효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Summary

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

Abstract

Autophagy 다른 조건의 범위에 따라 세포 구성 요소의 매출에 중요합니다. 그것은 필수적인 생체 항상성 기능뿐만 아니라 대상과 선택 organelles1 - 4를 포함한 세포 물질을 저하시킬 수 품질 관리 메커니즘을 제공합니다. 예를 들어, 손상되거나 (그림 1) mitochondria 중복, autophagy에 의해 세포 항상성 및 세포 생존에 위협을 표현할 수 처리되지 않습니다. 효모에서 Saccharomyces cerevisiae, 영양 부족 (예 : 질소 기아) 또는 손상이 mitophagy ^5-9 칭했다 과정에서 autophagy에 의해 mitochondria의 선택 매상을 올릴 수 있습니다.

우리는 autophagy 평가하는 간단한 형광 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 지혜로움에 대해 우리는 접근이 효모 세포에서 mitophagy을 모니터링하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다 여기에 우리의 설명을 제한할 수 있습니다. 분석은 산도에 민감한 녹색 형광 단백질에 연결된 비교적 산도 - 안정적인 빨간색 형광 단백질로 구성된 이중 방출 바이오 센서는 형광등 기자 로젤라의 사용합니다. 이 기자의 작업은 살아있는 세포의 공포 (산도 ~ 5.0-5.5)과 mitochondria (산도 ~ 8.2) 사이의 산도의 차이에 의존합니다. 재배 조건에서 야생 타입 세포의 mitochondria의 방식 특성 배포 모두 빨간색과 초록색 형광을 나타냅니다. 형광 방출은 공포와 관련되지 않습니다. 질소 기아, mitochondria에 레이블 빨간색과 초록색 형광 이외에, mitophagy 유도 상태를 받게되면 세포는 공포에 mitochondria의 배달을 나타내는 산성 vacuolar 루멘으로, 빨간색의 축적을 전시하지만, 녹색하지 형광. 빨간색과 세포를 채점하지만, 녹색 형광하지 vacuoles은 세포 ^5,10-12에 mitophagic 활동의 측정으로 사용할 수 있습니다.

Protocol

적합한 제어 효모 종자 선택

분석 시각 효모 공포의 빨간 형광의 축적을 평가 실험자에 의존합니다. 이러한 분석은 주관적이고 적절한 제어 계통 및 성장 조건의 선택에 의존으로. 야생 타입 컨트롤은 autophagy 일반적으로 기대의 수준을 표시하는 데 사용됩니다. 대조군으로 핵심 autophagy 유전자 (예, ATG3) 중 하나의 표현을위한 스트레인 NULL이 적합한지, 같은 계통의 공포로 (예 : mitochondria, 핵) 자료를 제공할 수 없습니다

1. 플라스미드 DNA와 효모 세포의 변형

효모 세포는 쉽게 LiAcetate과 치료에 의해 변형에 대한 관할 할 수 있습니다. 상업 키트 구입 (예 : EasyComp, Invitrogen)와 출판 프로토콜 ¹³ 사용할 수 있습니다있을 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 야생 유형 변형 BY4741 (MAT his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)를하고,에서 파생된 삭제 돌연변이 변종 (예 : Δ atg3), 다른 중요하지 않은 유전자의 각 부족한 표현의 종합 라이브러리의 일부 멤버를 사용합니다. 삭제 변형 라이브러리 로젤라 기반 프로브를 사용하여 autophagy에 대해 조사를위한 유용한 도구를 나타냅니다. MT - 로젤라 ¹² :이 프로토콜의 고용 기자 pAS1NB로 인코딩된 mitochondria를위한 MT - 로젤라 (그림 2A)입니다.

다음 단계는 EasyComp 변환 키트를 사용 ° C 편리하게 사용할 수 있도록 -80에서 냉동 보관 능력이 만들어진 세포의 사용을 기반으로합니다.

