Summary
Ein experimentelles Mausmodell von Knochenmetastasen wurde nach intrakardialen Lieferung von Luciferase exprimierenden Mammatumorzellen gegründet. Tumorentstehung und führte Osteolyse wurden in Längsrichtung mit Biolumineszenz-und Mikro-CT-Bildgebung überwacht.
Abstract
Nach intrakardialen Lieferung von MDA-MB-231-luc-D3H2LN Zellen Nu / Nu-Mäusen, systemische Metastasen in den injizierten Tieren entwickelt. Biolumineszenz-Bildgebung mit IVIS Spectrum wurde eingesetzt, um den Vertrieb und die Entwicklung der Tumorzellen nach der Lieferung Verfahrens einschließlich DLIT Rekonstruktion des Tumors Signal und seine Lage Maßnahme zu überwachen.
Entwicklung von Metastasen an den Knochen Gewebe löst osteolytische Aktivität und Läsionen an Tibia und Femur wurden längs mit Mikro-CT untersucht. Imaging wurde mit einem Quantum FX Mikro-CT-System mit schnellen Bildgebung und niedrige Röntgendosis. Die geringe Strahlendosis ermöglicht mehreren Imaging-Sitzungen mit einer kumulativen X-ray Dosierung weit unter LD50 durchgeführt werden. Eine Maus Imaging-Shuttle-Gerät wurde verwendet, um nacheinander Bild der Mäuse mit beiden IVIS Spectrum und Quantum FX Voraussetzung für präzise Positionierung Tier sowohl in der Biolumineszenz-und CT-Bilder. Die optischen und CT-Datensätze wurden in 3-dimentions co-registriert die Living Bild 4.1-Software. Diese Multi-Mode-Ansatz ermöglicht eine engmaschige Überwachung des Tumorwachstums und der Entwicklung gleichzeitig mit osteolytischen Aktivität.
Protocol
Longitudinal-Bildgebung ist in präklinischen Studien eingesetzt, um den Fortschritt der Krankheit zu folgen oder messen die Wirkung einer therapeutischen. In der Onkologie bieten optische Verfahren rigorose Werkzeuge, um das Tumorwachstum zu überwachen und liefern präzise Quantifizierung des Zellwachstums oder der Genexpression zu jedem Zeitpunkt in einer solchen Studie. Anatomische Veränderungen können mit Hilfe eines hochauflösenden Technik wie MicroCT sein, aber für die Längs-Bildgebung eine niedrige Röntgendosis muss verwendet werden, um biologische Artefakte zu vermeiden. Optische und MicroCT Bilder können co-registriert sein, um eine Kombination von funktionellen und anatomischen Daten sichergestellt wird, dass ein Maximum an Informationen aus dem Tiermodell extrahiert bieten.
1. Zellpräparation
- Caliper bietet eine Reihe von Luciferase exprimierenden Zelllinien für die präklinische Forschung in Mausmodellen.
- MDA-MB-231-luc-D2H2LN ist eine menschliche Brusttumor-Zelllinie exprimiert das Luciferase-Gen, das als eine optische Anzeige der Tumorgenese in vivo verwendet werden können. Diese Zelllinie ist aus einer spontanen Lymphknotenmetastasen, die von einem D3H1 Brustfettpolster Tumor entstanden ist erstellt und ist dafür bekannt, aggressiv Metastasen bilden.
- Die Zellen werden als pathogen-freien gefrorenen Kultur, die sich leicht wächst in Standard-Medien mit keine Notwendigkeit für Selektionsmarker zur Verfügung gestellt.
- Um zu überprüfen, Luciferaseaktivität vor der Injektion in das Tier eine 90% konfluent Kolben wird durch Trypsinierung geerntet. Luciferaseaktivität wird durch den Verzicht auf 50.000 Zellen in einer Mikrotiterplatte und darstellende Verdünnungsreihe gemessen.
2. Intrakardiale Injektion von Zellen in Tieren
- Vor der Injektion werden die Tiere narkotisiert mit 3% Isofluran.
