Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 시토크롬의 직접적인 세포질 microinjection을 설명
Abstract
Apoptosis 또는 프로그램된 세포 죽음은 세포가 1 죽게하는 보존과 높은 규제 경로입니다. 세포가 세포 독성 스트레스의 다양한 발생하는 경우 Apoptosis가 발생하실 수 있습니다. 이러한 모욕 궁극적으로 mitochondrial intermembrane 공간에서 세포질 2 시토크롬 C의 릴리스의 원인이 신호 폭포를 시작합니다. mitochondria에서 시토크롬 C의 릴리스는 caspases, 궁극적으로 3-4 세포 죽음을 실행할 핵심 세포 프로 테아제의 급속한 활성화를 유발하는 핵심 이벤트입니다.
apoptosis의 경로는 mitochondria 5 시토크롬 C 릴리스의 상류와 하류 지점에 규제입니다. caspase 활성화의 포스트 mitochondrial 규제를 공부하기 위해 많은 조사가 holocytochrome C (헴 연결된) 전지 6-9로 단백질의 직접적인 세포질 microinjection로 설정되어 있습니다. 시토크롬 C는 일반적으로 헴 그룹의 첨부 파일은 10-11 apoptosis 활성화하도록하는 데 필요한 어디 mitochondria에 언어입니다. 따라서 직접 caspases를 활성화하기 위해서는 cDNA 구조에서 시토크롬 C의 표현이 mitochondrial 타겟팅 및 헴 첨부집니다 동안 그것 cytosolic caspases에서 분리된 것입니다 때문에 holocytochrome C 단백질 대신 자사의 cDNA를 삽입하는 것이 필요합니다. 따라서 정화 헴 연결된 시토크롬 C 단백질의 직접 cytosolic microinjection은 셀룰러 및 mitochondrial 손상을 독성이 모욕을 사용하지 않고 mitochondrial 시토크롬 C 자료 및 apoptosis를 모방하는 유용한 도구입니다.
이 문서에서는, 우리는 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)와 예에서 볼 수 있듯이 기본 교감 신경을 사용하여 세포로 시토크롬 C 단백질의 microinjection을위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 apoptosis의 수사 시토크롬 C의 주입에 초점을 맞춘 반면, 여기에 나와있는 기술도 쉽게 관심을 다른 단백질의 microinjection에 대해 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. Microinjection 니들스 생산
- 사전 조립 microinjection의 바늘은 상업적으로 사용할 수 있습니다 (예. Eppendorf에서 Femtotips)와 하나 microinjections 많은 수의를 수행하지 않은 경우 유용합니다. 그러나, microinjecting위한 장기적인 기능을 구축하고자하는 사람들을 위해, 대안은 얇은 벽 borosilicate 유리 모세관과 상업 바늘 풀러를 사용하여 실험실에서 microinjection의 바늘을 생산하는 것입니다. 이것은 또한 다른 세포 유형에 유용할 수 있습니다 다양한하는 바늘의 모양을 수 있습니다.
- Narishige PC - 10 Microinjection 니들 풀러으로, 네 명 모두 무게를 첨부 58.0에서 상대 열을 설정 (제 2 히터)로 한 단계 당기는 프로그램 (1 단계 설정)을 사용합니다. 두 결과 바늘이 비슷한 길이 수 있도록 각각의 모세관의 중심에서 가열 요소를 배치해야합니다.
- 여러 모세관 (이자 각각의 단백질에 대한 모세 혈관 약 2) 당기세요.
- 용기에 저장 바늘 바늘 팁을 손상하지 않도록하는 동안. 이러한 거품 또는 블루 - 테크와 같은 자료는 microinjection의 바늘을 가질 용기에 사용할 수 있습니다.
2. 사출을위한 단백질 혼합물의 준비
- 7.4의 산도 1 M 염화칼륨 및 0.1 M의 칼륨 인산 (KPI) 버퍼 (K 2 HPO 4, KH 2 PO 4 몰 혼합)이있는 10X microinjection 버퍼를 준비합니다. 이 버퍼는 상온에서 장기간 저장할 수 있습니다.
- 주사를 시각화하기 위해, rhodamine - dextran 같은 형광 염료가 추가되어야합니다. 물에 the10x microinjection 버퍼를 희석하여 20-40 MG / ML rhodamine dextran를 포함하는 배 microinjection 버퍼 솔루션을 만들기 위해 rhodamine - dextran 가루를 해산.
