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Biology

Apoptosis साइटोक्रोम के cytoplasmic Microinjection द्वारा सक्रियकरणdoi: 10.3791/2773 Published: June 29, 2011

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम साइटोक्रोम के प्रत्यक्ष cytoplasmic microinjection वर्णन

Abstract

Apoptosis, या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु, एक संरक्षित और उच्च विनियमित मार्ग है जिसके द्वारा कोशिकाओं मर जाते हैं 1. Apoptosis जब कोशिकाओं साइटोटोक्सिक तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला का सामना करने के लिए ट्रिगर किया जा सकता है. ये अपमान cascades संकेत है कि अंततः साइटोक्रोम के mitochondrial intermembrane अंतरिक्ष से 2 cytoplasm के लिए रिहाई के कारण आरंभ करें. mitochondria से साइटोक्रोम की रिहाई एक महत्वपूर्ण घटना है कि caspases, कुंजी सेलुलर proteases जो अंततः कोशिका मृत्यु 3-4 निष्पादित की तेजी सक्रियण चलाता है.

apoptosis के मार्ग 5 mitochondria से साइटोक्रोम रिलीज के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम बिंदुओं पर विनियमित है. आदेश में बाद mitochondrial कस्पासे सक्रियण के नियमन का अध्ययन करने के लिए, कई जांचकर्ताओं holocytochrome (heme संलग्न) 6-9 कोशिकाओं में प्रोटीन ग के प्रत्यक्ष cytoplasmic microinjection में बदल गया है. साइटोक्रोम सामान्य mitochondria जहां एक heme समूह के अनुलग्नक यह 10-11 apoptosis को सक्रिय करने के लिए सक्षम करने के लिए आवश्यक है के लिए स्थानीयकृत है. इसलिए, सीधे caspases को सक्रिय करने के लिए, यह आवश्यक है holocytochrome के बजाय अपने सीडीएनए प्रोटीन इंजेक्षन, क्योंकि जबकि सीडीएनए constructs से साइटोक्रोम की अभिव्यक्ति mitochondrial लक्ष्यीकरण और heme अनुलग्नक में परिणाम देगा, यह साइटोसोलिक caspases से तनहा हो जाएगा. इस प्रकार, शुद्ध heme संलग्न साइटोक्रोम प्रोटीन के प्रत्यक्ष साइटोसोलिक microinjection विषाक्त अपमान जो सेलुलर और mitochondrial क्षति के कारण के उपयोग के बिना mitochondrial साइटोक्रोम ग रिलीज और apoptosis की नकल के लिए एक उपयोगी उपकरण है.

इस अनुच्छेद में, हम कोशिकाओं में साइटोक्रोम प्रोटीन की microinjection के लिए एक विधि का वर्णन, माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts और उदाहरण के रूप में प्राथमिक सहानुभूति न्यूरॉन्स का उपयोग. हालांकि यह प्रोटोकॉल apoptosis की जांच के लिए साइटोक्रोम ग के इंजेक्शन पर केंद्रित है, यहाँ दिखाया तकनीक भी ब्याज की अन्य प्रोटीन की microinjection के लिए आसानी से कर सकते हैं अनुकूलित किया जा.

Protocol

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1. Microinjection सुइयों के उत्पादन

  1. पूर्व गढ़े microinjection सुइयों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (जैसे Eppendorf से Femtotips) और उपयोगी होते हैं अगर एक microinjections की एक बड़ी संख्या में प्रदर्शन नहीं कर रहा है . हालांकि, जो microinjecting के लिए लंबी अवधि क्षमताओं की स्थापना चाहते हैं के लिए, एक वैकल्पिक करने के लिए पतली दीवार borosilicate ग्लास capillaries और एक वाणिज्यिक सुई खींचने का उपयोग कर प्रयोगशाला में microinjection सुइयों का उत्पादन है. यह भी सुइयों के आकार को अलग किया जा है, जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपयोगी हो सकता है की अनुमति देता है.
  2. Narishige PC-10 Microinjection सुई खींचने के साथ, सभी चार वजन देते हैं और 58.0 पर रिश्तेदार गर्मी सेटिंग (सं. 2 हीटर) के साथ एक कदम खींच प्रोग्राम (चरण 1 सेटिंग) का उपयोग करें. प्रत्येक केशिका के केंद्र में हीटिंग तत्व इतनी जगह है कि दो परिणामस्वरूप सुइयों एक समान लंबाई कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  3. कई capillaries (2 ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए के बारे में capillaries) खींचो.
  4. एक कंटेनर में स्टोर सुई सुई टिप नुकसान नहीं करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है जबकि. फोम या Blu-हमले जैसे माल कंटेनरों में इस्तेमाल किया जा सकता है microinjection सुइयों पकड़.

