Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Summary

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Abstract

Autofagia é importante para o volume de negócios de componentes celulares em uma série de condições diferentes. Serve uma função essencial homeostáticos, assim como um mecanismo de controle de qualidade que podem degradar-alvo e seletivamente material celular incluindo organelles1-4. Por exemplo, danificadas ou redundantes mitocôndrias (Fig. 1), não eliminados por autofagia, pode representar uma ameaça à homeostase celular e sobrevivência da célula. Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, a privação de nutrientes (por exemplo, privação de nitrogênio) ou danos pode promover a rotatividade seletiva da mitocôndria por autofagia em um processo denominado mitophagy ^5-9.

Descrevemos uma abordagem de microscopia de fluorescência simples para avaliar a autofagia. Para maior clareza nós restringimos nossa descrição aqui para mostrar como a abordagem pode ser usada para monitorar mitophagy em células de levedura. O ensaio faz uso de um repórter fluorescente, Rosella, que é um biosensor dupla emissão compreendendo um pH relativamente estável proteína fluorescente vermelha ligada a um pH-sensíveis proteína verde fluorescente. A operação deste repórter se baseia em diferenças de pH entre o (pH ~ 5,0-5,5) e vacúolo (pH ~ 8,2) mitocôndrias nas células vivas. Sob condições de cultivo, as células do tipo selvagem exibem tanto fluorescência vermelha e verde distribuída em uma maneira característica da mitocôndria. Emissão de fluorescência não é associado com o vacúolo. Quando submetido a privação de nitrogênio, uma condição que induz mitophagy, além de fluorescência vermelha e verde rotulagem das mitocôndrias, as células apresentam o acúmulo de vermelho, mas não de fluorescência verde, na luz ácida vacuolar representando a entrega das mitocôndrias para o vacúolo. Marcar células com vermelho, verde, mas não vacúolos fluorescente pode ser usado como uma medida de atividade em células mitophagic ^5,10-12.

Protocol

Seleção de cepas de leveduras adequadas de controle

O ensaio conta com o experimentador avaliar visualmente o acúmulo de fluorescência vermelha no vacúolo levedura. Como tal, o ensaio é subjetiva e depende da seleção de estirpes de controlo adequado e condições de crescimento. Um controle do tipo selvagem é usado para indicar os níveis de autofagia normalmente esperado. Como controle negativo uma cepa nulo para a expressão de um dos genes do núcleo autofagia (por exemplo, ATG3) é adequado; cepas tal não pode entregar material (por exemplo, as mitocôndrias, núcleo) para o vacúolo

1. Transformação de células de levedura com o DNA do plasmídeo

Células de levedura pode ser feita facilmente competentes para transformação por tratamento com LiAcetate. Kits comerciais podem ser comprados (por exemplo, EasyComp, Invitrogen) e protocolos publicados estão disponíveis ^13.

Neste protocolo utilizamos cepa selvagem BY4741 (MAT uma his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), e alguns membros de uma biblioteca abrangente de cepas mutantes de deleção (por exemplo, Δ atg3) derivados dela, cada expressão falta de um gene não essenciais diferentes. A biblioteca de tensão exclusão representa uma valiosa ferramenta para a investigação de autofagia usando Rosella baseado em sondas. O repórter empregada neste protocolo é mt Rosella para mitocôndrias (Fig. 2A), codificada pelo pAS1NB: mt-Rosella ^12.

Os passos seguintes são baseados no uso de células competentes fez usando o Kit de Transformação EasyComp e armazenadas congeladas a -80 ° C para uso conveniente.

1. Equilibrar Solução III (EasyComp Transformação Kit) à temperatura ambiente 30 minutos antes de adicionar a células de levedura.
2. Adicionar 2-2,5 mL (~ 100 ng / L) de DNA plasmídeo codificando o repórter (pAS1NB: mt-Rosella) para um 1,7 ml estéril pressão cap-tubo de microcentrífuga de plástico.
3. Adicionar 5 mL de suspensão recém-descongelado de células de levedura competentes e misture por pipetagem suave.
4. Adicionar 50 ml de solução III (EasyComp Transformação Kit) e vortex para misturar. 1.5) Incube as reações de transformação para uma hora a 28-30 ° C com vigorosa mistura a cada 15 minutos usando um mixer vortex ou manualmente por flicking o tubo com o dedo.
5. Transferir cuidadosamente a mistura de transformação para uma placa de crescimento YMM única agar suplementado com histidina, metionina e uracila, distribuir e suavemente as células ao redor da superfície do ágar com um espalhador de vidro estéril. Células de levedura são frágeis nesta fase e manuseio suave pode aumentar o rendimento de transformantes.
6. Incubar as placas de crescimento para 2 a 4 dias a 28-30 ° C ou até colônias aparecem cerca de 2-3 mm de diâmetro.

