Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Summary

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Abstract

Otofaji bir dizi farklı koşullar altında hücresel bileşenleri ciro için önemlidir. Bu, önemli bir homeostatik fonksiyonunun yanı sıra, hedef ve seçici organelles1-4 olmak üzere hücresel malzeme düşürebilir bir kalite kontrol mekanizması hizmet vermektedir. Örneğin, hasarlı veya mitokondri gereksiz (Şekil 1), otofaji, hücresel homeostaz ve hücre sağkalım için bir tehdit temsil edebilir atılmazsa. Maya, Saccharomyces cerevisiae, besin yoksunluk (örneğin, azot açlık) ya da hasar mitophagy ^5-9 olarak adlandırılan bir süreç otofaji mitokondri seçici ciro teşvik edebilir.

Otofaji değerlendirmek için basit bir floresan mikroskopi yaklaşım açıklar. Netlik için yaklaşım, maya hücreleri mitophagy izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için buraya açıklamasına kısıtlamak. Tahlil, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein bağlantılı bir pH-kararlı kırmızı floresan proteini içeren bir çift emisyon biyosensör bir floresan muhabiri, Rosella, yararlanır. Bu muhabir operasyon, canlı hücrelerde vakuol (pH ~~ 5.0-5.5) ve mitokondri (pH ~ 8.2) arasında pH farklılıkları dayanmaktadır. Büyüyen koşullar altında, vahşi tip hücrelerin mitokondri bir şekilde karakteristik dağıtılan iki kırmızı ve yeşil floresan sergilerler. Floresans emisyon vakuol ile ilişkili değildir. Azot açlık, kırmızı ve yeşil floresan mitokondri etiketleme yanı sıra, mitophagy indükler bir durum tabi, hücrelerin mitokondri, vakuol teslim temsil asidik vakuoler lümen, kırmızı birikimi sergiler, ancak yeşil olmayan floresan. Kırmızı hücrelerin puanlama, ancak yeşil olmayan floresan Vakuollerin, ^hücrelerin 5,10-12 mitophagic aktivitesinin bir ölçüsü olarak kullanılabilir .

Protocol

Uygun kontrol maya suşları seçme

Tahlil görsel maya vakuol kırmızı floresan birikimi değerlendiren deneyci dayanmaktadır. Bu testin öznel ve uygun kontrol suşları ve büyüme koşulları seçimi dayanmaktadır. Vahşi tip kontrol otofaji normalde beklenen düzeyde göstermek için kullanılır. Negatif kontrol olarak çekirdek otofaji genler (örneğin, ATG3) bir ifade için bir yük boş uygundur; bu suşları vakuol (örneğin, mitokondri, çekirdek) malzemenin teslim edemez

1. Plazmid DNA ile maya hücreleri Dönüşüm

Maya hücreleri kolayca dönüşümü için yetkili LiAcetate ile tedavi yapılabilir. Ticari kitleri satın alınan (örneğin, EasyComp, Invitrogen) ve yayınlanan protokolleri mevcuttur ¹³ olabilir.

Bu protokolde, vahşi tip suşu BY4741 (MAT his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) ve türetilen silme mutant (örneğin, atg3 Δ), zorunlu olmayan farklı bir genin her eksik ifade kapsamlı bir kütüphane bazı üyeleri kullanın . Silme suşu kütüphane Rosella tabanlı sensörler kullanılarak otofaji araştırmak için değerli bir araç temsil eder. Mt-Rosella ^12: Bu protokol çalışan muhabir pAS1NB tarafından kodlanan mitokondri için mt-Rosella (Şekil 2A).

Aşağıdaki adımları EasyComp Dönüşüm Kiti ve rahat kullanım için -80 ° C arasında dondurulup saklanan yetkili yapılan hücrelerin kullanımı dayanmaktadır.