2. इंजेक्शन के लिए प्रोटीन मिश्रण की तैयारी

  1. एक 10x microinjection 7.4 के पीएच पर 1 एम पोटेशियम क्लोराइड और 0.1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (KPI) बफर (K-2 4 HPO और 2 के.एच. पीओ 4 equimolar मिश्रण) युक्त बफर तैयार करें . इस बफर कमरे के तापमान पर लंबे समय तक संग्रहीत कर सकते हैं.
  2. इंजेक्शन कल्पना करने के लिए, rhodamine-dextran तरह एक फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. पानी में the10x microinjection बफर पतला और एक 5x microinjection बफर 20-40 मिलीग्राम / एमएल rhodamine dextran समाधान युक्त बनाने के लिए rhodamine-dextran पाउडर भंग करने के लिए.
  3. अंधेरे में 4 पर इस समाधान स्टोर डिग्री सेल्सियस यह व्यक्ति को 100 प्रोटीन समाधान की तैयारी के लिए पर्याप्त होना चाहिए. Fluorescein-आइसोथियोसाइनेट dextran जैसे अन्य रंजक, स्थानापन्न कर सकते हैं.
  4. पानी में शुद्ध साइटोक्रोम 20 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता भंग करके साइटोक्रोम शेयरों को तैयार है . स्टोर साइटोक्रोम -80 पर डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के भंडारण और छोटे aliquots (~ 10 μL) में साइटोक्रोम भंडारण के द्वारा फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के लिए .
  5. इंजेक्शन के लिए 2 μL 5x microinjection 3 μL पानी और 5 μL साइटोक्रोम के साथ 1x बफर (100 मिमी KCl, 10 मिमी के.पी. में 10 मिलीग्राम / एमएल साइटोक्रोम ग के अंतिम एकाग्रता के लिए rhodamine-dextran युक्त बफर के संयोजन के द्वारा एक 10 μL प्रोटीन मिश्रण तैयार मैं, 4-8 मिलीग्राम / एमएल rhodamine dextran).