- 4 어둠이 솔루션을 저장 ° C. 그것은 최대 100 개별 단백질 솔루션 준비에 대한 충분해야합니다. 플루오레신 isothiocyanate - dextran 같은 염료는 대체할 수 있습니다.
- 20 MG / ML의 농도로 물에 정화 시토크롬 C를 용해하여 시토크롬 C 주식을 준비합니다. -80에서 보관 시토크롬 C ° C 장기 저장 및 소형 (~ 10 μL) aliquots에서 시토크롬 C를 저장하여 냉동 해동주기를 피하기 위해.
- 1X 버퍼 (100 MM KCl, 10 MM KP 10 MG / ML 시토크롬 C의 최종 농도 3 μL 물 5 μL 시토크롬 C와 rhodamine - dextran을 포함하는 2 μL 배 microinjection 버퍼를 결합하여 사출을위한 10 μL 단백질 혼합물을 준비 I, 4-8 MG / ML rhodamine dextran).
3. 시토크롬 C의 세포질 Microinjection
- 직전 microinjection에, 4 10 분 16,000그램에서 시토크롬 C와 microinjection 버퍼의 혼합물을 원심 ° C는 microinjection의 바늘을 방해할 수있는 미립자 물질을 분리.
- 원심 분리하는 동안, 공기 압력이 건설 수 있도록 microinjector 켭니다.
- 현미경 단계의 중앙에 세포가 한 접시를 놓고 세포에 초점을 설정합니다. 세포 배양기 외부 유지되는 시간을 최소화하기 위해, 세포는 일반적으로 30 분 이내에 인큐베이터에 반환됩니다.
- 모세관의 뭉툭한 끝에 단백질 혼합물의 상단 표면에서 피펫 0.5-1 μL. 튜브의 바닥에 centrifuged되었습니다 어떠한 입자를 피펫하지 않도록주의한다. 분 이내에 단백질 혼합물은 모세관 작용을 통해 바늘 끝에 배포됩니다.
- micromanipulator과 위치의 팁 약 45 ° 각도에서 현미경으로 전송된 빛을 통과되도록 바늘의 모세관 홀더에 단단히 바늘을 연결합니다.
- 그것이보기의 필드의 중심에 바로 위치해 있도록 바늘 끝의 위치를 조정합니다. 센터 바늘을하려면, 현미경의 접안 렌즈를 통해 보면서 바늘을 이동 micromanipulator를 사용합니다. 바늘 그림자가 표시되어야합니다. 그 그림자에만 바늘 끝이 세포 위에 중심을 나타냅니다보기의 필드의 절반에서 볼되도록 바늘을 조정합니다.
- 연속 흐름 모드로 microinjector를 설정하고 20 작업 압력 설정 - 100 고전력 증폭기 있습니다. 각각의 바늘은 다른 작업 압력을 요구할 수 있으며 작동 압력 가능성이 지속적으로 흐름을 유지하기 위해 microinjection 절차 중에 조정이 필요합니다.
- 그냥 셀 위에 위치로 거친 노브를 사용하여 바늘을 낮춥니다. 이 작업을 수행하려면 셀 위에 위치로 현미경의 초점 비행기를 올립니다. 바늘 끝 초점 때까지 다음 굵은 손잡이를 사용하여 세포를 향해 바늘을 낮추십시오.
- 다시 중심 바늘보기 분야 내에서 팁 및 현미경의 목적을 변경하여 배율을 향상시킬 수 있습니다.
- 천천히 잘 속이는 사람 노프 unti를 사용하여 바늘을 낮출리터 바늘은 약간 세포의 초점 평면 위에있다.
- rhodamine의 붉은 형광을보고하여 단백질 혼합물의 흐름을 확인합니다. 단백질 혼합물은 얇고, 지속적인 스트림으로 바늘을 종료해야합니다. 바늘 교체와 바늘이 손상된 경우 다시로드하거나, 흐름이 너무 강한 경우.되어야합니다 때로는 모세관 유리의 끝 부분이 폐쇄되고 어떤 흐름은 바늘에서 본 적이 있습니다. 이 경우 바늘을 교체하거나 조심스럽게 부드럽게 파열 바늘의 팁을에 문화 접시의 바닥에 그것을 낮추십시오.
