Summary
ووصف نهج قوي لمراقبة تسليم العضيات لمعة الحامضية للفجوة الخميرة للتحلل وإعادة التدوير. الأسلوب يعتمد على وضع العلامات المحددة الهدف العضيات مع مضان المزدوجة الانبعاثات المرمزة وراثيا الحموضة ، جهاز الاستشعار البيولوجي ، والتصور من الخلايا الفردية باستخدام المجهر مضان.
Abstract
الالتهام الذاتي المهم للدوران من المكونات الخلوية في ظل مجموعة من الظروف المختلفة. أنها تخدم وظيفة أساسية استتبابي فضلا عن آلية لمراقبة الجودة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي وتتحلل المادة الخلوية بما في ذلك 4 - organelles1. على سبيل المثال ، تضررت أو زائدة الميتوكوندريا (الشكل 1) ، وليس التخلص منها عن طريق الالتهام الذاتي يمكن أن تمثل تهديدا للتوازن الخلوية وبقاء الخلية. في الخميرة ، خميرة يمكن السكيراء ، والحرمان من المواد الغذائية (مثل المجاعة النيتروجين) أو الضرر تعزيز دوران الانتقائي للالميتوكوندريا التي الالتهام الذاتي في عملية تسمى mitophagy 5-9.
وصفنا بسيطة نهج المجهري مضان لتقييم الالتهام الذاتي. من أجل الوضوح ونحن لدينا وصف تقييد هنا لاظهار كيف يمكن استخدام نهج لرصد mitophagy في خلايا الخميرة. ويجعل من استخدام مقايسة مراسل الفلورسنت ، روزيلا ، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي المزدوجة الانبعاثات يضم الحموضة مستقرة نسبيا بروتين فلوري الأحمر مرتبطة بروتين درجة الحموضة حساسة الفلورية الخضراء. تشغيل هذا المراسل تعتمد على الاختلافات في درجة الحموضة بين (5،0-5،5 درجة الحموضة ~) فجوة والميتوكوندريا (درجة الحموضة ~ 8.2) في الخلايا الحية. تحت ظروف النمو ، وخلايا النوع البري يحمل كل مضان أحمر وأخضر وزعت في طريقة مميزة في الميتوكوندريا. لا يرتبط مضان الانبعاثات مع فجوة. عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين ، وهو الشرط الذي يدفع mitophagy ، بالإضافة إلى مضان أحمر وأخضر وصفها الميتوكوندريا ، والخلايا يحمل تراكم الحمراء ، ولكن لا مضان أخضر ، في التجويف وفجوي الحمضية يمثل تسليم الميتوكوندريا إلى فجوة. احرز مع الخلايا الحمراء ، ولكن يمكن استخدام الفجوات الفلورية الخضراء لا كمقياس للنشاط في الخلايا mitophagic 5،10-12.
Protocol
مناسبة اختيار سلالات الخميرة السيطرة
ويعتمد على مقايسة المجرب تقييم بصريا تراكم مضان أحمر في فجوة الخميرة. على هذا النحو في مقايسة هو ذاتي ويعتمد على اختيار سلالات مناسبة ومراقبة ظروف النمو. ويستخدم نوع السيطرة البرية للإشارة إلى مستويات الالتهام الذاتي المتوقع عادة. كعنصر تحكم السلبية فارغة للتعبير عن سلالة واحدة من الجينات الالتهام الذاتي الأساسية (على سبيل المثال ، ATG3) هو مناسب ؛ سلالات لا يمكن تسليم هذه المواد (على سبيل المثال ، الميتوكوندريا ، النواة) إلى فجوة
1. تحويل خلايا الخميرة مع DNA البلازميد
ويمكن بسهولة جعل خلايا الخميرة المختصة للتحول عن طريق التعامل مع LiAcetate. ويمكن شراء مجموعات تجارية (على سبيل المثال ، EasyComp ، Invitrogen) والبروتوكولات نشرت متوفرة 13.