1. 삼십분 효모 세포에 추가하기 전에 실내 온도 솔루션 III를 (EasyComp 변환 키트) 평형.
2. 멸균 1.7 ML 스냅 캡 플라스틱 microcentrifuge 관에 : 기자를 인코딩 플라스미드 DNA (MT - 로젤라 pAS1NB)의 2-2.5 μl를 (~ 100 NG / μl)을 추가합니다.
3. 관할 효모 세포 부드러운 pipetting으로 혼합의 신선한 해동 정지 5 μl를 추가합니다.
4. 50 솔루션 III의 μl (EasyComp 변환 키트)와 섞어 와동을 추가합니다. 1.5) 활발한는 또는 수동으로 손가락으로 튜브를 flicking하여 와동 믹서를 사용하여 15 분 간격으로 혼합과 28-30 ° C에서 1 시간 동안 변환 반응을 품어.
5. 조심스럽게 단일 YMM 한천 성장 메티오닌 히스티딘과 보충 판, 그리고 유라실로 변환 혼합물을 전송하고, 부드럽게 살균 유리 확장기로 한천의 표면에 주변의 세포를 배포합니다. 효모 세포는이 단계에서 연약하고 부드러운 처리 transformants의 수율을 증가시킬 수 있습니다.
6. 28-30 ° C에서 2~4일 또는 식민지 직경 2-3밀리미터에 대한 나타날 때까지 성장 번호판을 품어.

2. 효모 세포의 로젤라의 표현을 확인

자세한 실험에 착수하기 전에 올바른 현지화 및 로젤라의 효율적인 표현이 확인되어야합니다.

1. 멸균 이쑤시개를 사용하면 별도의 멸균 1.7 ML 스냅 캡 플라스틱 microcentrifuge 관에 멸균 물을 50 μl의 변환 판과 resuspend 세포의 각 변형 5 단일 식민지에 대한 선택합니다.
2. 플레이스 열 별도의 표시 유리 현미경 슬라이드 (76 X 26mm)로 각각의 세포 현탁액의 μl와 광장 coverslip (22 X 22mm)와 세포 현탁액을 커버.
3. 즉시 형광 현미경 (예 : 올림푸스 Fluoview FV500)를 사용하여 형광 방출에 대한 세포를 검사합니다. 강한 녹색과 적색 형광 및 mitochondrial 현지화 (그림 2B와 2C)의 전형적인 라벨을 찾습니다.
4. 이런 방식으로 형광을위한 검사 각 식민지의 나머지 부분은 신선한 YMM 성장 플레이트에 주사해야합니다.
5. 2 일 28-30 ° C에서 품어 번호판은 식민지까지 직경 약 2-3mm 있습니다.

3. 세포 성장과 autophagy의 유도

Autophagy는 고정 위상, 탄소 소스, rapamycin의 관리, 또는 질소 기아의 변화에​​ 항목을 포함하여 다양한 실험 조건의 번호를 사용하여 유도된 수 있습니다. 우리는 일상적으로 mitophagy 유도하는 방법으로 질소 기아를 사용합니다.

1. 에탄올을 포함하는 성장 매체와 적절한 auxotrophic 보조 10 ML에 하나의 식민지의 예방.
2. 약 48 시간 동안 궤도 흔들림 (200 RPM)와 28-30 ° C에서 효모 문화를 품다. 세포 중순 로그 성장 단계에 있어야합니다.
3. 실온에서 2 분간 원심 분리 2,000 XG에 의해 멸균 1.7 ML 스냅 캡 플라스틱 원심 분리기 튜브의 문화의 중복 1ml 샘플에서 세포 펠렛. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 제거하고 폐기.
4. 잔류 m을 제거하는 원심 분리하여 다음 resuspension로 1 ML 멸균 증류수로 셀에 세 번 씻어edium.
5. 세 번째 세차 성장 매체 또는 질소 기아 매체의 100 ML에있는 세포를 resuspend 후.
6. 신선한 성장 매체 또는 10 ML 질소 기아 매체의 10 ML에 resuspended 세포를 다시 접종. mitophagy의 유도를 허용하도록 6-12 시간 동안 궤도 잡고 알을 품다. 이후 기아는 형광 현미경으로보기 위해 세포를 준비합니다.

참고 : CMAC - ARG과 공포의 라벨링

먼저 분석을 설정할 때 그것은 공포에 로젤라의 형광 현미경 전달에 따라 확인하는 데 유용합니다. 효모 공포는 그의 위치를​​ 자주 쉽게 공포가 찾아 조각하고 어려울 수 있습니다 효모의 일부 변종과 일부 성장 조건 하에서 전송 빛의 이미지, 참조에 의해 결정 수있는 대형 organelle지만.

