Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure

Summary

Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Abstract

L'autophagie est important de chiffre d'affaires des composants cellulaires dans un éventail de conditions différentes. Il remplit une fonction essentielle homéostatique ainsi que d'un mécanisme de contrôle de la qualité qui peuvent cibler sélectivement et dégradent la matière cellulaire, y compris organelles1-4. Par exemple, endommagées ou redondantes mitochondries (Fig. 1), ne sont pas éliminés par autophagie, peut représenter une menace pour l'homéostasie cellulaire et la survie cellulaire. Chez la levure, Saccharomyces cerevisiae, une carence en nutriments (par exemple, la famine azote) ou des dommages peuvent favoriser chiffre d'affaires sélective des mitochondries par autophagie dans un processus appelé mitophagy ^5-9.

Nous décrivons une approche microscopie de fluorescence simples pour évaluer l'autophagie. Pour plus de clarté, nous limitons notre description ici de montrer comment l'approche peut être utilisée pour surveiller mitophagy dans des cellules de levure. Le dosage fait appel à un rapporteur fluorescent, Rosella, qui est un biocapteur à double émission comprenant un rélativement pH stable de protéine rouge fluorescente liée à un pH-sensible protéine fluorescente verte. Le fonctionnement de ce journaliste s'appuie sur les différences de pH entre la vacuole (pH ~ 5,0 à 5,5) et les mitochondries (pH ~ 8,2) dans les cellules vivantes. Dans des conditions de culture, les cellules de type sauvage présentent à la fois une fluorescence rouge et verte distribuée d'une manière caractéristique des mitochondries. Émission de fluorescence n'est pas associé à la vacuole. Lorsqu'il est soumis à la famine d'azote, une condition qui induit mitophagy, en plus de la fluorescence verte et rouge étiquetage les mitochondries, les cellules présentent une accumulation de rouge, mais pas de fluorescence verte, la lumière en acides vacuolaires représentant la distribution des mitochondries de la vacuole. Marquer les cellules avec du rouge, vert, mais pas vacuoles fluorescentes peuvent être utilisées en tant que mesure de l'activité dans les cellules mitophagic ^5,10-12.

Protocol

Sélection de souches de levures appropriées de contrôle

Le dosage repose sur la expérimentateur visuellement l'évaluation de l'accumulation de la fluorescence rouge dans la vacuole de levure. En tant que tel, le dosage est subjective et repose sur la sélection de souches de contrôle appropriés et les conditions de croissance. Un contrôle de type sauvage est utilisé pour indiquer les niveaux de l'autophagie normalement prévu. Comme témoin négatif un null souche pour l'expression de l'un des gènes autophagie base (par exemple, ATG3) est adapté, de telles souches ne peut pas livrer le matériel (par exemple, les mitochondries, noyau) vers la vacuole

1. Transformation de cellules de levure avec de l'ADN plasmidique

Les cellules de levure peuvent être facilement rendues compétentes pour la transformation par traitement avec LiAcetate. Les kits commerciaux peuvent être achetés (par exemple, EasyComp, Invitrogen) et les protocoles publiés sont disponibles ^13.

Dans ce protocole, nous utilisons sauvage BY4741 souche type (MAT atg3) qui en découlent, chaque expression d'un manque différente gène non essentiel La bibliothèque souche suppression représente un outil précieux pour étudier l'autophagie en utilisant Rosella à base de sondes. Le journaliste a utilisé dans ce protocole est mt-Rosella des mitochondries (figure 2A), codée par pAS1NB: mt-Rosella ^12.

Les étapes suivantes sont basées sur l'utilisation de cellules rendues compétentes en utilisant le kit de transformation EasyComp et conservés congelés à -80 ° C pour une utilisation pratique.

