Summary
I detta protokoll, beskriver vi den direkta cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom
Abstract
Apoptos eller programmerad celldöd, är en bevarad och starkt reglerad väg där celler dör 1. Apoptos kan utlösas när celler möter ett brett spektrum av cytotoxisk påfrestningar. Dessa förolämpningar initiera signalering kaskader som i slutändan orsaka utsläpp av cytokrom c från mitokondriens intermembrane utrymmet till cytoplasman 2. Frisättningen av cytokrom c från mitokondrierna är en viktig händelse som utlöser den snabba aktivering av kaspaser, nyckeln cellulära proteaser som i slutändan köra celldöd 3-4.
Vägen av apoptos regleras i punkterna uppströms och nedströms om cytokrom c befrielse från mitokondrier 5. För att studera efter mitokondriella reglering av kaspasaktivering har många utredare vänt sig till direkt cytoplasmisk mikroinjektion av holocytochrome c (häm-bifogas) protein i cellerna 6-9. Cytokrom c är normalt lokaliserad till mitokondrierna där fastsättning av en heme grupp är nödvändig för att den för att aktivera apoptos 10-11. Därför direkt för att aktivera kaspaser är det nödvändigt att injicera holocytochrome c protein istället för dess cDNA, eftersom medan uttrycket av cytokrom c från cDNA konstruktioner kommer att resultera i mitokondriernas inriktning och heme kvarstad, kommer det att vara upptagits från cytosoliska kaspaser. Således är den direkta cytosoliskt mikroinjektion av renat heme-anslutna cytokrom c protein ett användbart verktyg för att efterlikna mitokondrie cytokrom c release och apoptos utan att använda giftiga förolämpningar som orsakar cellulär och mitokondriell skada.
I den här artikeln beskriver vi en metod för mikroinjektion av cytokrom c protein i cellerna, med musen embryonala fibroblaster (MEFs) och primära sympatiska nervceller som exempel. Även om detta protokoll fokuserar på injektion av cytokrom c för undersökningar av apoptos kan de tekniker som visas här också enkelt anpassas för mikroinjektion av andra proteiner av intresse.
Protocol
1. Produktion av mikroinjektion Needles
- Prefabricerade mikroinjektion nålar finns tillgängliga i handeln (t ex. Femtotips från Eppendorf) och är användbara om man inte utför ett stort antal microinjections. Men för dem som vill etablera långsiktiga möjligheter för microinjecting, är ett alternativ att producera mikroinjektion nålar i labbet med tunn vägg borosilikatglas kapillärer och en kommersiell nål avdragare. Detta gör också att formen på nålar som ska varieras, vilket kan vara användbart för olika celltyper.
- Med Narishige PC-10 mikroinjektion Needle avdragare, fast alla fyra vikter och använd ett steg dra programmet (steg 1 inställning) med den relativa värmen inställningen 58,0 (No.2 värmare). Var noga med att placera elementet i mitten av varje kapillär så att de två resulterande nålar är samma längd.
- Dra flera kapillärer (ca 2 kapillärer för varje protein av intresse).
- Förvara nålar i en behållare och samtidigt vara säker på att inte skada nålspetsen. Material som skum eller Blu-Tack kan användas i behållare för att hålla mikroinjektion nålar.
2. Av protein blandningar för injektion
- Förbered en 10x mikroinjektion buffert som innehåller 1 M kaliumklorid och 0,1 M kaliumfosfat (KPI) buffert (ekvimolära blandning av K 2 HPO 4 och KH 2 PO 4) vid pH 7,4. Denna buffert kan förvaras lång sikt i rumstemperatur.
- Att visualisera injektion behöver en fluorescerande färg som Rhodamine-dextran läggas till. Späd the10x mikroinjektion buffert i vatten och lös Rhodamine-dextran pulver för att göra ett 5x lösning mikroinjektion buffert som innehåller 20-40 mg / ml Rhodamine dextran.
- Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C. Det bör vara tillräckligt för upp till 100 individuella förberedelser protein lösning. Andra färgämnen, som fluoresceinisothiocyanat-dextran kan ersätta.
- Förbered cytokrom c lager genom att lösa renade cytokrom C i vatten till en koncentration av 20 mg / ml. Förvara cytokrom C vid -80 ° C för långsiktig lagring och undvika frys-tö-cykler genom att lagra cytokrom c i små (~ 10 mikroliter) alikvoter.
- Förbered en 10 mikroliter proteinblandningens för injektion genom att kombinera 2 mikroliter 5x mikroinjektion buffert innehållande Rhodamine-dextran med 3 mikroliter vatten och 5 mikroliter cytokrom c för en slutlig koncentration på 10 mg / ml cytokrom C 1x buffert (100 mM KCl, 10 mm KP Jag, 4-8 mg / ml Rhodamine dextran).
3. Cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C
- Strax före mikroinjektion, centrifugera blandningen av cytokrom C och mikroinjektion buffert på 16 tusen g under 10 minuter vid 4 ° C för att separera partiklar som kan täppa mikroinjektion nålar.
- Under centrifugering, slå på microinjector att lufttrycket byggs.
- Placera en tallrik av celler i mitten av mikroskop scenen och sätta fokus på cellerna. För att minimera den tid att cellerna hålls utanför inkubatorn är cellerna vanligtvis tillbaka till inkubatorn inom 30 min.
- Pipettera 0,5-1 mikroliter från toppen ytan av proteinet blandningen i den trubbiga änden av kapillär. Var noga med att inte pipettera några partiklar som har centrifugeras till botten av röret. Inom en minut kommer proteinblandningens distribuera till nålspetsen genom kapillärkraften.
- Fäst nålen ordentligt till kapillära innehavaren av mikromanipulator och placera nålen så att dess spets passerar genom genomlysning av mikroskopet vid ca 45 ° vinkel.
- Justera positionen för nålspetsen så att den ligger direkt i centrum av synfältet. För att centrera nålen, använd mikromanipulator för att flytta nålen samtidigt som du tittar genom mikroskop okularet. Nålen skuggan ska vara synlig. Justera nålen så att dess skugga är bara ses i hälften av synfältet, vilket indikerar att nålspetsen är centrerad över cellerna.
- Ställ microinjector till kontinuerligt flöde läget och ställa in arbetstryck till 20 - 100 hPa. Varje nål kan kräva en annan arbetstryck, och arbetstryck kommer sannolikt att behöva justeras under mikroinjektion förfarande för att upprätthålla en stadig ström.
- Sänk nålen med hjälp av den grova ratten till en position strax ovanför cellerna. För att göra detta, höja fokalplan mikroskopet till en position strax ovanför cellerna. Sedan sänka nålen mot celler med grova ratten tills nålspetsen är i fokus.
- Re-center kanylspetsen inom synfältet och ökar förstoringen genom att ändra mikroskop målet.
- Långsamt sänka nålen med hjälp av den fina unti manipulatorn rattenl nålen är bara något över fokalplan cellerna.
- Kontrollera flödet av det protein blandningen genom att titta på den röda fluorescensen hos Rhodamine. Proteinblandningens bör spännande nålen som en tunn, ständig ström. Nålar ska bytas och åter laddade om nålen äventyras eller om flödet är alldeles för stark. Ibland är toppen av glaset kapillär stängd och inget flöde ses från nålen. Om detta inträffar, byter nål eller försiktigt sänka den till botten av kulturen skålen försiktigt spräcka nålspetsen.
- Placera nålspetsen så att den pekar mot en cell på ungefär 45 ° vinkel. Sedan med en jämn rörelse, sänka nålen när du flyttar den mot cellen. Med en andra mjuk rörelse, omedelbart vända riktningen på nålen för att ta bort det från cellen.
- Ett framgångsrikt injiceras cell kommer ofta lite svullna och kan bekräftas genom att visualisera den röda fluorescerande Rhodamine i cellen. Ibland kommer en cell oavsiktligt injiceras i kärnan, vilket kommer att synas.
- Fortsätt att injicera celler genom att justera mikroskopet scenen tills ca 50-100 celler injiceras. När du flyttar mikroskop scenen, se till att höja mikroinjektion nålen så att den rensar upp i cellerna.
4. Representativa resultat:
Den cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom c härmar sin befrielse från mitokondrier under apoptos. Således, som väntat, fibroblaster genomgå snabbt apoptos vid cytosoliskt mikroinjektion av nötkreatur cytokrom c (Fig. 1A). För att säkerställa att injektionsproceduren ensam ansvarar inte för celldöd, serverar injektion av jäst cytokrom c som en viktig kontroll, eftersom jäst cytokrom c är oförmögen att aktivera kaspaser 12.
Intressant, efter mitotiska sympatiska nervceller är anmärkningsvärt resistenta mot cytosoliskt cytokrom c (Fig. 1B) 8,13. Vårt laboratorium har upptäckt att den endogena caspase hämmare XIAP är en viktig hämmare av kaspasaktivering i nervceller 14. Således, för nervceller att dö efter cytokrom c injektion måste XIAP bli först inaktiverats. Till exempel mikroinjektion av cytokrom c till xiap - är sympatiska nervceller tillräcklig för att caspase aktivering och apoptos i dessa celler (Fig. 2) - /.
Figur 1. Cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom c inducerar snabb död i fibroblaster, men inte nervceller. A) vildtyp MEFs eller (B) postnatal dag 5 vildtyp sympatiska nervceller har idag injiceras med nötkreatur cytokrom c (10 mg / ml) tillsammans med Rhodamine-dextran att markera injicerade cellerna. Bilderna visar samma område av celler omedelbart efter injektion (0 h) eller vid den angivna tiden. Pilarna anger injiceras celler. Skala Bar, 20 ìm.