في هذا البروتوكول نستخدم نوع السلالة البرية BY4741 (MAT a his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) ، وبعض أعضاء مكتبة شاملة لسلالات متحولة الحذف (على سبيل المثال ، Δ atg3) المستمدة من ذلك ، تفتقر إلى كل تعبير من الجين غير الضرورية المختلفة. مكتبة سلالة الحذف يمثل أداة قيمة للتحقيق في استخدام روزيلا الالتهام الذاتي القائم على التحقيقات. مراسل يعمل في هذا البروتوكول هو MT - روزيلا لالميتوكوندريا (الشكل 2A) ، المشفرة بواسطة pAS1NB : MT - 12 روزيلا.
تستند الخطوات التالية على استخدام الخلايا التي المختصة باستخدام أدوات تحويل EasyComp وتخزينها في المجمد -80 درجة مئوية لاستخدام مريحة.
- يوازن الحل الثالث (EasyComp تحويل كيت) إلى درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة قبل ان يضيف لخلايا الخميرة.
- إضافة 2-2،5 ميكرولتر (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر) من الحمض النووي بلازميد ترميز مراسل (pAS1NB : MT - روزيلا) إلى 1.7 مل العقيمة الإضافية غطاء من البلاستيك أنبوب microcentrifuge.
- إضافة 5 ميكرولتر من تعليق إذابة طازجة من خلايا الخميرة المختصة ومزيج لطيف من قبل pipetting.
- إضافة 50 ميكرولتر الثالث محلول (EasyComp تحويل كيت) ، ودوامة لالمزيج. 1.5) احتضان ردود فعل التحول لمدة 1 ساعة بمعدل 28-30 درجة مئوية مع الخلط قوية كل 15 دقيقة باستخدام خلاط دوامة أو يدويا عن طريق الأنبوب عبها مع الاصبع.
- نقل بعناية الخليط التحول إلى واحدة YMM آغار صفيحة النمو تستكمل مع الحامض الاميني ، ميثيونين واليوراسيل ، وتوزيع بلطف حول الخلايا السطحية للأجار مع نثر الزجاج العقيمة. خلايا الخميرة هشة في هذه المرحلة والتعامل معها لطيف يمكن أن يزيد من غلة transformants.
- احتضان لوحات النمو من 2 إلى 4 أيام في 28-30 درجة مئوية أو حتى تظهر المستعمرات حوالي 2-3 ملم في القطر.
2. مؤكدا التعبير عن روزيلا في خلايا الخميرة
وينبغي قبل الشروع في تجارب مفصلة وأكد أن توطين الصحيح والفعال للتعبير روزيلا.
- استخدام المسواك العقيمة حدد لكل المستعمرات 5 سلالة واحدة من لوحة التحول والخلايا resuspend في 50 ميكرولتر من الماء المعقم في فصل 1.7 مل العقيمة الإضافية غطاء من البلاستيك أنبوب microcentrifuge.
- 10 ميكرولتر مكان كل خلية على تعليق منفصل المسمى شرائح ميكروسكوب (76 × 26 ملم) وتغطية تعليق خلية مع ساترة مربع (22 × 22 ملم).
- فحص الخلايا على الفور لمضان الانبعاثات باستخدام مجهر مضان (على سبيل المثال ، أوليمبوس Fluoview FV500). ابحث عن قوي مضان أخضر وأحمر ووضع العلامات النموذجية للتوطين الميتوكوندريا (الشكل 2B و2C).
- وينبغي تحصين ما تبقى من كل مستعمرة لفحص مضان بهذه الطريقة على لوحة YMM نمو جديدة.
- لوحات في احتضان 28-30 درجة مئوية لمدة 2 ايام حتى مستعمرة ما يقرب من 2-3 مم في القطر.
3. نمو الخلية وتحريض الالتهام الذاتي
يمكن أن يتسبب الالتهام الذاتي باستخدام عدد من الظروف التجريبية المختلفة ، بما في ذلك الدخول في مرحلة ثابتة ، تغيير في مصدر الكربون ، وإدارة rapamycin ، أو الموت جوعا النيتروجين. نستخدم عادة النيتروجين التجويع كأسلوب للحث على mitophagy.
