Summary
Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.
Abstract
Multiplex PCR / Reverse Blot test Linea ibridazione permette di rilevare fino a 43 bersagli molecolari in 43 campioni con una reazione multiplex PCR seguita da ibridazione sonda su una membrana di nylon, che è riutilizzabile. Le sonde sono 5 'amina modificato per consentire la fissazione alla membrana. Primer sono 5 'biotina modificato che permette di individuare i prodotti di PCR ibridato con streptavidina-perossidasi e di un substrato chemiluminescente tramite pellicola fotosensibile. Con l'installazione e bassi costi di consumo, questa tecnica è poco costoso (circa US $ 2 per esempio), ad alto rendimento (membrane multiple possono essere trattati contemporaneamente) e ha un breve periodo di tempo di risposta (circa 10 ore).
La tecnica può essere utilizzata in diversi modi. Sonde multiple possono essere progettati per rilevare variazione di sequenza all'interno di un singolo prodotto amplificato, o più prodotti possono essere amplificati simultaneamente, con uno (o più) sonde per il rilevamento successive. Una combinazione di entrambi gli approcci possono essere utilizzati anche all'interno di un singolo test. La possibilità di includere sonde multiple per una sequenza bersaglio unico rende il test altamente specifici.
Applicazioni pubblicate su MPCR / RLB comprendono il rilevamento di 1,2 geni di resistenza agli antibiotici, la digitazione di Staphylococcus aureus resistente alla meticillina 3-5 e Salmonella sp 6, sierotipizzazione molecolare di 7,8 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae 9 e enterovirus 10,11, identificazione di Mycobacterium sp 12, il rilevamento di 13-15 genitale e le vie respiratorie 16 e altri 17 agenti patogeni e la rilevazione e l'identificazione delle Mollicutes 18. Tuttavia, la versatilità della tecnica significa che le applicazioni sono praticamente illimitate e non limitato ad analisi molecolare di microrganismi.
I cinque passi in MPCR / RLB sono: a) Primer e il design della sonda, b) estrazione del DNA e PCR amplificazione c) Preparazione della membrana, d), ibridazione e rilevazione, ed e) La rigenerazione della membrana.
Protocol
Attenta considerazione deve essere data primer e di progettazione della sonda. Tutte le sequenze a disposizione degli obiettivi di interesse da database GenBank, come dovrebbe essere utilizzato per identificare le aree conservate che sono obiettivi adatti. Dove un gran numero di obiettivi vengono amplificate in un test di MPCR singole, ciascuna sequenza amplificata devono essere di lunghezza simile, e non deve superare i 300 paia di basi di evitare la concorrenza. Un'applicazione alternativa del metodo è quello di amplificare un obiettivo più a lungo utilizzando primer contro le regioni conservate e di utilizzare più sonde per identificare variazione di sequenza nel amplicone. In questo caso, il prodotto amplificato PCR può essere più lungo. Temperature di ricottura fondo dovrebbero essere tutti simili, con condizioni di PCR adeguati di conseguenza. Primer che formano una forte struttura secondaria o dimero primer deve essere evitato. La Sigma Aldrich DNA calcolatrice ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) può essere usata per predire in modo affidabile queste caratteristiche.
Sonde di DNA deve essere progettato per avere ricottura temperature prossime a 60 ° C. Per massimizzare la specificità, due sonde per ogni target di interesse possono essere inclusi nel saggio, una ibridazione per il filamento di DNA in avanti adiacente al sito fondo inverso vincolante, e l'altro al filone invertire adiacente al sito primer forward vincolanti. In questo caso, entrambi i primers avanti e indietro deve essere biotina-modificato. Se solo una sonda per bersaglio amplificato viene utilizzato, allora solo un innesco necessario biotina modificato.
Nella progettazione di primer e sonde per la MPCR / RLB saggio è fortemente consigliato di utilizzare metodi in silico per prevedere i prodotti di PCR e ibridazione sonda correlati con i risultati in vitro. Idealmente questo viene fatto usando ceppi per i quali la sequenza del genoma completo è disponibile. Software come FastPCR (disponibile presso http://primerdigital.com/fastpcr.html) può essere utilizzato per questo scopo. Segnale della sonda debole o assente è possibile prevedere dove in analisi in silico indica discordanze coppia di basi con conseguente temperature basse sonda ricottura.