1. Equilibrer Solution III (EasyComp Transformation Kit) à la température ambiante pendant 30 minutes avant d'ajouter les cellules de levure.
2. Ajouter 2 à 2,5 ul (~ 100 ng / ul) de l'ADN plasmidique codant pour le journaliste (pAS1NB: mt-Rosella) à une solution stérile de 1,7 ml snap-cap microtube plastique.
3. Ajouter 5 & mu, L de suspension fraîchement décongelé des cellules de levure compétentes et mélanger par pipetage doux.
4. Ajouter 50 ul de la solution III (EasyComp Transformation Kit) et vortex pour mélanger. 1,5) Incuber les réactions de transformation de 1 heure à 28-30 ° C avec un mélange vigoureux toutes les 15 minutes à l'aide d'un mélangeur à vortex ou manuellement par agitation du tube avec le doigt.
5. Transférer soigneusement le mélange de transformation sur une plaque de gélose unique YMM croissance supplémenté en histidine, la méthionine et l'uracile, et lentement distribuer les cellules autour de la surface de la gélose avec une spatule en verre stérile. Les cellules de levure sont fragiles à ce stade et une manipulation en douceur peut augmenter le rendement des transformants.
6. Incuber les plaques de croissance de 2 à 4 jours à 28-30 ° C ou jusqu'à ce que les colonies apparaissent environ 2-3 mm de diamètre.

2. Confirmant l'expression de Rosella dans des cellules de levure

Avant de se lancer dans des expériences détaillées de la localisation correcte et efficace expression de Rosella doit être confirmée.

1. En utilisant des cure-dents stériles sélectionner pour chaque 5 déformation des colonies isolées de la plaque de transformation et de remettre les cellules dans 50 ul d'eau stérile à 1,7 ml stériles distinctes composant logiciel enfichable bouchon microtube plastique.
2. Placer 10 ul de chaque suspension cellulaire sur différents étiquetés lames de microscope (76 x 26 mm) et couvrent la suspension cellulaire avec une lamelle carré (22 x 22 mm).
3. Immédiatement examiner les cellules de l'émission de fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence (par exemple, Olympus Fluoview FV500). Rechercher fluorescence verte et rouge fort et d'étiquetage typique de localisation mitochondriale (Fig. 2B et 2C).
4. Le reste de chaque colonie a examiné pour la fluorescence de cette manière doit être inoculé sur une plaque de croissance YMM frais.
5. Incuber les boîtes à 28-30 ° C pendant 2 jours jusqu'à colonie sont environ 2-3 mm de diamètre.

3. La croissance cellulaire etl'induction de l'autophagie

Autophagie peut être induite en utilisant un certain nombre de différentes conditions expérimentales, dont l'entrée en phase stationnaire, le changement de source de carbone, de l'administration de rapamycine, ou d'azote famine. Nous utilisons régulièrement la famine comme méthode d'azote pour induire mitophagy.

1. Inoculer une colonie isolée dans 10 ml de milieu de culture contenant de l'éthanol et les suppléments auxotrophes appropriés.
2. Incuber les cultures de levures à 28-30 ° C avec agitation orbitale (200 rpm) pendant environ 48 heures. Les cellules doivent être en phase de croissance semi-logarithmique.
3. Sédimenter les cellules du double des échantillons de 1 ml de la culture dans 1,7 ml stériles snap-cap tubes à centrifuger en plastique par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. Retirez délicatement et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
4. Laver les cellules trois fois avec 1 ml d'eau distillée stérile par remise en suspension suivie d'une centrifugation pour éliminer m résiduelleoyen.
5. Après le troisième lavage remettre en suspension les cellules dans 100 ml de milieu de croissance ou de l'azote famine milieu.
6. Re-ensemencer les cellules remises en suspension dans 10 ml de milieu de croissance frais ou 10 ml azote famine moyenne. Incuber sous agitation orbitale pendant 6-12 heures pour permettre l'induction de mitophagy. Après la famine préparer des cellules pour la visualisation par microscopie à fluorescence.