1. Çözüm III (EasyComp Dönüşüm Kiti) 30 dakika maya hücreleri eklemeden önce oda sıcaklığına kadar dengeye.
2. 2-2.5 ul: muhabiri kodlayan plazmid DNA (mt-Rosella pAS1NB) (~ 100 ng / ml), 1.7 ml steril bir ek kapaklı plastik mikrosantrifüj tüp ekleyin.
3. Yetkili maya hücreleri ve nazik bir pipetleme karışım taze çözülmüş süspansiyon 5 ul ekleyin.
4. 50 Solution III ul (EasyComp Dönüşüm Kiti) ve karıştırmak için vorteks ekleyin. 1.5), 28-30 ° C'de 1 saat süreyle kuvvetli veya parmak ile el tüp Flicking tarafından her 15 dakikada bir vorteks karıştırıcı kullanılarak karıştırma dönüşüm reaksiyonları inkübe.
5. Dikkatli bir şekilde tek bir YMM agar büyüme metionin histidin ile takviye plakası ve urasil dönüşüm karışımı transferi ve hafifçe agar yüzeyine steril bir cam dağıtıcı ile çevresindeki hücreleri dağıtmak. Maya hücreleri bu aşamada kırılgan ve yumuşak taşıma transformants verimi artırabilir.
6. Büyüme plaklarının 28-30 ° C'de 2 ila 4 gün veya koloniler, yaklaşık 2-3 mm çapında görüntülenir kadar inkübe edin.

2. Maya hücreleri Rosella ifade Onaylanması

Ayrıntılı deneyler başlamadan önce, doğru yerelleştirme ve verimli bir şekilde ifade Rosella teyit edilmelidir.

1. Steril kürdan kullanarak, her bir suş 5 ayrı steril 1,7 ml ek kapaklı plastik mikrosantrifüj tüp içinde steril su 50 ul dönüşüm plaka ve tekrar süspansiyon hücreleri tek koloniler için seçin.
2. 10 ayrı etiketli cam mikroskop slayt (76 x 26 mm) üzerine bir kare lamel (22 x 22 mm) ile her hücre süspansiyonu ul ve hücre süspansiyonu kapsamaz.
3. Hemen bir floresan mikroskop kullanılarak (örneğin, Olympus Fluoview FV500) floresans emisyon hücreleri inceler. Güçlü, yeşil ve kırmızı floresan ve mitokondriyal lokalizasyonu (Şekil 2B ve 2C) tipik etiketleme arayın.
4. Floresan Bu şekilde incelenen her koloninin kalan taze bir YMM büyüme plağı üzerine inoküle edilmelidir.
5. 2 gün boyunca 28-30 ° C'de inkübe plakaları koloni kadar çapı yaklaşık 2-3 mm.

3. Hücre büyümesi ve otofaji indüksiyonu

Otofaji sabit faz, karbon kaynağı, rapamisinin yönetim, ya da azot açlık değişim içine giriş de dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında, bir numarasını kullanarak indüklenen olabilir. Biz rutin olarak azot açlık mitophagy ikna etmek için bir yöntem olarak kullanın.

1. Büyüme orta ve uygun auxotrophic takviyeleri etanol içeren 10 ml tek bir koloni İnokülasyon.
2. Maya kültürleri, yaklaşık 48 saat boyunca yörünge sallayarak (200 rpm) 28-30 ° C'de inkübe edin. Hücreler orta-log büyüme aşamasında olmalıdır.
3. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg'de santrifüj 1.7 ml steril ek kapaklı plastik santrifüj tüplerine yinelenen 1ml kültür örneklerinden Pelet hücreleri. Hücre pelletini bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
4. Hücrelerin kalan m kaldırmak için santrifüj yoluyla takip tabanda 1 ml steril distile su ile üç kere yıkayınedium.
5. Üçüncü yıkama büyüme orta veya azot açlık orta 100 ml hücreleri tekrar süspansiyon sonra.
6. 10 ml taze büyüme orta veya 10 ml azot açlık orta içine yeniden süspanse hücreleri yeniden aşılamak. Mitophagy indüksiyonu izin 6-12 saat yörünge sallayarak inkübe edin. Sonra açlık floresan mikroskobu ile görüntülemek için hücreleri hazırlarlar.