Tecniche di estrazione del DNA varia a seconda dei campioni testati, e le condizioni di PCR sarà dipendente da disegno primer. I lettori si riferiscono a pubblicazioni su test individuali per ulteriori informazioni riguardanti l'estrazione del DNA e reagenti PCR e le condizioni di 1-19.
Ogni test viene eseguito con i controlli appropriati alle fornire almeno un segnale positivo e uno negativo per ciascuna sonda sonda sulla membrana, così come un DNA senza controllo. Inoltre è utile per includere una sonda nella parte superiore della membrana che dovrebbe essere positivo per tutti i campioni (per esempio: una specie o genere sonda specifica nel caso di un microrganismo). Questo serve come una sonda di controllo positivo, ma permette anche un facile orientamento dei risultati.
1. Preparazione di membrane
- Preparare le seguenti soluzioni:
- 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4)
- 100 ml 0.5M NaHCO 3
- 20 ml EDAC 16%
- 250 ml di NaOH 0,1 M
- 250 ml 2xSSPE
- 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - posto a bagnomaria a 60 ° C
- 250 ml di 20 mM EDTA.
- Preriscaldare il forno a 60 ° C.
- Pulire il Miniblotter Immunetics con il 70% di etanolo.
- Diluire le sonde oligonucleotidiche in 0,5 M NaHCO 3 a una concentrazione finale di 2 pmol / mL e un volume di 200 l.
- Tagliare una membrana di nylon BiodyneC a cm 15x15. Usando una matita e righello, regola off di 0,5 cm di spazio in alto di membrana e scrivere dettagli qui.
- Membrana di tenuta in sacchetto di plastica con 20 ml di soluzione EDAC appena fatto il 16% e il rock a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Lavare membrana in acqua deionizzata per 30 secondi.
- Membrana posto in miniblotter con canali che attraversano la membrana (parallela alla linea di matita). Mettere cuscino di supporto al suo posto e carta assorbente vicino. Aspirare il liquido dai canali.
- Compila corsie 1 e 45 con 150 microlitri 0,5 M NaHCO 3. Utilizzare 150 ml di ogni soluzione sonda a riempire corsie 2-44 in sequenza, facendo attenzione ad evitare bolle d'aria. Se una bolla d'aria è presente nel canale, mantenendo la pipetta in posizione, rapidamente aspirare la soluzione per consentire la bolla d'aria a salire in cima alla pipetta, poi riprovare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aspirare soluzioni sonda, rimuovere membrane e lavare in 250 ml 0,1 M NaOH a temperatura ambiente per 9 minuti.
- Lavare membrana in 250 ml 2xSSPE per 30 secondi.
- Lavare membrana in 250 ml preriscaldata 2xSSPE/0.1% SDS in forno a 60 ° C per 5 minuti.
- Se non viene utilizzato per l'ibridazione immediatamente, lavare membrana in 240 ml di 20 mM EDTA a temperatura ambiente per 20 minuti (riservando 10ml rimanente), poi sigillare membrana in sacchetto di plastica con altri 10 ml di 20 mM EDTA e Store in frigo a 4 ° C.
- Lavare con miniblotter Pyroneg detergente e pennello. Risciacquare e lasciare asciugare.
2. Ibridazione e rilevazione
- Preparare le seguenti soluzioni:
- 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - conservare in bagno d'acqua a 60 ° C.
- 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - conservare in bagno d'acqua a 60 ° C
- 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - conservare in forno a 42 ° C
- 500 ml 2xSSPE - conservare a temperatura ambiente
- 500 ml 1% SDS - conservare in bagno d'acqua a 60 ° C inizialmente (per la fase 3)
- 250 ml di 20 mM EDTA - conservare a temperatura ambiente (per la fase 3).
- Accendere un forno a 60 ° C e un forno a 42 ° C. Portare l'acqua a bollire in un recipiente di grandi dimensioni su piastra.
- Immunetics pulito Miniblotter con il 70% di etanolo.
- Aliquota 10 ml di 2xSSPE/0.1% SDS in un piccolo contenitore. Aggiungere 20 ml di ciascun prodotto PCR di 150 microlitri SDS 2xSSPE/0.1% in provette numerate.
- Fate bollire i prodotti di PCR per 10 minuti a 100 ° C utilizzando titolari polistirolo. Mettere in ghiaccio immediatamente per almeno 5 minuti.
- Lavare membrana rimanenti 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS a 60 ° C forno per 5 minuti.