Remarque: l'étiquetage de la vacuole avec CMAC-Arg

Lors de la première place du test, il est utile pour confirmer la livraison sous microscope à fluorescence de Rosella à la vacuole. Bien que la vacuole de la levure est un organite grande dont la localisation peut souvent être facilement déterminée par référence à des images transmises lumière, dans certaines souches de levure et sous certaines conditions de croissance de la vacuole peut être fragmentée et difficile à localiser.

La vacuole peut être facilement marquée en utilisant un colorant à base de coumarine tels que vacuole CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, la L-arginine amide). L'action des protéases vacuolaires sur les résultats de colorant dans l'étiquetage de fluorescence bleu vif de la vacuole. L'émission bleue peuvent être facilement distingués des émissions rouge et verte de Rosella ^11. Le marquage avec CMAC-Arg n'a pas besoin d'être réalisée en routine, mais il est recommandé pour ceux qui ne sont pas familiers avec l'emplacement et l'apparence de la vacuole dans la levure.

4. L'étiquetage de la vacuole avec CMAC-Arg

1. Ajouter le CMAC-Arg (100 mM de concentration finale) pour les cellules en croissance ou en manque d'azote avant l'imagerie. La solution CMAC-Arg peut être préparé à l'avance, mais que la solution est sensible à la lumière dont il a besoin d'être protégé contre l'exposition à la lumière.
2. Incuber à 28-30 ° C avec agitation orbitale (200 rpm) pendant 30 minutes.
3. Sédimenter les cellules par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante.
4. Jeter le surnageant.
5. Laver les cellules trois fois avec distillée stérilepar remise en suspension de l'eau suivie d'une centrifugation pour enlever des résidus du fluide et de l'excès CMAC-Arg colorant.
6. Monter les cellules pour l'imagerie tel que décrit ci-dessous.

5. Montage des cellules de levure vivantes pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)

1. Fondre 2 mg de l'agarose bas point de fusion distincts en aliquots de 1 ml de milieu de croissance et de l'azote famine support par incubation à 70 ° C. L'agarose fondu est maintenue à 70 ° C.
2. Délicatement les cellules de granulés aliquotes de 1 ml de chaque culture cellulaire par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante et jeter le surnageant.
3. Laver les cellules trois fois avec 1 ml d'eau distillée stérile par remise en suspension et centrifugation comme à l'étape 5.2.
4. Remettre en suspension les cellules lavées dans 100 ul d'eau distillée stérile.
5. Pour monter l'endroit cellules 20 pl d'agarose fondu sur une lame de microscope en verre marquée (76 x 26 mm).
6. Détecter immédiatement 10 pi de l'lavé cell suspension sur le lit d'agarose.
7. Couvrir le lit d'agarose avec une lamelle (22 x 22 mm). Les cellules seront répartis sur la surface d'agarose sous la lamelle.
8. Pour prévenir la déshydratation et le mouvement de la lamelle lors de l'imagerie soin de sceller les bords de la lamelle d'une fine pellicule de vernis à ongles.
9. Lorsque le vernis est complètement sec (10 min), la diapositive est prêt à afficher par microscopie de fluorescence Attention: vernis à ongles peut causer des dommages aux objectifs de microscope.
10. Les cellules montées en utilisant cette technique peut être observée jusqu'à 1 heure après le montage.

6. Autophagie visualiser à l'aide CLSM

Le niveau de l'autophagie dans une population de cellules est régulièrement évaluée en déterminant le nombre de cellules présentant une fluorescence rouge vacuolaire avant et après l'induction de l'autophagie. Idéalement, la progression de l'autophagie est surveillé à des moments choisis suivant l'induction de l'autophagie (fig. 3). Le mieux est effectué en visualisant à travers les jumelles microscope. Il est important que les contrôles appropriés sont utilisés (par exemple, Δ atg3 mutant) et que les réglages du microscope restent inchangés entre l'observation des échantillons différents (par exemple, utilisation de filtres de densité neutre, filtre de sélection).