Not: CMAC-Arg vakuol Etiketleme

Testin ilk kurarken vakuol Rosella, floresan mikroskop teslim altında onaylamak için yararlıdır. Maya vakuol büyük bir organel olan konumu genellikle vakuol parçalanmış ve bulmak zor olabilir, maya bazı suşları ve bazı büyüme koşulları altında iletilen ışık görüntü, referans kolayca tespit edilebilir olmasına rağmen.

Vakuol kolayca CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arjinin amid) gibi kumarin tabanlı bir vakuol boya kullanarak etiketli olabilir. Vakuol parlak mavi floresan etiketleme boya sonuçları vakuoler proteazların eylem. Mavi emisyon Rosella ^11, kırmızı ve yeşil emisyon kolayca ayırt edilebilir. CMAC-Arg Etiketleme rutin olması gerekmez, ama maya vakuol konumunu ve görünümünü aşina olmayanlar için tavsiye edilir.

4. CMAC-Arg vakuol Etiketleme

1. Önce görüntüleme büyüyor veya azot-starved hücrelerin CMAC-Arg (100 mM son konsantrasyon) ekleyin. CMAC-Arg çözümü önceden hazırlanmış, ancak çözüm ışığa duyarlı olduğu gibi ışığa maruz kalmaktan korunması gerekir.
2. 28-30 ° C'de 30 dakika süreyle (200 rpm) ile yörünge sallayarak inkübe edin.
3. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg'de santrifüj Pelet hücreleri.
4. Süpernatantı atın.
5. Steril distile su ile hücreler üç kez yıkayın, artık orta ve aşırı CMAC Arg boya kaldırmak için santrifüj yoluyla takip tabanda.
6. Aşağıda anlatıldığı gibi görüntüleme için hücreler monte edin.

5. Konfokal lazer tarama mikroskopisi için Montaj canlı maya hücreleri (CLSM)

1. 70 ° C'de inkübe büyüme orta ve azot açlık orta ayrı 1 ml alikotları 2 mg düşük erime noktası agaroz eritin Erimiş agaroz 70 korunur ° C
2. Yavaşça pelet oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg'de santrifüj hücre ve her hücre kültürü 1 ml alikotları süpernatantlar atmak.
3. Hücreler adım 5.2 'de tabanda ve santrifüj 1 ml steril distile su ile üç kez yıkayın.
4. 100 ul steril distile su ile yıkanmış hücreleri tekrar
5. Erimiş agaroz hücreleri nokta 20 ul etiketli cam mikroskop lamı (76 x 26 mm) üzerine monte etmek için.
6. Hemen agaroz yatağa yıkanmış hücre süspansiyonu 10 nokta ul.
7. Agaroz yatak lamel (22 x 22 mm) ile kaplayın. Hücreler lamel altında agaroz yüzeyine yayılmış.
8. Lamel dehidrasyon ve görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için dikkatle oje ince bir film tabakası ile lamel kenarlarında mühür.
9. Oje tamamen kuru olduğunda (10 dk) slayt floresan mikroskopi sakının görüntülemek için hazırdır: oje mikroskop hedeflerine zarar verebilir.
10. Hücreler, bu tekniği kullanarak montaj sonrasında 1 saat kadar görülebilir monte edilebilir.

6. CLSM kullanarak görselleştirme otofaji

Hücrelerden oluşan bir nüfus otofaji düzeyi rutin olarak önce kırmızı vakuoler floresan gösteren hücrelerin sayısını belirleyerek ve otofaji indüksiyonundan sonra değerlendirilir. İdeal otofaji ilerlemesini otofaji indüksiyon (Şekil 3) seçilen zaman noktalarında izlenir. Bu en iyi mikroskop dürbün aracılığıyla görselleştirme yapılır. Bu doğru kontroller istihdam (örneğin, Δ atg3 mutant) ve mikroskop ayarları farklı örnekleri (örneğin, nötral yoğunluk filtreleri, filtre seçimi kullanımı) gözlemleyerek arasında değişmeden kalması olduğunu önemlidir.