- تلقيح مستعمرة واحدة في 10 مل من وسط النمو تحتوي على الإيثانول والملاحق عونية التغذي المناسبة.
- احتضان ثقافات الخميرة في 28-30 درجة مئوية مع الهز المداري (200 دورة في الدقيقة) لحوالي 48 ساعة. وينبغي أن تكون الخلايا في مرحلة النمو منتصف السجل.
- بيليه الخلايا من عينات 1ml مكررة الثقافة في 1.7 مل العقيمة الإضافية غطاء أنابيب بلاستيكية بواسطة الطرد المركزي الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية وتجاهل طاف دون الإخلال بيليه الخلية.
- غسل خلايا ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر العقيمة التي تلت إعادة تعليق بواسطة الطرد المركزي لإزالة بقايا مedium.
- بعد غسل resuspend الثالثة الخلايا في 100 مل من النمو المتوسطة أو المتوسطة النيتروجين المجاعة.
- إعادة تلقيح الخلايا معلق في 10 مل من وسط النمو طازجة أو 10 مل المتوسطة النيتروجين المجاعة. احتضان مع اهتزاز المدارية 6-12 ساعات للسماح للتحريض mitophagy. بعد تحضير الخلايا جوعا للعرض بواسطة المجهر مضان.
ملاحظة : الوسم من فجوة مع الارجنتين تواجه المركز.
عند تأسيس أول تجربة من المفيد لتأكيد التسليم تحت المجهر مضان من روزيلا إلى فجوة. على الرغم من أن الخميرة هي فجوة كبيرة عضية الموقع الذي غالبا ما يكون من السهل تحديدها بالرجوع إلى الصور المنقولة الضوء ، في بعض سلالات من الخميرة وفقا لبعض الشروط نمو فجوة يمكن أن تكون مجزأة ويصعب العثور عليها.
ويمكن للفجوة المسمى بسهولة باستخدام صبغة الكومارين المستندة إلى فجوة مثل الارجنتين تواجه المركز - (7 - 4 - الأمينية chloromethylcoumarin ، L - أرجينين أميد). عمل البروتياز فجوي على النتائج في وضع العلامات صبغة زرقاء زاهية مضان من فجوة. يمكن أن تكون الانبعاثات الزرقاء تمييزها بسهولة من انبعاثات الأحمر والأخضر من روزيلا 11. وسم مع الارجنتين تواجه المركز ، لا يحتاج إلى أن يقوم بشكل روتيني ، ولكن من المستحسن بالنسبة لأولئك الذين ليسوا مطلعين على الموقع ، وظهور فجوة في الخميرة.
4. وسم من فجوة مع الارجنتين تواجه المركز ،
- إضافة تواجه المركز ، الارجنتين (100 ملي تركيز النهائي) للخلايا النمو أو النيتروجين جوعا ، قبل التصوير. يمكن تحضير المحلول الارجنتين تواجه المركز ، مقدما ، ولكن الحل هو الضوء الحساسة التي تحتاج إلى حمايتها من التعرض للضوء.
- في احتضان 28-30 درجة مئوية مع الهز المداري (200 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل طاف.
- غسل خلايا ثلاث مرات بالماء المقطر العقيمة التي تلت إعادة تعليق بواسطة الطرد المركزي لإزالة الزائدة المتبقية والمتوسطة تواجه المركز ، صبغ الارجنتين.
- تركيب الخلايا للتصوير كما هو موضح أدناه.
5. تركيب خلايا الخميرة الحية ليزر متحد البؤر المسح المجهري (CLSM)
- تذوب 2 ملغ من انخفاض درجة انصهار agarose منفصلة في aliquots 1 مل من النمو المتوسطة والمتوسطة النيتروجين المجاعة التي يحتضنها في 70 درجة مئوية. الحفاظ على agarose المنصهر في 70 درجة مئوية.
- بيليه بلطف الخلايا في 1 مل من aliquots كل ثقافة الخلية بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل supernatants.