2. Confirmando expressão de Rosella em células de levedura

Antes de embarcar em experimentos detalhados a localização correta e expressão eficiente de Rosella devem ser confirmados.

1. Usando palitos estéreis selecionar para cada cepa cinco colônias único da placa de transformação e ressuspender as células em 50 mL de água estéril em separado 1,7 ml estéril pressão cap-tubo de microcentrífuga de plástico.
2. Lugar mL 10 de cada suspensão de células para separar as lâminas de vidro rotulados microscópio (76 x 26 mm) e cobrir a suspensão de células com uma lamela quadrados (22 x 22 mm).
3. Examinar imediatamente as células para emissão de fluorescência utilizando um microscópio de fluorescência (por exemplo, a Olympus FluoView FV500). Procure por fluorescência verde e vermelho forte e rotulagem típico de localização mitocondrial (Fig. 2B e 2C).
4. O restante de cada colônia examinados para fluorescência desta forma deve ser inoculado em um prato doce YMM crescimento.
5. Incubar as placas a 28-30 ° C por 2 dias até colônia são aproximadamente 2-3 mm de diâmetro.

3. Crescimento celular e indução de autofagia

Autofagia pode ser induzida pelo uso de um número de diferentes condições experimentais, incluindo entrada em fase estacionária, mudança na fonte de carbono, a administração de rapamicina, ou privação de nitrogênio. Nós usam rotineiramente privação de nitrogênio como o método para induzir mitophagy.

1. Inocular uma única colônia em 10 ml de meio de crescimento contendo etanol e os suplementos apropriados auxotróficos.
2. Incubar as culturas de levedura a 28-30 ° C com agitação orbital (200 rpm) por aproximadamente 48 horas. As células devem ser em meados de log-fase de crescimento.
3. Pellet de células duplicadas amostras de 1ml da cultura em 1,7 ml estéril pressão cap-tubos plásticos de centrífuga por centrifugação a 2000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente. Remova e elimine cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
4. Lave as células três vezes com 1 ml de água estéril destilada por ressuspensão seguida de centrifugação para remover m residualedium.
5. Após a terceira lavagem ressuspender as células em 100 ml de meio de crescimento ou nitrogênio fome e médio prazo.
6. Re-inocular as células ressuspendidas em 10 ml de meio de crescimento fresco ou 10 ml de meio de nitrogênio-inanição. Incube com agitação orbital por 6-12 horas para permitir a indução da mitophagy. Depois de fome preparar células para visualização por microscopia de fluorescência.

Nota: Etiquetagem do vacúolo com CMAC-Arg

Ao primeiro, que estabelece o ensaio é útil para confirmar a entrega sob microscópio de fluorescência de Rosella ao vacúolo. Apesar de o vacúolo levedura é uma organela grandes cuja localização pode muitas vezes ser facilmente determinado por referência a transmitiu imagens de luz, em algumas cepas de leveduras e em algumas condições de crescimento do vacúolo pode ser fragmentada e difícil de localizar.

O vacúolo pode ser prontamente rotulados com uma tintura baseada em cumarina vacúolo como CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amida). A ação de proteases vacuolar nos resultados corante azul brilhante na rotulagem fluorescência do vacúolo. A emissão azul pode ser facilmente distinguidas das emissões vermelho e verde de Rosella ^11. Rotulagem com CMAC-Arg não precisa ser realizada rotineiramente, mas é recomendado para aqueles que não estão familiarizados com o local ea aparência do vacúolo em levedura.

4. Rotulagem do vacúolo com CMAC-Arg

1. Adicione o CMAC-Arg (100 mM de concentração final) para as células de crescimento ou nitrogênio de fome antes da imagem. A solução CMAC-Arg pode ser preparado com antecedência, mas como a solução é sensível à luz que precisa ser protegido da exposição à luz.
2. Incubar a 28-30 ° C com agitação orbital (200 rpm) por 30 minutos.
3. Pellet células por centrifugação a 2000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente.
4. Desprezar o sobrenadante.
5. Lave as células três vezes com água destilada estéril por ressuspensão seguida de centrifugação para remover médio residual e excesso CMAC Arg-dye.
6. Montagem das células para criação de imagens como descrito abaixo.