- 그것이 약 45 ° 각도로 세포쪽으로 향하고있다 있도록 바늘 끝을 위치. 세포쪽으로 이동하면서 다음 단칼에, 바늘을 낮추십시오. 두 번째 부드러운 모션과 함께, 즉시 세포에서 제거하기 위해 바늘의 방향을 반대로.
- 성공적으로 주입 세포는 종종 약간 팽창하고 세포 내에 붉은 형광 rhodamine를 시각화하여 확인하실 수 있습니다. 때때로, 세포가 실수로 표시됩니다 핵에 주입됩니다.
- 약 50-100 세포 주입 때까지 현미경의 단계를 조정하여 세포를 주입하기 위해 계속합니다. 현미경 스테이지를 이동하면, 그것이 세포의 상단을 지우는 있도록 microinjection 바늘을 제기해야합니다.
4. 대표 결과 :
시토크롬 C의 세포질 microinjection은 apoptosis 동안 mitochondria에서 출시된을 모방한 것이었 지요. 따라서, 예상대로, 섬유아 세포는 빠른 속도로 소 시토크롬 C (그림 1A)의 cytosolic microinjection에 apoptosis을 받고있다. 효모 시토크롬 C가 caspases 12 활성화의 능력이 있기 때문에 혼자 사출 절차 세포 죽음에 책임이 아니라는 것을 확인하려면, 효모 시토크롬 C의 주입은 중요한 조절 역할을합니다.
흥미롭게도, 사후 mitotic 교감 신경은 cytosolic 시토크롬 C (그림의 1B) 8,13 상당히 강한 있습니다. 우리 연구실은 내생 caspase 억제제의 XIAP는 뉴런 14 caspase 활성화의 핵심 억제제는 것을 확인했습니다. 따라서, 시토크롬 C 사출 다음 죽을 뉴런에, XIAP 먼저 inactivated가되어야합니다. 예를 들어, xiap에 시토크롬 C의 microinjection - / - 교감 신경이 세포에서 caspase 활성화 및 apoptosis (그림 2) 수 있도록 충분합니다.
그림 1. 시토크롬 C의 세포질 microinjection은 뉴런을 섬유아 세포에 신속하게 죽음을 유도하지만, 아닙니다. A) 와일드 타입 MEFs 또는 (B) 출생 후의 일 5 야생 형 교감 신경은 주입 세포를 표시하는 rhodamine - dextran과 함께 소 시토크롬 C (10 MG / ML)로 microinjected되었습니다. 이미지는 같은 셀 즉시 다음과 같은 사출 (0 HR) 분야, 또는 지정된 시간을 보여줍니다. 화살표가 주입된 세포를 나타냅니다. 스케일 바, 20 μm의.
그림 2. XIAP - 결함 뉴런은 세포질 시토크롬 C의 microinjection에 감염될 수 있습니다. XIAP 녹아웃 마우스에서 출생 후의 5 일 동정 뉴런은 세포를 주입 표시 rhodamine - dextran과 함께 소 시토크롬 C (10 MG / ML)로 microinjected되었습니다. 이미지는 같은 셀 즉시 다음과 사출 분야 (0 HR) 또는 시토크롬 C의 microinjection 후 5 시간 (5 시간)를 보여줍니다. 스케일 바, 20 μm의.
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Discussion
직접 세포의 세포질에 시토크롬 C의 microinjection은 apoptosis의 포스트 mitochondrial 규제 연구 수있는 독특하고 강력한 도구입니다. 중요한 것은,이 기술은 셀룰러 또는 mitochondrial 손상을 에이전트를 사용하지 않고 mitochondria의 apoptosis 하류의 직접적인 활성화를 위해 수 있습니다.