Figur 2. XIAP-brist nervceller är känsliga för cytoplasmisk cytokrom c mikroinjektion. Postnatal dag 5 sympatiska nervceller från XIAP knockout möss idag injiceras med nötkreatur cytokrom c (10 mg / ml) tillsammans med Rhodamine-dextran att markera injicerade cellerna. Bilderna visar samma område av celler omedelbart efter injektion (0 h) eller 5 timmar efter att cytokrom c mikroinjektion (5 tim). Skala Bar, 20 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mikroinjektion av cytokrom c direkt i cytoplasman av celler är ett unikt och kraftfullt verktyg som möjliggör studier av post-mitokondriella reglering av apoptos. Viktigt ger denna teknik för direkt aktivering av apoptos nedströms mitokondrier utan användning av agenter som orsakar cellulär eller mitokondriell skada.
Även om detta protokoll har fokuserat på mikroinjektion av cytokrom c för studier av apoptos, kan de allmänna principerna för protein mikroinjektion visas här även användas för andra proteiner av intresse. Till exempel har vissa forskare använt mikroinjektion av antikroppar som är riktade till särskilda proteiner, t.ex. cytokrom C eller C-juni i studier av apoptos 13,15.
Den vanligaste svårigheten under mikroinjektion är igensättning av mikroinjektion nålar under förfarandet. Om nålen blir igentäppt, kan man använda "rena" funktionen på microinjector som sänder ett starkt tryck puls genom nålen att utvisa partiklar blockerar nålen öppning. Ofta, rengöring nålen är tillräckligt för att unclog nålen. Men om färgen syns spännande nålen under en "ren" men omedelbart stopp igen, tyder detta på att arbetstrycket på microinjector kan vara för låg. I detta fall ökar arbetstrycket tills ett kontinuerligt flöde från nålen ses igen. Rengöring av kanylen inte alltid återställa flödet, då nålen mest sannolikt behöver bytas ut. En teknik som kan användas som ett alternativ, speciellt om injektionen själva materialet är dyrbar, innebär försiktigt bryta spetsen av mikroinjektion nålen mot botten av vävnadsodling skålen. Om det görs noggrant, kan detta förstora öppningen av nål och kommer att återställa flödet. Kommer dock en stor spricka i nålen öppna orsaka en massiv frisättning av färgämnet i kulturen skålen, döljer utsikten av celler.
Tyvärr har inte alla celltyper som kan idag injiceras. Vissa celler (t ex cerebellär granulat nervceller) är för små för mikroinjektion. Andra celler (t.ex. vuxna cardiomyocytes), medan stora nog, kan inte stå emot injektionen och dö även med kontroll injektioner. Som beskrivits ovan tjänar mikroinjektion av jäst cytokrom c som ett användbart kontroll sedan jäst cytokrom c är oförmögen att aktivera kaspaser. Celler idag injiceras med jäst cytokrom c aktiveras inte apoptos om det beror på att mikroinjektion själva förfarandet. Slutligen kan vissa celler (t.ex. fibroblaster) tål mikroinjektion, men kan vara svårt att injicera på grund av deras platta morfologi. Som ett resultat finns det en risk att mikroinjektion nålen kommer att bryta mot botten av vävnadsodling skålen med varje cell som injiceras.
Automatiserade eller manuella micromanipulators kan användas för protein mikroinjektion, där varje system med fördelar och nackdelar. Automatiserade micromanipulators är bekvämt eftersom man kan ställa in en z-axel som mikroinjektion nålen automatiskt sänks för att injicera celler. Detta är särskilt användbart när du injicerar celler vars höjd är lika i en cellkultur monolager. För celler som odlas på bestruket rätter (t ex nervceller pläterade på kollagen-belagda rätter), gör den tredimensionella karaktären hos dessa kulturer fastställa en särskild z-axel långtråkig. För dessa kulturer, manuell micromanipulators är fördelaktiga eftersom nålen kan snabbt anpassas till viss höjd i varje cell.
Mikroinjektion kan vara en svår teknik att bemästra och kräver praktik. Dessutom har tekniken med mikroinjektion vissa begränsningar. Till exempel kan endast en liten del av celler i en vävnad kultur maträtt injiceras. Således biokemiska preparat där hela kulturen samlas (t.ex. cell lysates för Western blot) är inte en korrekt bild av det injicerade cellerna ensam. Istället flesta experiment måste slutföras vid encelliga nivå. Men när de grundläggande teknikerna som presenteras här är behärskar, kan man utföra en unik uppsättning av experiment för att testa hypoteser som inte kan besvaras med hjälp av andra metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla försök på samma djur har godkänts av Institutional Animal Care och använda kommittén vid University of North Carolina.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag NS042197 till MD. AJK har finansierats med bidrag T32GM008719 och F30NS068006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica Microsystems | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige International | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige International | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis - comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