3. साइटोक्रोम सी की cytoplasmic Microinjection

  1. Microinjection के लिए पहले, 16,000 जी में 4 बजे 10 मिनट के लिए साइटोक्रोम और microinjection बफर के मिश्रण अपकेंद्रित्र ° सी जो microinjection सुइयों को रोकना कर सकते हैं किसी भी बात कण अलग करने के लिए.
  2. Centrifugation के दौरान, microinjector पर बारी करने के लिए हवा के दबाव का निर्माण करने की अनुमति.
  3. खुर्दबीन मंच के केंद्र पर कक्षों की एक डिश प्लेस और कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित सेट. इनक्यूबेटर कि कोशिकाओं के बाहर रखा जाता है समय की राशि को कम करने के लिए, कोशिकाओं आम तौर पर 30 मिनट के भीतर कर रहे हैं इनक्यूबेटर करने के लिए लौट.
  4. पिपेट केशिका की कुंद अंत में प्रोटीन मिश्रण के ऊपर की सतह से 0.5-1 μL. किसी भी कणों जो ट्यूब के नीचे करने के लिए किया गया centrifuged है विंदुक नहीं सावधान रहो. एक मिनट के भीतर, प्रोटीन मिश्रण केशिका क्रिया के माध्यम से सुई टिप करने के लिए वितरित करेंगे.
  5. सुई मजबूती संलग्न micromanipulator और स्थिति सुई ताकि इसकी टिप लगभग एक कोण 45 ° माइक्रोस्कोप के प्रेषित प्रकाश के माध्यम से गुजरता की केशिका धारक के लिए.
  6. इतना है कि यह सीधे देखने के क्षेत्र के केंद्र में स्थित है सुई की नोक की स्थिति को समायोजित करें. सुई केंद्र micromanipulator का उपयोग करने के लिए सुई चाल जबकि माइक्रोस्कोप ऐपिस के माध्यम से देख. सुई छाया दिखाई जानी चाहिए. सुई समायोजित इतना है कि अपनी छाया केवल देखने के क्षेत्र के एक आधा में देखा जाता है, यह दर्शाता है कि सुई टिप कोशिकाओं के ऊपर केन्द्रित है.
  7. सतत प्रवाह मोड microinjector सेट और काम कर रहे 20 से दबाव सेट - 100 एचपीए. प्रत्येक सुई एक अलग काम के दबाव की आवश्यकता होती है सकते हैं, और काम के दबाव की संभावना microinjection प्रक्रिया के दौरान समायोजन की जरूरत है एक सतत प्रवाह बनाए रखना होगा.
  8. लोअर सुई कोशिकाओं से ऊपर सिर्फ एक स्थिति के लिए मोटे घुंडी का उपयोग. ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं से ऊपर सिर्फ एक स्थिति को खुर्दबीन के फोकल हवाई जहाज़ बढ़ा. तो मोटे कोशिकाओं का उपयोग कर घुंडी की ओर सुई कम जब तक सुई टिप ध्यान में है.
  9. पुन: देखने के क्षेत्र के भीतर केंद्र सुई टिप और खुर्दबीन उद्देश्य बदलकर बढ़ाई वृद्धि.
  10. धीरे धीरे ठीक जोड़तोड़ घुंडी unti का उपयोग कर सुई कमएल सुई बस कोशिकाओं के फोकल हवाई जहाज़ से थोड़ा ऊपर है.
  11. Rhodamine की लाल प्रतिदीप्ति देखकर प्रोटीन मिश्रण के प्रवाह की जाँच करें. प्रोटीन मिश्रण एक पतली, निरंतर प्रवाह के रूप में सुई बाहर निकलने चाहिए. सुई प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए और फिर लोड अगर सुई समझौता किया है या अगर प्रवाह दूर है भी मजबूत है. कभी कभी, केशिका कांच की नोक बंद है और कोई प्रवाह सुई से देखा जाता है. यदि ऐसा होता है, सुई की जगह या ध्यान से संस्कृति डिश के नीचे धीरे से सुई की नोक टूटना कम.
  12. सुई टिप इतना है कि यह लगभग एक 45 डिग्री कोण पर एक सेल की ओर इशारा कर रहा है स्थिति. फिर एक निर्बाध गति के साथ, सुई कम जबकि यह सेल की ओर बढ़. एक दूसरे निर्बाध गति के साथ, तुरंत यह सेल से हटाने के लिए सुई की दिशा रिवर्स.
  13. एक सेल सफलतापूर्वक इंजेक्शन अक्सर थोड़ा फूल और कक्ष के भीतर लाल फ्लोरोसेंट rhodamine visualizing द्वारा पुष्टि की जा सकती. कभी कभी, एक सेल अकस्मात नाभिक, जो दिखाई जाएगी में इंजेक्ट किया जाएगा.
  14. खुर्दबीन मंच का समायोजन जब तक के बारे में 50-100 कोशिकाओं को इंजेक्ट कर रहे हैं द्वारा कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए जारी रखें. जब खुर्दबीन मंच चलती microinjection सुई बढ़ाने के लिए इतना है कि यह कोशिकाओं के ऊपर साफ कर लें.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

साइटोक्रोम के cytoplasmic microinjection mitochondria से apoptosis के दौरान अपनी रिहाई mimics . इस प्रकार, के रूप में की उम्मीद, fibroblasts तेजी से गोजातीय साइटोक्रोम (छवि 1A) के साइटोसोलिक microinjection पर apoptosis से गुजरना . सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन अकेले प्रक्रिया कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार नहीं है, खमीर साइटोक्रोम ग के इंजेक्शन एक महत्वपूर्ण नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, क्योंकि खमीर साइटोक्रोम ग 12 caspases को सक्रिय करने में असमर्थ है.

दिलचस्प है, के बाद mitotic सहानुभूति न्यूरॉन्स उल्लेखनीय साइटोसोलिक साइटोक्रोम 8,13 (छवि 1B) के लिए प्रतिरोधी रहे हैं . हमारी प्रयोगशाला की पहचान की है कि अंतर्जात कस्पासे अवरोध करनेवाला XIAP 14 न्यूरॉन्स में कस्पासे सक्रियण के एक प्रमुख अवरोध करनेवाला है. इस प्रकार, न्यूरॉन्स साइटोक्रोम ग इंजेक्शन निम्नलिखित मरने के लिए, XIAP पहली बार निष्क्रिय हो जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, साइटोक्रोम xiap में microinjection - / - सहानुभूति न्यूरॉन्स कस्पासे सक्रियण और इन कोशिकाओं में apoptosis (छवि 2) की अनुमति के लिए पर्याप्त है.