- غسل خلايا ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر المعقم بواسطة الطرد المركزي وإعادة تعليق كما في الخطوة 5.2.
- Resuspend الخلايا غسلها في 100 ميكرو لتر من الماء المقطر العقيمة.
- لتركيب خلايا البقعة 20 ميكرولتر من agarose المنصهر على شريحة المجهر والزجاج المسمى (76 × 26 ملم).
- بقعة على الفور 10 ميكرولتر لتعليق الخلية غسلها على السرير agarose.
- غطاء السرير agarose مع ساترة (22 × 22 ملم). والخلايا المنتشرة على سطح agarose تحت ساترة.
- لمنع الجفاف وحركة ساترة أثناء التصوير بعناية ختم حواف ساترة مع طبقة رقيقة من طلاء الأظافر.
- عند طلاء الأظافر جافة تماما (10 دقيقة) الشريحة مستعدة لعرض حذار بواسطة المجهر مضان : طلاء الأظافر يمكن أن يسبب الضرر لأهداف المجهر.
- شنت الخلايا باستخدام هذه التقنية يمكن ملاحظة ما يصل إلى 1 ساعة بعد التركيب.
6. تصور الالتهام الذاتي باستخدام CLSM
ويتم تقييم روتيني مستوى الالتهام الذاتي في عدد السكان من الخلايا من خلال تحديد عدد الخلايا الحمراء تظهر مضان فجوي قبل وبعد تحريض الالتهام الذاتي. مثالي ويتم رصد التقدم من الالتهام الذاتي في الوقت المحدد نقاط التالية تحريض الالتهام الذاتي (الشكل 3). يتم تنفيذ هذا من خلال وضع تصور أفضل عن طريق مجهر المجهر. من المهم أن تستخدم هذه الضوابط الصحيحة (على سبيل المثال ، Δ atg3 متحولة) ، وأنه ضبط المجهر تتغير بين لمراقبة عينات مختلفة (مثل استخدام مرشحات الكثافة محايدة ، واختيار مرشح).
خلايا الخميرة هي صغيرة نسبيا تتطلب نوعية جيدة مضان المجهر (على سبيل المثال ، أوليمبوس Fluoview FV500) مجهزة الإثارة / الانبعاثات مرشحات مناسبة لتصور منفصلة و / أو GFP pHluorin (مخضر الانبعاثات) (FITC فلتر) وDsRed.T3 (أحمر مضان الانبعاثات) (TRITC فلتر).
- الهدف باستخدام المياه 60x عرض غير تجويع خلايا النوع البري باستخدام مرشحات FITC بالتناوب وTRITC. وينبغي أن خلايا النوع البري المعرض توزيع نموذجي الخلوية من الميتوكوندريا في محيط الخلايا التي تظهر على حد سواء مضان أحمر وأخضر. علما بأن هذا التوزيع للالميتوكوندريا يتوقف على pinhأوله وضع المجهر مبائر. نستخدم عادة قيمة أقل من 125 ميكرون الثقب الذي يسمح فقط لاحظ الميتوكوندريا على شكل سلسلة من النقاط المترجمة في محيط الخلية (الشكل 2C) بحيث لا تحجب فجوة 12. إذا تم استخدام قيمة عالية من ثقب الدبوس (200 ميكرون) وهذا يسمح للشبكة نموذجية الميتوكوندريا الخيطية وزعت في جميع أنحاء الخلية (والتغييرات التي يمر) لوحظ أن 11. وينبغي أن تكون هناك هياكل أخرى في الخلية fluorescently المسمى.
- عرض تسلسلي للخلايا كل نقطة من النقاط الزمنية التالية لنقل متوسطة المجاعة. تصور بالتناوب باستخدام مرشحات الانبعاثات الأخضر والأحمر. المجاعة في الوقت ح 6 مضان أحمر النقطة ، ولكن لا ينبغي أن يكون انبعاث المناظرة الخضراء ملحوظ في فجوة. يمكن توطين فجوي أكدت بشكل منفصل باستخدام تواجه المركز ، الارجنتين (الشكل 2C). عرض ~ 200 عدد الخلايا والرقم الذي يظهر فقط مضان أحمر في فجوة (أي امتصاص فجوي من الميتوكوندريا).