Les cellules de levure sont relativement faibles nécessitant un microscope à fluorescence de bonne qualité (par exemple, Olympus Fluoview FV500) équipé d'excitation / émission des filtres appropriés pour la visualisation séparée de la GFP et / ou pHluorin (fluorescence verte d'émission) (filtre FITC) et DsRed.T3 (rouge émission de fluorescence) (TRITC filtre).

1. L'utilisation d'un point de vue objectif 60x eau non affamés cellules de type sauvage en utilisant alternativement les filtres FITC et TRITC. Cellules de type sauvage doit présenter une distribution cellulaire typique des mitochondries à la périphérie des cellules qui montrent une fluorescence rouge et vert. Noter que cette répartition des mitochondries dépend de la Pinhole réglage du microscope confocal. On utilise généralement une valeur inférieure à sténopé de 125 um, qui permet seulement les mitochondries à être observé comme une série de points localisés à la périphérie de la cellule (Fig. 2C), de sorte que la vacuole est non masquée ^12. Si une valeur élevée de trou d'épingle (200 um) est utilisé, il permet au réseau filamenteux typique mitochondrial distribués dans toute la cellule (et les changements qu'elle subit) à observer ^11. Pas d'autres structures dans la cellule doit être marqué par fluorescence.
2. Voir successivement les cellules pour chacun des points dans le temps après le transfert à moyen famine. Visualiser en alternance à l'aide des filtres d'émission verte et rouge. À la 6 famine h heure du point de fluorescence rouge, mais pas d'émission correspondant verte doit être perceptible dans la vacuole. Localisation vacuolaire peut être confirmé en utilisant séparément CMAC-Arg (Fig. 2C). Voir ~ 200 cellules et compter le nombre qui montrent que la fluorescence rouge dans levacuole (c.-à-absorption vacuolaire des mitochondries).
3. Comptez accumulation vacuolaire pour tous les points de temps d'observation> 200 cellules, puis de pourcentage parcelle de cellules présentant une accumulation vacuolaire.
4. Examiner les cellules de contrôle autophagie négatives exprimant mt-Rosella avant la famine et la faim après 6 h.

7. Les résultats représentatifs:

Ici, nous montrons des résultats typiques obtenus en utilisant mt-Rosella, exprimée en type sauvage et Δatg3 cellules mutantes. Dans des conditions de culture avec de l'éthanol comme source de carbone, à la fois sauvage et Δatg3 cellules mutantes présentent une distribution cellulaire de fluorescence (rouge et vert) typique des mitochondries dans les cellules de levure. Rouge et verte fluorescence d'émission n'est pas détecté dans la vacuole (Fig. 2B et 2C). Lorsqu'il est soumis à la famine azote pendant 6 heures et au-delà, puis, en plus de la fluorescence rouge et verte correspondant à des mitochondries, cellules de type sauvage aussi expol'accumulation des bits rouge, mais pas de fluorescence verte dans la lumière vacuolaire (Fig. 2B;. Fig 3). Cependant, dans Δatg3 cellules mutantes ni rouge, ni verte fluorescence s'accumule dans la lumière vacuolaire (Fig. 2C;. Fig 3).

Figure 1. Haut, le régime des organites et des compartiments dans une cellule de levure. Fond, une vue vacuole centrée sur une cellule de levure est présenté indiquant la dégradation autophagique de différents organites et les compartiments. Certaines des différences entre les divers organites spécifiques types d'autophagie (par exemple, mitophagy, nucleophagy) comprennent la spécificité (sélection fret) du contenu englouti, divers besoins intracellulaires et extracellulaires indices (par exemple, la famine, les dommages), des signaux spécifiques, ATG gènes et en fonction du temps.