GFP ve / veya pHluorin (yeşil floresan emisyon) (FITC filtresi) ve DsRed.T3 (kırmızı ayrı bir görünüm için uygun uyarma / emisyon filtresi ile donatılmış kaliteli bir floresan mikroskobu (örneğin, Olympus Fluoview FV500) gerektiren maya hücreleri nispeten küçük floresans emisyon) (TRITC filtre).

1. Dönüşümlü FITC ve TRITC filtreleri kullanarak non-starved vahşi tip hücrelerin 60x su objektif bir bakış açısı kullanma. Vahşi tip hücrelerin mitokondri hem de kırmızı ve yeşil floresan gösteren hücrelerin çevresindeki tipik bir hücresel dağılımı göstermelidir. Mitokondri bu dağıtım pinh bağımlı olduğunu unutmayınkonfokal mikroskop ole ayarı. Biz genellikle sadece mitokondri, ^vakuol 12 gizlenmiş değildir hücre periferinde lokalize (Şekil 2C) nokta bir dizi olarak dikkat edilmesi gereken, 125 mm, daha düşük bir iğne deliği değer kullanın. Yüksek bir iğne deliği değeri (200 mm) ise, bu tipik ipliksi mitokondriyal ağ ¹¹ uyulması gereken (ve uğrar değişiklikleri) hücre boyunca dağıtılan sağlar. Hücre yok diğer yapılar floresan ile işaretlenmiş olmalıdır.
2. Sırayla açlık orta transfer her zaman puan hücreleri görmek. Yeşil ve kırmızı emisyon filtreleri kullanarak dönüşümlü olarak gözünüzde canlandırın. 6 saat açlık süresi noktası kırmızı floresan, ancak hiçbir karşılık gelen yeşil emisyon vakuol ayırt edilebilir olmalıdır. Vakuoler yerelleştirme ayrı CMAC-Arg (Şekil 2C) kullanarak teyit edilebilir. View ~ 200 hücre ve vakuol (yani mitokondri vakuoler alımı) sadece kırmızı floresan gösteren sayısını.
3. > 200 hücre ve sonra arsa vakuoler birikimi gösteren hücrelerin yüzde gözlemleyerek tüm zaman noktalarında vakuoler birikimi güvenin.
4. Mt-Rosella ifade açlıktan önce ve 6 saat açlık otofaji-negatif kontrol hücreleri inceleyin.

7. Temsilcisi sonuçları:

Burada, vahşi tip ve Δatg3 mutant hücreler ifade mt-Rosella kullanarak elde edilen sonuçlar göstermektedir. Karbon kaynağı olarak etanol ile büyüyen koşullar altında, vahşi tip ve Δatg3 mutant hücreler hem hücresel tipik bir floresan maya hücreleri mitokondri (kırmızı ve yeşil) bir dağılım göstermesi. Kırmızı ve yeşil floresan emisyon vakuol (Şekil 2B ve 2C) tespit değildir. 6 saat ve azot açlığa maruz kaldığında (Şekil 2B; Şekil 3) sonra ötesinde, mitokondri ile ilgili kırmızı ve yeşil floresan ek, vahşi tip hücrelerin de kırmızı birikimi sergilemek, ama vakuolar lümen yeşil floresan . Ancak, Δatg3 mutant hücreler ne kırmızı ne de yeşil floresan vakuolar lümen (Şekil 3 Şekil 2C) birikir.

Şekil 1. Top, maya hücre organelleri ve bölmeler şeması. Alt, bir maya hücresidir bir vakuol-merkezli bir bakış, farklı organelleri ve bölmeler otofajik bozulması belirten sunulmaktadır. Otofaji (örneğin, mitophagy, nucleophagy) çeşitli organel belirli türleri arasındaki bazı farklılıkları yuttu içeriğinin özgüllüğü (kargo seçim), çeşitli hücre içi ihtiyaçlarını ve ekstrasellüler ipuçları (örneğin, açlık, hasar), belirli sinyaller, ATG genler ve zaman bağımlılık.