चित्रा 1
चित्रा 1. साइटोक्रोम के cytoplasmic microinjection fibroblasts में तेजी से मौत लाती है, लेकिन नहीं न्यूरॉन्स. ए) जंगली प्रकार MEFs या (बी) प्रसवोत्तर दिन 5 जंगली प्रकार सहानुभूति न्यूरॉन्स गोजातीय साइटोक्रोम (10 मिलीग्राम / एमएल) rhodamine इंजेक्शन कोशिकाओं निशान - dextran के साथ साथ ग के साथ microinjected थे. छवियाँ कोशिकाओं तुरंत निम्नलिखित इंजेक्शन (0 घंटा) के एक ही क्षेत्र है, या संकेत समय पर दिखाते हैं. तीर इंजेक्शन कोशिकाओं से संकेत मिलता है. स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 2
चित्रा 2. XIAP की कमी न्यूरॉन्स cytoplasmic साइटोक्रोम microinjection के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. XIAP पीटा चूहों से प्रसवोत्तर दिन 5 सहानुभूति न्यूरॉन्स गोजातीय साइटोक्रोम (10 मिलीग्राम / एमएल) rhodamine इंजेक्शन कोशिकाओं निशान - dextran के साथ साथ ग के साथ microinjected थे. छवियाँ कोशिकाओं तुरंत निम्नलिखित इंजेक्शन के समान फ़ील्ड (0 घंटा), या साइटोक्रोम microinjection के बाद 5 घंटे (5 घंटा) दिखाते हैं. स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी.

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Discussion

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कोशिकाओं के cytoplasm में सीधे साइटोक्रोम के microinjection एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण है जो apoptosis के बाद mitochondrial विनियमन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक mitochondria की apoptosis बहाव के एजेंटों जो सेलुलर या mitochondrial क्षति के कारण के उपयोग के बिना सीधे सक्रियण के लिए अनुमति देता है.

इस प्रोटोकॉल साइटोक्रोम apoptosis पर अध्ययन के लिए microinjection पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि प्रोटीन यहाँ दिखाया microinjection के सामान्य सिद्धांतों भी ब्याज की अन्य प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, कुछ जांचकर्ताओं एंटीबॉडी कि साइटोक्रोम या ग 13,15 apoptosis के अध्ययन में जून के रूप में विशिष्ट प्रोटीन, लक्ष्य की microinjection का इस्तेमाल किया है .

microinjection के दौरान सबसे आम कठिनाई प्रक्रिया के दौरान microinjection सुइयों के clogging है. यदि सुई भरा हो जाता है, एक microinjector पर "स्वच्छ" समारोह है जो सुई के माध्यम से एक मजबूत दबाव पल्स भेजता सुई खोलने अवरुद्ध कणों को निष्कासित करने का उपयोग कर सकते हैं. बार बार, सफाई सुई सुई unclog करने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, अगर डाई एक "साफ" के दौरान सुई बाहर निकलने में देखा जाता है, लेकिन तुरंत फिर से बंद हो जाता है, यह इंगित करता है कि microinjector पर काम के दबाव भी कम हो सकता है. इस मामले में, काम के दबाव में वृद्धि जब तक सुई से एक सतत प्रवाह फिर से देखा जाता है. सुई क्लीनिंग हमेशा प्रवाह बहाल नहीं करता है, जो मामले में सबसे अधिक संभावना सुई की जरूरत को बदला जाएगा. एक तकनीक है जो एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर अगर इंजेक्शन सामग्री ही कीमती है, धीरे से टिशू कल्चर डिश के नीचे के खिलाफ microinjection सुई की नोक टूट शामिल है. यदि सावधानी से किया है, इस सुई के उद्घाटन के विस्तार और के प्रवाह को बहाल करेंगे कर सकते हैं. हालांकि, सुई खोलने में एक बड़ी दरार संस्कृति डिश में एक डाई के बड़े पैमाने पर रिलीज कारण, कोशिकाओं के देखने obscuring.