5. Montagem ao vivo células de levedura para microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)

1. Derreta 2 mg de baixo ponto de fusão de agarose em separado um alíquotas ml de meio de crescimento e de nitrogênio fome-meio, incubando a 70 ° C. A agarose fundida é mantida a 70 ° C.
2. Suavemente as células pellet em 1 ml alíquotas de cada cultura de células por centrifugação a 2000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
3. Lave as células três vezes com 1 ml de água estéril destilada por ressuspensão e centrifugação, tal como no passo 5.2.
4. Ressuspender as células lavadas com 100 ml de água destilada estéril.
5. Para montar as células no local 20 l de agarose fundida numa lâmina de vidro rotulados microscópio (76 x 26 mm).
6. Detectar imediatamente 10 ml de suspensão de células lavadas em cima da cama agarose.
7. Cobrir a cama agarose com uma lamela (22 x 22 mm). As células se espalhará por toda a superfície agarose sob a lamínula.
8. Para evitar a desidratação eo movimento da lamela durante a imagem cuidadosamente selar as bordas da lamínula com uma película fina de unha polonês.
9. Quando a unha polonês está completamente seco (10 min) o slide está pronto para ver por microscopia de fluorescência Beware: unha polonês pode causar danos aos objetivos microscópio.
10. Células montado usando esta técnica pode ser observado até uma hora após a montagem.

6. Autofagia visualizar usando CLSM

O nível de autofagia em uma população de células é rotineiramente avaliados através da determinação do número de células mostrando fluorescência vermelha vacuolar antes e após a indução de autofagia. Idealmente, a progressão da autofagia é monitorado em momentos selecionados após a indução de autofagia (Fig. 3). Esta é a melhor realizada através da visualização através do microscópio binocular. É importante que os controles corretos são empregados (por exemplo, Δ atg3 mutantes) e que as configurações microscópio permanecem inalterados entre observar amostras diferentes (por exemplo, o uso de filtros de densidade neutra, seleção de filtro).

Células de levedura são relativamente pequenos que requerem um microscópio de fluorescência de boa qualidade (por exemplo, a Olympus FluoView FV500) equipado com excitação / emissão de filtros adequados para a visualização separada de GFP e / ou pHluorin (verde emissão de fluorescência) (FITC filtro) e DsRed.T3 (vermelho emissão de fluorescência) (TRITC filtro).

1. Usando uma visão objetiva 60x de água não-fome células de tipo selvagem utilizando alternadamente os filtros FITC e TRITC. Células de tipo selvagem deve apresentar uma distribuição típica celulares das mitocôndrias na periferia das células que mostram tanto fluorescência vermelha e verde. Note-se que esta distribuição das mitocôndrias é dependente do pinhole configuração do microscópio confocal. Geralmente usamos um valor menor pinhole de 125 M que só permite a mitocôndria para ser observado como uma série de pontos localizados na periferia da célula (Fig. 2C) de modo que o vacúolo não é obscurecida ^12. Se um valor elevado de pinhole (200 mm) é usado isto permite que a rede filamentosa típica mitocondrial distribuídos por toda a célula (e as mudanças que sofre) a serem observados ^11. Sem outras estruturas na célula deve ser fluorescente etiquetado.
2. Seqüencialmente vista células para cada um dos seguintes momentos de transferência a médio fome. Visualize alternadamente utilizando os filtros de emissão verde e vermelho. Na inanição h 6 de fluorescência tempo ponto vermelho, mas não de emissão correspondentes verde deve ser perceptível no vacúolo. Localização vacuolar pode ser confirmada separadamente usando CMAC-Arg (Fig. 2C). Ver ~ 200 células e contar o número que mostram apenas fluorescência vermelha no vacúolo (ou seja, a captação vacuolar das mitocôndrias).
3. Contagem de acumulação vacuolar para todos os pontos tempo observando> 200 células e, em seguida, percentual lote de células mostrando acúmulo vacuolar.
4. Examinar células autofagia-controlo negativo expressar mt-Rosella antes fome e inanição após 6 h.

7. Resultados representativos:

Aqui, nós mostramos os resultados típicos obtidos utilizando-mt Rosella, expressa no tipo selvagem e Δatg3 células mutantes. Sob condições de crescimento com o etanol como fonte de carbono, tanto do tipo selvagem e Δatg3 células mutantes apresentam uma distribuição celular de fluorescência (vermelho e verde) típico das mitocôndrias nas células de levedura. Vermelho e verde emissão de fluorescência não é detectado no vacúolo (Fig. 2B e 2C). Quando submetido a privação de nitrogênio por 6 h, em seguida, e além, além de fluorescência vermelha e verde correspondente a mitocôndria, células de tipo selvagem também apresentam o acúmulo de vermelho, mas não de fluorescência verde no lúmen vacuolar (Fig. 2B;. Fig. 3) . No entanto, em Δatg3 células mutantes fluorescência vermelhas nem verdes acumula no lúmen vacuolar (Fig. 2C;. Fig. 3).