Şekil 2. (A) mt-Rosella şematik gösterimi. Mitokondriyal lideri dizisi (sitrat sentaz Bu durumda) mitokondrial matriks Rosella biyosensör hedef kullanılır. Uyarma ve kırmızı floresan proteini (DsRed.T3) ve yeşil floresan protein (pHluorin) için emisyon maxima gösterilir. Yüksek pH (mitokondriyal pH ~ 8.2) biyosensör sadece kırmızı fluoresces düşük pH (vakuolar pH ~ 5.5), ancak, kırmızı ve yeşil fluoresces ifade vahşi tip ve Δ atg3 mutant hücreler beklenen sonuçlarla (B) şematik mt-Rosella (C) yabani yetişen altında tipi hücreleri ve azot açlık koşulları CLSM tarafından Gerçek sonuçlar elde edilmiştir. Soldan sağa: DIC (kontrast farkı), TTT (DsRed.T3) floresans emisyon, GFP (pHluorin) floresans emisyon CMAC-Arg floresans ve birleştirme görüntü (D) Gerçek sonuçlar altında Datg3 mutant hücreler için floresan mikroskobu ile elde büyüyen ve azot açlık koşulları. Soldan sağa: DIC (kontrast farkı), RFP (DsRed.T3) floresans emisyon, GFP (pHluorin) floresans emisyon CMAC-Arg floresan ve birleştirme görüntü.

Şekil 3, 48 saatlik bir süre boyunca vakuol kırmızı floresan gösteren mt-Rosella ifade ve azot açlık altında yetişen vahşi türü ve Δ atg3 mutant hücreler, yüzdesi . Kırmızı floresan birikimi vakuol gösteren hücrelerin yüzde 0, 6, 12, 24 ve 48 saat azot açlık başlamadan sonra kaydedildi.

Discussion

Şekil sunulan temsili görüntüler. 2B ve 2C açıkça organel özel floresan gazetecilere ve floresan mikroskobu kullanımı, büyüyen ve azot hasret hücreler hem de mitokondriyal yerelleştirme / dağıtım kanıt sağlar ve görüntülenebilmekte mitophagy sağlar olduğu görülebilir .

Bu yöntem aşağıdaki mitophagy sınırlı olmadığını vurguladı olmaktır. Diğer hücre bileşenleri ya da organelleri (örneğin, ribozom, lipid damlacıkları, peroksizomlara, endoplazmik retikulum ve çekirdek) otofaji uygun etiketleme ile izlenebilir. Rosella biyosensör yapısı, hücre kültürü koşullarında ve çekirdeğin cirosu (nucleophagy) için tipik sonuçlar yöntemin geniş bir uygulama gösteren ^11,12 bildirilmiştir.

Izleme otofaji organel özel floresan gazetecilere kullanımı, yapı tasarımı bazı noktalar akılda tutulmalıdır gerektirir. Bunlar: (1) organel özel hedefleme ulaşmak için uygun bir hedef sinyal seçimi ve füzyon; uygun bir floresan protein (ler) (2) seçim (3) güçlü floresans emisyon; (4) doğru organel yerelleştirme ve / veya hücre içinde dağılımı. (3) sonra organel özel muhabiri başarıyla düşünceler haline ikinci bir grup zorlanma seçilen maya konak ifade edilmiştir: (2) hücre numune hazırlama (1) maya büyüme koşulları görüntüleme parametreleri parametreleri seçtiği önemlidir. CLSM (örneğin, lazer yoğunluğu, tarama hızı ve modu, iğne deliği değeri, zoom değeri, kullanılan hedefleri veya CCD kamera için pozlama kontrolü (büyüyen hücreleri) ve açlıktan örnekleri arasında karşılaştırmalar yapılabilir emin bir deney boyunca devam); ( 3) vakuol içine muhabir otofaji indüksiyon ve başarılı teslimat.

Genel olarak, bu floresan mikroskopi yöntemi nispeten hızlı, kolay ve düzenliyor veya otofaji modüle genler için yeni ilaçlar geliştirmek veya inhibe otofaji ve yüksek verimlilik tarama için potansiyel uygulama.