공포는 쉽게 이러한 CMAC - ARG (7 - 아미노 -4 - chloromethylcoumarin, L - 아르기닌 아미드)로 coumarin 기반 공포 염료를 사용하여 표시하실 수 있습니다. 공포의 밝은 파란색 형광 라벨의 염색 결과에 vacuolar 프로 테아제의 작용. 파란색 방출은 쉽게 로젤라 ¹¹ 빨간색과 녹색 배출 구별하실 수 있습니다. CMAC - ARG와 라벨링하는 것은 정기적으로 수행 할 필요가 없다지만, 이것은 효모에있는 공포의 위치와 모양에 익숙하지 않은 사람들을 위해 권장됩니다.

4. CMAC - ARG과 공포의 라벨링

1. 이전 이미지로 성장 또는 질소에 굶주린 세포에 CMAC - ARG (100 MM 최종 농도)를 추가합니다. CMAC - ARG 솔루션은 사전에 준비하지만, 솔루션이 빛을 구분합니다 그것이 빛에 노출으로부터 보호되어야 수 있습니다.
2. 30 분 궤도 흔들림 (200 RPM)와 28-30 ° C에서 알을 품다.
3. 실온에서 2 분간 원심 분리 2,000 XG에 의해 펠렛 세포.
4. 뜨는 폐기하십시오.
5. 잔여 매체 및 초과 CMAC - ARG 염료를 제거하는 원심 분리하여 다음 resuspension하여 멸균 증류수로 셀에 세 번 씻으십시오.
6. 아래에 설명된대로 영상에 대한 세포를 탑재합니다.

5. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 장착 라이브 효모 세포 (CLSM)

1. 70 ° C.의 잠복기로 성장 매체와 질소 기아 매체 별도의 한 ML의 aliquots에서 낮은 용해 점 아가로 오스 2 MG를 용융 용융 아가로 오스는 70 유지 ° C.
2. 부드럽게 펠렛은 실온에서 2 분 동안 2,000 XG에서 원심 분리하여 각 세포 배양 1 ML aliquots의 세포와 supernatants 폐기하십시오.
3. 단계 5.2로 resuspension하고 원심 분리로 1 ML 멸균 증류수로 셀에 세 번 씻으십시오.
4. 멸균 증류수 100 μl에 씻어 세포를 Resuspend.
5. 표시 유리 현미경 슬라이드 (76 X 26mm)에 용융 아가로 오스의 세포 명소​​ 20 μl를 마운트하려면 다음과 같이하십시오.
6. 바로 아가로 오스 침대에 씻어 세포 현탁액의 10 μl를 현장.
7. coverslip (22 X 22mm)와 아가로 오스 침대 커버. 세포는 coverslip 아래 아가로 오스 표면에 분산됩니다.
8. 이미징 동안 coverslip의 탈수와 움직임을 방지하기 위해주의 깊게 매니큐어의 얇은 필름으로 coverslip의 가장자리를 밀봉.
9. 매니큐어가 완전히 건조되면 (10 분) 슬라이드는 형광 현미경의주의로 볼 수있는 준비가되어 : 매니큐어 현미경 목표에 손상을 일으킬 수 있습니다.
10. 세포는이 기술을 사용하는 것은 장착 후 최대 1 시간까지 관찰할 수있다 탑재.

6. CLSM을 사용 떠올리 autophagy

세포의 인구에 autophagy의 수준은 일상적 전에 붉은 vacuolar 형광을 보여주는 세포의 수를 결정하여 및 autophagy의 유도 후 평가됩니다. 이상적으로 autophagy의 진행은 autophagy의 유도 (그림 3) 다음 선택한 시간 지점에서 모니터링합니다. 이것은 가장 현미경 쌍안경을 통해 시각에 의해 수행됩니다. 그것은 올바른 컨트롤이 고용 (예를 들어, Δ atg3 돌연변이)와 현미경 설정 서로 다른 샘플을 (예를 들어, 중성 농도 필터, 필터 선택 사용) 관찰 사이에 변경되지 않은 상태로 유지되는 것을 중요합니다.