- العد تراكم فجوي لجميع نقاط مراقبة الوقت> 200 الخلايا ومن ثم نسبة مؤامرة من الخلايا تظهر تراكم فجوي.
- فحص خلايا الالتهام الذاتي السيطرة السلبية معربا عن MT - روزيلا قبل المجاعة والموت جوعا بعد 6 ساعات.
7. ممثل النتائج :
هنا ، علينا اظهار نتائج نموذجية تم الحصول عليها باستخدام MT - روزيلا ، التي أعرب عنها في نوع البرية وΔatg3 خلايا متحولة. في ظل ظروف المتنامية مع الايثانول كمصدر الكربون ، وكلاهما نوع البرية وΔatg3 خلايا متحولة المعرض توزيع الخلوية من مضان (الأحمر والأخضر) نموذجية من الميتوكوندريا في خلايا الخميرة. لم يتم الكشف عن أحمر وأخضر الانبعاثات مضان في فجوة (الشكل 2B و2C). عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين لمدة 6 ساعات ثم وخارجها ، بالإضافة إلى مضان أحمر وأخضر الموافق الميتوكوندريا ، وخلايا نوع البرية أيضا يحمل تراكم الحمراء ، ولكن لا مضان أخضر في التجويف فجوي (الشكل 2B ؛ الشكل 3) . ومع ذلك ، في Δatg3 خلايا متحولة مضان أحمر ولا أخضر ولا يتراكم في التجويف فجوي (الشكل 2C ؛ الشكل رقم 3).
الشكل 1. أعلى ، مخطط العضيات ومقصورات في خلية الخميرة. ويقدم الجزء السفلي ، وهو رأي فجوة مركزية لخلية الخميرة مشيرا إلى تدهور autophagic العضيات المختلفة والمقصورات. بعض الاختلافات بين أنواع محددة عضية مختلفة من الالتهام الذاتي (على سبيل المثال ، mitophagy ، nucleophagy) تشمل النوعية (اختيار البضائع) من محتويات غارقة ، والاحتياجات المختلفة داخل الخلايا والعظة خارج الخلية (على سبيل المثال ، والتجويع ، والضرر) ، وإشارات محددة ، ATG الجينات والتبعية الوقت.
الشكل 2. (أ) تمثيل تخطيطي للMT - روزيلا. يتم استخدام تسلسل زعيم الميتوكوندريا (في هذه الحالة من سينسيز سيترات) لاستهداف جهاز الاستشعار البيولوجي روزيلا إلى المصفوفة الميتوكوندريا. يشار إلى الإثارة وانبعاث ماكسيما لبروتين فلوري كلا الحمراء (DsRed.T3) والبروتينات الفلورية الخضراء (pHluorin). عند درجة الحموضة العالية (8.2 درجة الحموضة ~ الميتوكوندريا) وجهاز الاستشعار البيولوجي تتفلور كلا اللونين الأحمر والأخضر ، ولكن ، في انخفاض الرقم الهيدروجيني (درجة الحموضة فجوي ~ 5.5) فإنه تتفلور الحمراء فقط (باء) التمثيل التخطيطي للنتائج المتوقعة في نوع البرية وΔ atg3 معربا عن الخلايا الطافرة MT - روزيلا (C) النتائج الفعلية التي حصلت عليها CLSM للخلايا نوع البرية تحت ظروف المجاعة المتزايدة والنيتروجين. من اليسار إلى اليمين : مدينة دبي للإنترنت (الاختلاف في المقابل) ، RFP (DsRed.T3) مضان الانبعاثات ، GFP (pHluorin) مضان الانبعاثات ، والارجنتين تواجه المركز ، وصورة مضان دمج (D) النتائج الفعلية التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري لمضان Datg3 الخلايا الطافرة تحت المتنامية وظروف المجاعة النيتروجين. من اليسار إلى اليمين : مدينة دبي للإنترنت (الاختلاف في المقابل) ، RFP (DsRed.T3) مضان الانبعاثات ، GFP (pHluorin) مضان الانبعاثات ، والارجنتين تواجه المركز ، وصورة مضان الدمج.