Figure 2. Représentation schématique (A) du mt-Rosella. La séquence leader mitochondrial (dans ce cas, de la citrate synthase) est utilisé pour cibler le biocapteur Rosella à la matrice mitochondriale. Excitation et d'émission pour les deux maxima protéine fluorescente rouge (DsRed.T3) et la protéine fluorescente verte (pHluorin) sont indiqués. A un pH élevé (pH ~ 8,2 mitochondrial) le biocapteur fluorescent rouge et vert, cependant, à un pH bas (pH vacuolaire ~ 5,5), il émet une fluorescence rouge seulement. (B) Représentation schématique des résultats escomptés de type sauvage et Δ atg3 cellules mutantes exprimant mt-Rosella. (C) Les résultats réels obtenus par CLSM pour les cellules de type sauvage et des conditions de plus en plus sous azote famine. De gauche à droite: DIC (difrence de contraste), DP (DsRed.T3) d'émission de fluorescence, la GFP (pHluorin) d'émission de fluorescence, CMAC-Arg fluorescence et de l'image de fusion. (D) Les résultats réels obtenus par microscopie à fluorescence pour Datg3 cellules mutantes moins de croissance et des conditions de famine azote. De gauche à droite: DIC (différence de contraste), DP (DsRed.T3) d'émission de fluorescence, la GFP (pHluorin) d'émission de fluorescence, CMAC-Arg fluorescence et de l'image de fusion.

Figure 3. Le pourcentage de type sauvage et Δ atg3 cellules mutantes, exprimant mt-Rosella et cultivés dans la famine azote, montrant une fluorescence rouge dans la vacuole au cours d'une évolution dans le temps de 48 heures. Le pourcentage de cellules présentant une accumulation de fluorescence rouge dans la vacuole a été enregistrée à 0, 6, 12, 24 et 48 heures après le début de la famine azote.

Discussion

Dans les images représentatives présentés dans la figure. 2B et 2C, on peut voir clairement que l'utilisation des organites spécifiques rapporteurs fluorescents et microscopie de fluorescence fournit la preuve de la localisation mitochondriale / distribution à la fois dans la croissance et de l'azote cellules privées, et permet mitophagy à visualiser.

Il est à souligner que cette méthode n'est pas limitée à mitophagy suivante. L'autophagie des autres composants cellulaires ou des organelles (par exemple, les ribosomes, des gouttelettes lipidiques, les peroxysomes, réticulum endoplasmique et le noyau) peut être surveillée par un étiquetage approprié. Les détails de la construction biocapteur Rosella, conditions de culture cellulaire et des résultats typiques de chiffre d'affaires du noyau (nucleophagy) ont été signalés ^11,12 illustrant l'application plus large de la méthode.

Utilisez des organites spécifiques rapporteurs fluorescents pour l'autophagie surveillance nécessite plusieurs considerations de la conception de construction à garder à l'esprit. Il s'agit notamment de: (1) la sélection et la fusion au signal de ciblage appropriée pour atteindre organite spécifique ciblage, (2) la sélection d'une protéine fluorescent approprié (s), (3) une forte émission de fluorescence, (4) la localisation correcte des organites et / ou la distribution à l'intérieur de la cellule. Une fois que le journaliste organite spécifique a été exprimé avec succès chez la levure hôte choisi la souche d'un deuxième groupe de considérations deviennent: (1) les conditions de croissance de levures, (2) la préparation d'échantillons de cellules, (3) les paramètres d'imagerie car il est important que les paramètres choisis pour CLSM (par exemple, l'intensité du laser, la vitesse de balayage et le mode, la valeur sténopé, valeur de zoom, les objectifs utilisés ou d'exposition pour caméra CCD) sont maintenues pendant toute une expérience en sorte que des comparaisons peuvent être faites entre le contrôle (cellules en croissance) et des échantillons affamés; ( 3) l'induction autophagie et la livraison réussie du journaliste dans la vacuole.

Dans l'ensemble, cette méthode microscopie à fluorescence il'application est facile, relativement rapide, et dispose d'un potentiel de criblage à haut débit pour de nouveaux médicaments qui favorisent ou inhibent l'autophagie, et aussi pour les gènes qui régulent ou modulent l'autophagie.