GFP 및 / 또는 pHluorin (녹색 형광 방출) (FITC 필터)와 DsRed.T3 (적색의 별도의 시각화에 적합한 여기 / 발광 필터를 갖춘 양질의 형광 현미경 (예, 올림푸스 Fluoview FV500) 필요한 효모 세포는 상대적으로 작은 형광 방출) (TRITC 필터).

1. 교대 FITC와 TRITC 필터를 사용하지 않는 굶주린 야생 타입 세포는 60x 물 객관적으로보기를 사용합니다. 와일드 타입 전지는 빨간색과 초록색 형광을 모두 보여 세포의 주변에서 mitochondria의 전형적인 세포 분포를 전시한다. mitochondria의 배포는 pinh 의존됩니다공촛점 현미경의 OLE 설정합니다. 우리는 일반적으로 단지 mitochondria은 공포가 ¹² 왜곡되지 않도록 세포의 주변 (그림 2C)에서화된 점들의 연속으로 관찰 수 있습니다 125 μm의의 낮은 핀홀 값을 사용합니다. 높은 핀홀 값 (200 μm의)가 사용되는 경우 이것은 전형적인 filamentous mitochondrial 네트워크가 ¹¹ 관찰하는 (그리고 그것이 겪습 변경) 세포에 걸쳐 분산 수 있습니다. 감방에 다른 구조는 찬란 표시되지 않을 것입니다.
2. 순차적으로 기아 매체로 전송 다음 시간 포인트 각각의 세포를 볼 수 있습니다. 녹색과 빨간색 방사 필터를 사용하여 교대로 시각화. 6 H의 스타 베이션 시점 붉은 형광에, 해당하는 녹색 발광은 공포에 뚜렷한 없어야합니다. Vacuolar 지방화는 별도 CMAC - ARG (그림 2C)를 사용하여 확인하실 수 있습니다. 보기 ~ 200 세포와 공포 (mitochondria의 예 vacuolar 이해)에서만 붉은 형광을 표시 번호를 계산합니다.
3. > 200 세포 그리고 vacuolar 축적을 보여주는 세포의 플롯 비율을 관찰 모든 시간 지점 vacuolar 축적을 계산합니다.
4. 기아 전에 MT - 로젤라을 표현 6 H의 기아를 따라 autophagy - 대조군의 세포를 검사합니다.

7. 대표 결과 :

여기서 우리는 야생 유형과 Δatg3 돌연변이 세포로 표현 MT - 로젤라를 사용하여 얻은 전형적인 결과를 보여줍니다. 에탄올과 성장 조건 하에서 탄소 소스로, 야생 입력하고 Δatg3 돌연변이 세포 모두 효모 세포의 mitochondria의 전형적인 형광 (빨간색과 녹색)의 세포 분포를 나타냅니다. 적색과 녹색의 형광 방출은 공포 (그림 2B와 2C)에서 감지되지 않습니다. 6 H와에 대한 질소 기아를 받게되면 (그림 2B.; 그림 3) 다음 이상, mitochondria에 해당하는 적색과 녹색의 형광 이외에, 야생 입력 전지는 빨간색의 축적을 전시지만, vacuolar 루멘 녹색으로하지 형광 . 그러나, Δatg3 돌연변이 세포에 빨간색이나 녹색 형광도는 vacuolar 루멘 (.; 그림 3 그림 2C)에 축적.

그림 1. 톱, 효모 세포에 organelles과 구획의 계획. 바텀, 효모 세포의 공포 중심의보기가 다른 organelles과 구획의 autophagic 저하를 나타내는 제공됩니다. autophagy (예 : mitophagy, nucleophagy)의 다양한 organelle 특정 유형 간의 차이점 중 일부가 가득 채우고 그 내용의 특이성 (화물 선택), 다양한 세포 내 요구와 세포외 신호 (예, 기아, 손상), 특정 신호 ATG를 포함 유전자와 시간 의존성.