- 1 bis 3.000.000 Zellen sind in 50ul Volumen in den linken Ventrikel injiziert. Zell-Suspension enthält 150ug/ml D-Luciferin zu Injektionstechnik zu validieren.
- Zur Bestätigung einer korrekten intrakardiale Injektion Mäuse sind in der IVIS System abgebildet werden. Mäuse, die BLI-Signal zeigen, im ganzen Körper wurden korrekt injiziert. Wenn das Signal lokalisiert wurden die Zellen nicht richtig in das Herz injiziert.
3. BLI Bildgebung zu überwachen Metastasen
- Die Imaging-Shuttle unterstützt die Maus für die Datenerfassung in beiden IVIS Spectrum und der QuantumFX MicroCT System.
- Der Shuttle hilft bei der Erhaltung des Tieres in der gleichen Position für die Bildgebung und beinhaltet fiducial Signale in automatische Co-Registrierung zu unterstützen. Die Kammer ist der isofluorance Verdampfer verbunden Narkose aufrecht zu erhalten.
- Imaging-Assistenten in der Living Image Software 4.1 kann verwendet werden, um automatisch die Belichtungszeit, Blende und Binning und sorgen für quantitative Datenerhebung werden.
- Mehrere Bilder können erworben werden und im Vergleich in Längsschnittstudien für Sekunden oder Monaten, je nach der Art des Experiments.
- Tag 6 nach der Injektion von Zellen, zeigt BLI Bildgebung mit IVIS Spectrum Metastasen in den Knochen in sieben von neun Mäusen.
4. Longitudinal Monitoring von Osteolysen mit Mikro-CT
- Mäuse, die klare Knochenmetastasen sichtbar mit BLI zeigten, wurden in den Quantum FX Mikro-CT-System abgebildet.
- Die Quantum FX Mikro-CT-System liefert qualitativ hochwertige Bilder bei einer Röntgen-Dosis niedrig genug, um wahr Längs-Mikro-CT in präklinischen Studien ermöglichen.
- Knochenabbau in beiden Beinen in Längsrichtung überwacht werden mit diesem System in weniger als einer Minute.
- Mäuse sind narkotisiert mit 3% Isofluran und kann direkt aus dem IVIS Spectrum-System übertragen werden.
- Zwei 60mm-Bilder sind zusammen, um das ganze Tier sehen zu erfassen genäht.
- A 30mm FOV ist ideal für die Bildgebung des Kniegelenks in hoher Auflösung.
- Ein einzelner Scan mit ausreichend hoher Auflösung zu messen und zu quantifizieren Knochenmetastasen dauert nur 18 Sekunden und liefert eine Dosis von nur 13mGy.
- Die Mäuse wurden bis zu 8 mal in 36 Tagen mit dem Mikro-CT-System abgebildet, ohne die das Tumorwachstum oder der Gesundheit des Tieres.
- Die Mikro-CT-Bildgebung zeigte, dass Knochen leisions sichtbar am Tag 10 wurden fortgeschritten und sehr schnell, entsprechend der Zunahme der BLI-Signal.
5. 3D-Co-Registrierung und Analyse von BLI und UCT
- Nachdem die Bilder haben sowohl auf der IVIS Spektrum und Quantum FX Mikro-CT-System Daten erfasst in eine 3D-Rekonstruktion co-registriert werden.
- MicroCT Bilder werden als DICOM-Dateien exportiert und in das Wohnzimmer Bild 4.1 3D Multi Modalität Werkzeug.
- In der Living Image Software laufen DLIT Programm dreidimensional rekonstruieren das optische Signal.
- Die fiducial Tool in der Software wird verwendet, um Co-Registrierung der optischen BLI Signal an die Mikro-CT-Bild.