- Membrana posto in miniblotter con cuscino supporto. Orientare in modo da eseguire canali in senso verticale (perpendicolare alla linea di matita).
- Aspirazione liquido in eccesso dai canali miniblotter.
- Aggiungi restanti 150 microlitri SDS 2xSSPE/0.1% ai canali e cognome. Aggiungi bollito prodotti di PCR per i restanti canali (2-44) in sequenza, facendo attenzione ad evitare bolle d'aria.
- Luogo miniblotter appartamento in forno a 60 ° C per 1 ora per consentire ibridazione di prendere posto.
- Aspirare il liquido da ogni canale quindi rimuovere membrana da miniblotter.
- Lavare due volte in 250 ml preriscaldata 2xSSPE/0.5% SDS a 60 ° C forno per 10 minuti.
- Inumidire maglia di nylon che separano con 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C e utilizzarlo per rimboccarsi membrana.
- Luogo arrotolato membrana nel tubo a rulli, e dispiegare per assicurare membrana confina con la superficie interna. Aggiungere 3 ml streptavidina-perossidasi coniugato (Roche Applied Science) a 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C e aggiungere al rullo avvolgitore. Tappo a vite su e incubare in forno a rulli a 42 ° C per 60 minuti. Assicurare la direzione di tiro è tale che membrana non stringe. Controllare periodicamente la tenuta.
- Lavare miniblotter in Pyroneg acqua e detergente, risciacquare e lasciare asciugare.
- Rimuovere membrana da rullo avvolgitore. Lavare due volte nella restante 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C per 10 minuti.
- Lavare due volte in 2xSSPE a temperatura ambiente per 5 min.
- Girare forno fino a 80 ° C e luogo 500ml 1% SDS in forno pre-caldo.
- Portare 15 ml soluzione di rilevamento Amersham ECL (7,5 ml di soluzione A e 7,5 ml di soluzione B). Gettare 2xSSPE e aggiungere la soluzione di rilevazione. Roccia delicatamente a mano per 2 minuti, garantendo una copertura completa di membrana con la soluzione. Scartare la soluzione chemiluminescente.
- Tagliare due fogli di plastica trasparente per adattarsi cartuccia esposizione. Membrana tra i due fogli e cartucce in luogo di esposizione.
- Procedere alla camera oscura. Sotto la luce rossa, aggiungere pellicola ECL rilevamento di cartuccia ed esporre per 5 minuti. Dog-ear nell'angolo inferiore destro del film dopo la rimozione per consentire il corretto orientamento durante la visualizzazione.
- Sviluppare la pellicola con lo sviluppatore automatizzati o bagni chimici come istruzioni del produttore per il.
- Ripetere l'esposizione con tempi di esposizione più o meno lungo, se necessario.
3. Rigenerazione della membrana
- Lavare membrana in 250 ml 1% SDS a 80 ° C per 30 minuti due volte.
- Lavare membrana in 240 ml di 20 mM EDTA a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Membrana di tenuta in sacchetto di plastica con 10 ml di 20 mM EDTA e conservare in frigorifero a 4 ° C per il futuro riutilizzo.
4. Rappresentante dei risultati:
I risultati sono migliori viste mettendo il film su una griglia stampata, oppure la scansione l'immagine e l'importazione in un software come BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgio). Ogni risultato sonda dovrebbe essere interpretato con riferimento alle sonde di controllo positivo e negativo. I risultati sono migliori classificati come negativo, debolmente o positivo. Risultati positivi sono dove il segnale è forte come o più forte la sonda di controllo positivo. Risultati negativi sono dove il segnale è assente o uguale al controllo negativo (nel caso di segnale di fondo). I risultati sono deboli dove il segnale è più debole la sonda di controllo positivo, ma più forte rispetto al controllo negativo. Risultati debole può essere il risultato di mutazioni puntiformi che porta al legame della sonda deboli, o per non specifici segnali di formazione innesco dimero. Utilizzando due sonde per target di interesse in grado di migliorare la specificità, in cui un unico risultato debole può tranquillamente essere interpretato come non specifico segnale. Se qualche dubbio rimane, un unico complesso reazione di PCR può essere eseguita con gel a base di rilevazione e sequenziamento di qualsiasi amplificatorelified prodotto per determinare se il risultato è veramente positivo. Un risultato rappresentativo è mostrato in figura 2.