그림 2. MT - 로젤라의 (A) 도식 표현. mitochondrial 리더 시퀀스 (구연 산염의 synthase의 경우) mitochondrial 매트릭스에 로젤라 바이오 센서를 대상으로하는 데 사용됩니다. 여기 붉은 형광 단백질 (DsRed.T3)와 녹색 형광 단백질 (pHluorin) 모두 방출 맥시멈가 표시됩니다. 높은 PH (mitochondrial 산도 ~ 8.2)에서 바이오 센서는 단 빨간색 fluoresces 낮은 PH (vacuolar 산도 ~ 5.5)에서, 그러나, 적색과 녹색의 두 fluoresces. 표현 야생 유형과 Δ atg3 돌연변이 세포의 예상 결과 (B) 도식 표현은 MT - 로젤라. (C) 실제 결과는 야생의 성장에 따라 입력 셀 및 질소 기아 조건에 대한 CLSM에 의해 얻은. 왼쪽에서 오른쪽으로 :. DIC (명암의 차이), RFP (DsRed.T3) 형광 방출, GFP (pHluorin) 형광 발광, CMAC - ARG 형광 및 병합 이미지 (D) 실제 결과는 아래 Datg3 돌연변이 세포에 대한 형광 현미경에 의해 얻은 성장과 질소 기아 조건. 왼쪽에서 오른쪽으로 : DIC (반대로 차이), RFP (DsRed.T3) 형광 방출, GFP (pHluorin) 형광 발광, CMAC - ARG 형광 및 병합 이미지.

그림 3. 48 시간의 시간 과정을 통해 공포의 붉은 형광을 보여주는 MT - 로젤라을 표현하고 질소 기아에 따라 성장 야생 유형과 Δ atg3 돌연변이 세포의 비율입니다. 공포의 빨간 형광의 축적을 보여주는 세포의 비율은 질소 기아를 시작 후 0, 6, 12, 24 및 48 시간에 기록되었다.

Discussion

그림에 표시되는 대표적인 이미지. 2B와 2C 그것은 명확하게 organelle 특정 형광 기자와 형광 현미경의 사용이 증가하고 질소에 굶주린 세포 모두에서 mitochondrial 지역화 / 유통의 증거를 제공하고 시각으로 mitophagy 허용 볼 수 있습니다.

그것은이 방법은 다음과 mitophagy로 제한 아니라는 것을 강조해야하는 것입니다. 다른 세포 구성 요소 또는 organelles (예 : 리보솜, 지질 방울, peroxisomes, endoplasmic reticulum 및 핵)의 Autophagy가 적합한 분류로 모니터링할 수 있습니다. 로젤라 바이오 센서 구조, 세포 배양 조건과 핵의 매출 (nucleophagy)에 대한 전형적인 결과의 세부 내용은 방법의 광범위한 응용 프로그램을 설명하는 ^{11,12보고되었습니다.}

모니터링 autophagy에 대한 organelle 특정 형광 기자의 이용은 구조 설계의 몇 가지 고려 사항을 염두에 보관해야합니다. 이들은 다음과 같습니다 (1) organelle 특정 타겟팅을 달성하기 위해 적절한 타겟팅 신호 선택 및 퓨전, 적합한 형광 단백질 (S) (2) 선택 (3) 강한 형광 방출 (4) 올바른 organelle의 현지화 및 / 또는 세포 내에 분포. 일단 organelle 특정 기자가 성공적으로 고려되는 두 번째 그룹의 변형율 선택한 효모 호스트 표현되었습니다 (2) 세포 샘플 준비, (1) 효모의 성장 조건 (3) 영상 매개 변수는 매개 변수를 선택하는 것이 중요합니다 같은 CLSM (예, 레이저 강도, 스캔 속도 및 모드, 핀홀 값, 줌 값 사용 목적 또는 CCD 카메라에 대한 노출) 비교가 컨트롤 (성장 세포)와 굶어 샘플 사이에 만들 수 있도록 실험을하는 동안 유지되며 ( 공포에 기자 3) autophagy 유도하고 성공적으로 배달.

전체적으로이 형광 현미경 방법은 비교적 빠르고, 간단하고, 규제 또는 autophagy 조절 유전자 또한 강화하거나 억제 autophagy를하고, 새로운 약물에 대한 높은 처리량 검사에 대한 잠재적인 응용 프로그램을하고 있습니다.