Figura 1. Top, o esquema de organelas e compartimentos em uma célula de levedura. Fundo, uma visão vacúolo-centric de uma célula de levedura é apresentada indicando degradação autofágica de organelas e compartimentos diferentes. Algumas das diferenças entre os vários tipos de organelas específicas de autofagia (por exemplo, mitophagy, nucleophagy) incluem a especificidade (seleção de carga) do conteúdo engolido, várias necessidades intracelular e extracelular pistas (por exemplo, a fome, danos), sinais específicos, ATG genes ea dependência do tempo.

Figura 2. (A) representação esquemática do mt-Rosella. A seqüência líder mitocondrial (neste caso da citrato sintase) é usado para direcionar o biossensor Rosella para a matriz mitocondrial. Excitação e emissão maxima para ambas as proteínas fluorescentes vermelhas (DsRed.T3) e proteína verde fluorescente (pHluorin) são indicados. Em pH elevado (pH ~ 8,2 mitocondrial), o biosensor fluorescente vermelho e verde, no entanto, em pH baixo (pH vacuolar ~ 5.5) que fluoresce apenas vermelho. (B) Representação esquemática dos resultados esperados no tipo selvagem e atg3 Δ células mutantes expressando mt-Rosella. (C) Os resultados reais obtidos por CLSM de células de tipo selvagem sob crescente e as condições de privação de nitrogênio. Da esquerda para a direita:. DIC (diferença de contraste), RFP (DsRed.T3) emissão de fluorescência, GFP (pHluorin) emissão de fluorescência, CMAC-Arg fluorescência e imagem merge (D) Os resultados reais obtidos por microscopia de fluorescência de células mutantes em Datg3 crescente e as condições de privação de nitrogênio. Da esquerda para a direita: DIC (diferença de contraste), RFP (DsRed.T3) emissão de fluorescência, GFP (pHluorin) emissão de fluorescência, CMAC-Arg fluorescência e imagem fundem.

Figura 3. A percentagem de células do tipo selvagem e mutante Δ atg3, expressando-mt Rosella e cultivadas sob privação de nitrogênio, mostrando fluorescência vermelha no vacúolo durante um curso de tempo de 48 horas. A porcentagem de células mostrando acúmulo de fluorescência vermelha no vacúolo foi gravado em 0, 6, 12, 24 e 48 horas após o início privação de nitrogênio.

Discussion

Nas imagens representativas apresentado na fig. 2B e 2C, pode ser visto claramente que o uso de organela específica repórteres fluorescentes e microscopia de fluorescência fornece evidências da localização mitocondrial / distribuição em ambos os crescentes e nitrogênio de fome as células e permite mitophagy a ser visualizada.

É preciso enfatizar que este método não é restrito a mitophagy seguinte. Autofagia de outros componentes celulares ou organelas (por exemplo, os ribossomos, gotículas lipídicas, peroxissomos, retículo endoplasmático e núcleo) pode ser monitorada com uma rotulagem adequada. Detalhes da construção de biossensor Rosella, as condições de cultura de células e os resultados típicos para o volume de negócios do núcleo (nucleophagy) têm sido relatados ^11,12 ilustrando a aplicação mais ampla do método.

Uso de organela específica repórteres fluorescentes para autofagia monitoramento exige várias considerações de design construto a ser mantido em mente. Estas incluem: (1) seleção e fusão com o sinal adequado direcionamento para alcançar organela específica focalização; (2) seleção de uma proteína fluorescente apropriado (s), (3) forte emissão de fluorescência; (4) organela localização correta e / ou distribuição dentro da célula. Uma vez que o repórter organela específica foi expressa com sucesso no hospedeiro levedura escolhida estirpe um segundo grupo de ponderações tornam-se: (1) as condições de crescimento do fermento, (2) a preparação de amostras de células, (3) parâmetros de imagem como é importante que os parâmetros selecionados para CLSM (por exemplo, a intensidade do laser, velocidade de varredura e modo, o valor pinhole, o valor de zoom, objectivos utilizados ou de exposição para CCD-câmera) são mantidas durante todo um experimento assegurar que as comparações podem ser feitas entre o controle (células de crescimento) e amostras de fome; ( 3) entrega autofagia indução e bem-sucedida do repórter no vacúolo.

No geral, este método de microscopia fluorescente é fácil, relativamente rápido, e tem potencial de aplicação para a triagem de alto rendimento para novas drogas que aumentam ou inibir a autofagia, e também para genes que regulam ou modulam a autofagia.