이 프로토콜은 apoptosis에 대한 연구 시토크롬 C의 microinjection에 초점을 맞춘 반면, 여기에 표시된 단백질 microinjection의 일반적인 원칙은 관심을 다른 단백질에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 조사는 apoptosis 13,15 연구에서 시토크롬 C 또는 C - Jun 같은 특정 단백질을 표적 항체의 microinjection을 사용했습니다.
microinjection 중 가장 일반적인 어려움이 절차를 수행하는 동안 microinjection의 바늘의 막히는입니다. 바늘이 막힌되면, 하나는 바늘을 여는를 차단 입자를 추방하기 위해 주사 바늘을 통해 강한 압력 펄스를 보내는 microinjector에서 "깨끗한"기능을 사용할 수 있습니다. 때때로 바늘을 청소하면 바늘을 unclog에 충분하다. 염료가 '깨끗한'동안 바늘을 종료 본적이 있지만 다시 바로 중지하는 경우 그러나, 이것은 microinjector의 작업 압력이 너무 낮은 수 있음을 나타냅니다. 바늘의 지속적인 흐름을 다시 볼 때까지이 경우에는 작동 압력을 증가. 바늘을 청소하는 것은 항상 바늘 가능성이 가장 높은 요구를 교체하는 경우에는 흐름을 복원하지 않습니다. 대안으로 사용할 수있는 하나의 기술, 사출 재료 자체가 소중합니다 특히, 부드럽게 조직 문화 접시의 바닥에 대한 microinjection 바늘 끝을 깨는 포함됩니다. 신중하게 할 경우,이 바늘의 개통을 확대하고 흐름을 복원합니다. 그러나 바늘 개방에 큰 균열이 세포의 전망을 왜곡, 문화 요리에 염료의 대규모 릴리스의 원인이됩니다.
불행히도, 모든 세포 유형 microinjected되고 수 있습니다. 일부 세포 (예 : 소뇌 과립 뉴런) microinjection을 위해 너무 작은 수 있습니다. 기타 전지 (예 : 성인 cardiomyocytes), 대형 충분한 반면, 사출 절차를 견딜 수 및 제어 주사와도 죽어. 효모 시토크롬 C가 caspases를 활성화 수 있기 때문에 위에서 설명한 바와 같이, 효모 시토크롬 C의 microinjection는 유용한 컨트롤 역할을합니다. 그것이 microinjection 절차 자체에 의한되지 않는 효모 시토크롬 C와 microinjected 세포가 apoptosis를 활성화하지 않습니다. 마지막으로, 일부 세포 (예 : 섬유아 세포) microinjection을 견딜 수 있지만 있기 때문에 자신의 평면 형태의 주입하기 어려울 수 있습니다. 그 결과, microinjection 니들은 분사 각 세포와 조직 문화 접시의 바닥에 대한 휴식 것이라는 위험이 있습니다.
자동 또는 수동 micromanipulators는 장점과 단점을 가지고 각각의 시스템, 단백질 microinjection을 위해 사용될 수 있습니다. 하나가 microinjection 바늘이 자동으로 주입 전지 저하입니다 Z 축 레벨을 설정할 수 있기 때문에 자동 micromanipulators이 편리합니다. 누구의 높이 세포 배양 monolayer에 걸쳐 유사합니다 세포를 주입 때 특히 유용합니다. 그러나, 코팅 요리 양식 아르 셀 (예 : 뉴런은 콜라겐 - 코팅 요리 도금)에 대한 이러한 문화의 입체 자연 지루한 특정 Z - 축 레벨을 설정합니다. 바늘이 빠르게 각 세포의 특정 높이로 조절할 수 있으므로 이러한 문화, 수동 micromanipulators이 유리한 있습니다.
Microinjection 연습을 마스터하고 있어야합니다 어려운 기술 수 있습니다. 또한, microinjection의 기술은 몇 가지 제약 사항들이있다. 예를 들어, 조직 문화 접시에있는 세포의 극소수가 주입 수 있습니다. 따라서, 모든 문화가 수집되는 생화학 준비가 (서양 얼룩 예 : 세포 lysates)만을 주입 세포의 정확한 표현되지 않습니다. 대신, 대부분의 실험은 단일 세포 수준에서 완료해야합니다. 그러나, 일단 여기에 제시된 기본적인 기술을 마스터 있으며, 하나는 다른 방법을 사용하여 답변 수없는 가설을 테스트하는 실험의 독특한 설정을 수행할 수 있습니다.
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Disclosures
동물의 모든 실험 절차는 노스캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
이 작품은 MD에 NIH 부여 NS042197에 의해 지원되었다. AJK는 보조금 T32GM008719와 F30NS068006 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
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