيط الإبرة. ومع ذلك ، إذا كان ينظر صبغ تخرج الإبرة خلال "نظيفة" لكنه توقف على الفور مرة أخرى ، وهذا يشير إلى أن ضغط العمل على microinjector قد تكون منخفضة للغاية. في هذه الحالة ، وزيادة ضغط العمل حتى ينظر إلى تدفق مستمر من الإبرة مرة أخرى. تنظيف إبرة لا دائما استعادة التدفق ، وفي هذه الحالة ، لتحل محلها احتياجات إبرة الأكثر احتمالا. أسلوب واحد والتي يمكن استخدامها كبديل ، خاصة إذا كانت المواد الثمينة حقن نفسه ، ينطوي على كسر بلطف رأس الإبرة microinjection ضد الجزء السفلي من طبق نسيج الثقافة. إذا فعلت بعناية ، وهذا يمكن تكبير افتتاح الإبرة ، وسوف استعادة التدفق. ومع ذلك ، فإن وجود صدع كبير في افتتاح إبرة تسبب انبعاث كميات هائلة من صبغة في الطبق الثقافة ، متجاهلا رأي الخلايا.
للأسف ، ليست كل أنواع الخلايا قادر على ان يكون microinjected. بعض الخلايا (مثل الخلايا العصبية للدماغ حبيبة) هي صغيرة جدا بالنسبة microinjection. الخلايا الأخرى (على سبيل المثال لا أخلاقي العضلية) ، في حين يكفي كبيرة ، لا يمكن أن تصمد أمام إجراء الحقن ويموت حتى مع حقن السيطرة. كما هو موضح أعلاه ، microinjection من الخميرة السيتوكروم ج بمثابة الخميرة منذ سيطرة مفيدة السيتوكروم ج غير قادر على تنشيط caspases. وخلايا الخميرة مع microinjected السيتوكروم ج يتم تنشيط الخلايا ما لم يكن ذلك نتيجة لإجراء microinjection نفسها. أخيرا ، يمكن لبعض الخلايا (مثل الخلايا الليفية) تحمل microinjection لكن يمكن أن يكون صعبا لحقن بسبب التشكل على مسطح. نتيجة لذلك ، هناك خطر يتمثل في أن الإبرة microinjection سيحطم ضد الجزء السفلي من نسيج الثقافة الطبق مع كل خلية التي يتم ضخها.
ويمكن استخدام micromanipulators الآلي أو اليدوي لmicroinjection البروتين ، مع كل نظام وجود مزايا وعيوب. micromanipulators الآلي مريحة لأن أحد يمكن أن يحدد مستوى التصاعدي الذي هو محور خفضت تلقائيا الإبرة microinjection للخلايا عن طريق الحقن. هذا مفيد بشكل خاص عند حقن الخلايا الذي هو الارتفاع مماثلة في أنحاء خلية المونولاير الثقافة. ومع ذلك ، للخلايا التي يتم تربيتها على الأطباق المغلفة ، (مثل الخلايا العصبية مطلي على الكولاجين المغلفة الأطباق) ، وطبيعة ثلاثى الابعاد لهذه الثقافات يجعل وضع معين ض محور مستوى مملة. لهذه الثقافات ، دليل micromanipulators هي مفيدة ، حيث يمكن ضبط الإبرة بسرعة إلى ارتفاع محدد من كل خلية.
يمكن أن يكون Microinjection تقنية صعبة وتحتاج لإتقان والممارسة. بالإضافة إلى ذلك ، أسلوب microinjection بعض القيود. على سبيل المثال ، يمكن حقنه فقط نسبة صغيرة من الخلايا في نسيج الثقافة الطبق. وهكذا ، في التحضيرات الكيميائية الحيوية التي يتم جمعها ثقافة بأكملها (lysates الخلية مثلا لطخة الغربية) ليست تمثيلا دقيقا للحقن الخلايا وحدها. بدلا من ذلك ، فإن معظم التجارب التي تحتاج إلى أن تكتمل على مستوى وحيدة الخلية. ومع ذلك ، مرة واحدة ويتقن التقنيات الأساسية المعروضة هنا ، يمكن للمرء أن أداء مجموعة فريدة من التجارب لاختبار الفرضيات التي لا يمكن الإجابة باستخدام طرق أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم في جامعة ولاية كارولينا الشمالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS042197 MD. وأيد AJK من المنح وT32GM008719 F30NS068006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