दुर्भाग्य से, नहीं सभी सेल प्रकार किया जा रहा microinjected में सक्षम हैं. कुछ कक्षों में (उदाहरण के अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स) microinjection के लिए बहुत छोटे हैं. अन्य (जैसे वयस्क cardiomyocytes) कोशिकाओं, जबकि बड़ा पर्याप्त, इंजेक्शन प्रक्रिया नहीं झेलने और नियंत्रण इंजेक्शन के साथ मर भी सकते हैं. जैसा कि ऊपर वर्णित है, खमीर साइटोक्रोम ग के microinjection एक उपयोगी नियंत्रण के रूप में कार्य करता है क्योंकि खमीर साइटोक्रोम ग caspases को सक्रिय करने में असमर्थ है. खमीर साइटोक्रोम के साथ microinjected कोशिकाओं apoptosis को सक्रिय नहीं है जब तक यह microinjection प्रक्रिया ही कारण है . अंत में, कुछ कोशिकाओं (जैसे fibroblasts) microinjection झेलने लेकिन क्योंकि उनके फ्लैट आकारिकी की इंजेक्षन करने के लिए मुश्किल हो सकता है सकते हैं. एक परिणाम के रूप में, वहाँ एक जोखिम है कि microinjection सुई टिशू कल्चर डिश के नीचे के खिलाफ अंतःक्षिप्त है कि प्रत्येक कोशिका के साथ टूट जाएगा.

स्वचालित या मैनुअल micromanipulators प्रोटीन microinjection के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रत्येक फायदे और नुकसान होने प्रणाली के साथ. स्वचालित micromanipulators सुविधाजनक है क्योंकि एक स्तर z-अक्ष के लिए जो microinjection सुई इंजेक्शन कोशिकाओं के लिए स्वचालित रूप से कम है सेट कर सकते हैं. यह विशेष रूप से उपयोगी है जब कोशिकाओं जिनकी ऊंचाई एक सेल संस्कृति monolayer भर में समान है इंजेक्शन. हालांकि, कोशिकाओं जो लेपित बर्तन पर संवर्धित कर रहे हैं, (उदाहरण न्यूरॉन्स कोलेजन लेपित व्यंजन पर चढ़ाया) के लिए, इन संस्कृतियों के तीन आयामी प्रकृति एक विशिष्ट z-अक्ष थकाऊ स्तर की स्थापना करता है. इन संस्कृतियों के लिए, पुस्तिका micromanipulators लाभप्रद हैं क्योंकि सुई तेजी से प्रत्येक कोशिका के विशिष्ट ऊंचाई के लिए समायोजित किया जा सकता है.

Microinjection एक मुश्किल तकनीक गुरु की आवश्यकता होगी अभ्यास किया जा सकता है. इसके अलावा, microinjection की तकनीक कुछ सीमाएँ हैं. उदाहरण के लिए, केवल एक ऊतक संस्कृति डिश में कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात को इंजेक्ट किया जा सकता है. इस प्रकार, जैव रासायनिक तैयारियाँ पूरी संस्कृति में जो एकत्र किया जाता है (जैसे पश्चिमी धब्बा के लिए सेल lysates) इंजेक्शन अकेले कोशिकाओं का सही प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं. इसके बजाय, सबसे प्रयोगों एकल कोशिका स्तर पर पूरा करने की आवश्यकता है. हालांकि, एक बार यहाँ प्रस्तुत बुनियादी तकनीकों में महारत हासिल कर रहे हैं, एक प्रयोगों की एक अद्वितीय सेट परिकल्पना है कि अन्य विधियों के प्रयोग का जवाब नहीं कर सकते हैं परीक्षण प्रदर्शन कर सकते हैं.

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Disclosures

सभी जानवरों पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं संस्थागत पशु देखभाल और उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

Acknowledgments

इस काम के एमडी NIH अनुदान NS042197 द्वारा समर्थित किया गया. एजेके T32GM008719 और F30NS068006 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DM IRE2 Inverted Microscope Leica Microsystems
PC-10 Microinjection Needle Puller Narishige International
MWO-202 Micromanipulator Narishige International
FemtoJet Microinjector Eppendorf
Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament A-M Systems 615000 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma-Aldrich R9379 Average molecular weight ~70,000 Da
Bovine Cytochrome c Protein Sigma-Aldrich C3131

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References

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Kole, A. J., Knight, E. R., Deshmukh, M. Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c. J. Vis. Exp. (52), e2773, doi:10.3791/2773 (2011).More

Kole, A. J., Knight, E. R., Deshmukh, M. Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c. J. Vis. Exp. (52), e2773, doi:10.3791/2773 (2011).

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