- Koregistrierten Datensätze können quantitativ analysiert werden, um mehrere Parameter während der Progression der Erkrankung zu überwachen sind wir hier verfolgen das Wachstum der Metastase zusammen mit der Entwicklung der Osteolyse in den Knochen. </ Ol>
Discussion
Kleintier-Bildgebung mit MicroCT hat die Überwachung osteolytische Läsionen wurden unter pathologischen Bedingungen, wie Tumor-Entwicklung (..; Labrinidis et al, 2009 Cowey et al 2007) angewendet. Als Biolumineszenz-Bildgebung der Luciferase gekennzeichnet Tumoren weitgehend angewandt worden präklinisch, vorausgesetzt, Co-Registrierung der Biolumineszenz und MicroCT Bilder eine bessere Definition der anatomischen Lage der Biolumineszenz-Signale (Kaijzel et al. 2007). Früheren Studie mit einem Luciferase gekennzeichnet Brusttumor-Zelllinie MDA-MB-231-luc-D3H2LN zeigte Metastasen in Knochen und Entwicklung von Osteolysen folgenden intrakardiale Injektion (Jenkins et al 2005;. Minn et al, 2005). In dieser Studie untersuchten wir eine Längsschnittstudie von Tumormetastasen und osteolytische Aktivität mit Kombinatorik optischen und strahlungsarme-Dosis MicroCT Bildgebung mit der systemischen MDA-MB-231-luc-D3H2LN Metastasen-Modell. Wir führten sequentielle Bildgebung mit IVIS Spectrum und Quantum FX MicroCT Systeme und erreicht Biolumineszenz-und CT-Co-Registrierung mit unserem neu entwickelten Wohnzimmer Bild 4.1-Software (Heng et al., 2010). Biolumineszenz-Bildgebung mit IVIS bietet nicht-invasive Detektion der Tumorzellen mit hoher Empfindlichkeit, so dass die Tumoren in einem frühen Stadium erkannt werden. Imaging mit Quantum FX ermöglicht die genaue 3D-Rekonstruktion der Knochenläsionen und detaillierten anatomischen Informationen. Quantum FX-System bietet niedrige Strahlendosis Bildgebung, die Längs-Überwachung des Krankheitsverlaufs ermöglicht. Korrelation von Knochenläsionen und Tumormetastasen war in der Zusammenarbeit registrierte Bild dargestellt, und der Vorteil der Multimodalität Verfolgung von Läsion Entwicklung längs eindeutig nachgewiesen werden konnte.
Disclosures
Die Autoren sind Mitarbeiter von Caliper Life Sciences, der das Instrument in diesem Artikel vorgestellten machen.
References
- Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent Human Breast Cancer Cell Lines that Permit Rapid and Sensitive in vivo Detection of Mammary Tumors and Multiple Metastases in Immune Deficient Mice. Breast Cancer Research. 7, R444-R454 (2005).
- Cowey, S., Szafran, A. A., Kappes, J., Zinn, K. R., Siegal, G. P., Desmond, R. A., Kim, H., Evans, L., Hardy, R. W. Breast Cancer Metastasis to Bone: Evaluation of Bioluminescent Imaging and MicroSPECT/CT for Detecting Bone Metastasis in Immunodeficient Mice. Clinical and Experimental Metastasis. 24, 389-401 (2007).
- Labrinidis, A., Hay, S., Liapis, V., Ponomarev, V., Findlay, D. M., Evdokiou, A. Zoledronic Acid Inhibits Both the Osteolytic and Osteoblastic Components of Osteosarcoma Lesions in a Mouse Model. Clinical Cancer Research. 15, (2009).
- Kaijzel, E. L., Pluijm, G. vander, Lowik, C. W. G. M. Whole-Body Optical Imaging in Animal Models to Assess Cancer Development and Progression. Clinical Cancer Research. 13, 3490-3497 (2007).
- Minn, A. J., Kang, Y., Serganova, I., Gupta, G. P., Giri, D. D., Doubrovin, M., Ponomarev, V., Gerald, W. L., Blasberg, R., Massague, J. Distinct Organ-Specific Metastatic Potential of Individual Breast Cancer Cells and Primary Tumors. The Journal of Clinical Investigation. 115, (2005).
- Xu, H., Christensen, A., Kuo, C., Nilson, D., Lim, E., Whalen, J., Kim, J. B., Zhang, N., Singh, R., Oldfield, S., Troy, T., Rice, B. Co-registration of in vivo Optical Tomography and Micro-CT for Longitudinal Studies. Word Molecular Imaging Congress. , (2010).