الشكل 3 ، وتبلغ نسبة النوع البرية وΔ atg3 خلايا متحولة ، معربا عن MT - روزيلا ونمت في ظل المجاعة النيتروجين ، والتي تبين مضان أحمر في فجوة على مدى دوام 48 ساعة. وسجلت نسبة الخلايا تظهر تراكم مضان أحمر في فجوة في 0 ، 6 ، 24 ، 12 و 48 ساعة بعد بدء التجويع النيتروجين.
Discussion
في الصور المعروضة في شكل تمثيلية. ويمكن 2B 2C يمكن ان ينظر اليها بشكل واضح أن استخدام عضية محددة للصحفيين الفلورسنت ومضان المجهري توفر أدلة على توطين الميتوكوندريا / التوزيع في كل من النمو والخلايا النيتروجين المتعطشة ، ويسمح mitophagy أن تصور.
فمن ينبغي التأكيد على أن لا يقتصر هذا الأسلوب لmitophagy التالية. يمكن رصد الالتهام الذاتي من المكونات الخلوية الأخرى أو العضيات (على سبيل المثال ، ريبوسوم ، قطرات الدهون ، peroxisomes ، شبكية هيولي باطني والنواة) مع وضع العلامات المناسبة. وقد ذكرت تفاصيل عن بناء جهاز الاستشعار البيولوجي روزيلا ، والظروف والنتائج خلية ثقافة نموذجية لدوران النواة (nucleophagy) 11،12 توضح التوسع في تطبيق الأسلوب.
استخدام عضية محددة للصحفيين الفلورسنت لرصد الالتهام الذاتي يتطلب أن تبقى عدة اعتبارات تصميم بناء في الاعتبار. وهذه تشمل : (1) اختيار والانصهار في إشارة إلى مناسبة تستهدف تحقيق عضية محددة الاستهداف ؛ (2) اختيار البروتين الفلوري المناسبة (ق) ، (3) الانبعاثات مضان قوية ؛ (4) توطين عضية الصحيح و / أو التوزيع داخل الخلية. بمجرد مراسل عضية محددة أعرب بنجاح في استضافة الخميرة اختيار سلالة المجموعة الثانية من الاعتبارات يصبح : (1) ظروف نمو الخميرة ، (2) إعداد نموذج الخلية ؛ (3) معلمات التصوير كما أنه من المهم أن المعلمات المختارة لCLSM (على سبيل المثال ، وكثافة الليزر ، وفحص معدل واسطة ، قيمة ذات الثقب ، وقيمة التكبير وأهدافها المستخدمة أو التعرض للكاميرا CCD) تمسك طوال تجربة ضمان إمكانية إجراء مقارنات بين السيطرة (خلايا النمو) وعينات جوعا ؛ ( 3) الحث الالتهام الذاتي وناجحة تسليم الصحفي إلى فجوة.
عموما ، هذا الأسلوب المجهري الفلورسنت سهلة وسريعة نسبيا ، والتطبيق المحتمل لفحص إنتاجية عالية على المخدرات الرواية التي تعزز أو تعيق الالتهام الذاتي ، وأيضا عن الجينات التي تنظم أو تعدل الالتهام الذاتي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق البحث الاسترالي غرانت DP0986937 المجلس.
References
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, 280-293 (2010).
- Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. Monitoring mitophagy in yeast. Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).
- Yen, W. L., Klionsky, D. J. How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging. Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).
- Tolkovsky, A. M. Mitophagy. Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).
- Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. Mitophagy in yeast: actors and physiological roles. FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).
- Kanki, T., Klionsky, D. J. The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast. Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).
- Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy. Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).
- Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags. Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, 205-213 (2008).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