Figura 1. Il MPCR / RLB principi (P1) Punto 1.9. Amine sonde modificate sono legati covalentemente a una membrana di nylon. (P2) Passo 2.10. Biotina modificati prodotti di PCR sono ibridate alle sonde. (P3) Passo 2.14. Streptavidina, marcato con perossidasi, è incubato con la membrana e si lega alla biotina. (P4) Piazza di 2,19-2,21. Perossidasi catalizza una reazione nei reagenti di rilevazione ECL, producendo luce a cui la luce sensibilità di una pellicola esposta. La membrana viene poi lavata per il riutilizzo.
Figura 2. Rappresentante MPCR / RLB risultato. I campioni da 1 a 6 rappresentano i controlli positivo - tra di essi vi è almeno un segnale della sonda positivo per ciascuna delle 43 sonde. Ogni sequenza bersaglio (da A a U) viene rilevato con due sonde differenti per massimizzare la specificità. Sonde A1 e A2 rappresentano specie sonde specifiche che dovrebbero essere positivo per ogni campione e assistere orientare il film. Sonda A1 si ripete in fondo la membrana. I campioni 7 e 8 sono controlli negativi. Si noti che Q1 sonde, Q2, T1 e T2 hanno segnale nei controlli negativo, indicando probabile legame aspecifico dei primer o dimero prodotto primer. Ri-progettazione di queste sonde o primer sarebbe necessario. Sonde C1, D1 e F1 mostrare striature attraverso la membrana probabilmente a causa di alcuni non-specifico di assorbimento della streptavidina-perossidasi coniugato e substrato chemiluminescente, tuttavia questo è facilmente distinguibile dal vero i segnali positivi della sonda. Sonde D1 e D2 hanno segnale relativamente debole rispetto alle altre sonde, questo può essere dovuto al maggiore ampliconi che porta all'amplificazione meno efficienti. Sonda J2 è negativo è diversi campioni (1, 3, 4, 6, 39) dove la sonda J1 è positivo. Questo molto probabilmente rappresenta una mutazione nel sito J2 vincolante per questi esempi.
Discussion
Il MPCR / RLB metodo permette la rilevazione simultanea di un gran numero di ampliconi della PCR. A causa della elevata sensibilità della sonda chemiluminescenza a base di rilevazione, una singola reazione di PCR multiplex con un gran numero di coppie di primer può essere utilizzato per amplificare il modello del DNA.
Se nessun segnale della sonda si ottengono con uno o più campioni, eseguendo l'elettroforesi su gel con tutti i prodotti rimanenti PCR può aiutare a distinguere se il problema è con l'amplificazione PCR o ibridazione della sonda. Dove tutti i segnali della sonda sulla membrana sono deboli o assenti, ma elettroforesi su gel indica successo PCR, le possibilità sono problemi con l'etichettatura della membrana, la rigenerazione non corretta della membrana dopo l'uso precedente, le temperature non corretto durante l'incubazione ibridazione o streptavidina, o difettoso streptavidina- perossidasi coniugato o reagenti di rilevamento.
Se i campioni di controllo indicano che le sonde individuo può essere la produzione di falsi segnali negativi, PCR singola con gel a base di rilevazione e sequenziamento successive possono essere eseguite per verificare l'amplificazione del prodotto PCR e per cercare variazione di sequenza nel sito di legame della sonda. Segnale della sonda debole o assente può essere dovuto alla dimensione amplicone di grandi dimensioni: se possibile, tutti ampliconi devono essere di lunghezza simile e meno di 300 bp. Le strutture secondarie del DNA di ampliconi può anche produrre vincolante poveri sonda, e potrebbe essere necessario ri-progettazione di primer. Primer o concentrazioni sonda può anche essere variata per ottimizzare la potenza del segnale.
Falsi segnali positivi grazie alla sonda di legame del primer nonamplified o primer-dimero prodotto può essere indagato eseguendo singole PCR con gel a base di rilevazione e la sequenza successiva. In questo caso, riprogettazione delle sonde possono risultare necessarie. Mutazioni puntiformi nei siti di legame della sonda può portare a segnali deboli o assenti. Permettere due sonde per ogni prodotto amplificato rende questo facile da individuare. Questa caratteristica può essere sfruttata con primer e attenta progettazione della sonda per rilevare piccole variazioni di sequenza del DNA bersaglio.
In sintesi, mentre ci sono molti metodi di prodotto reazioni PCR multiplex dopo la rilevazione disponibile, MPCR / RLB ha il vantaggio di essere high-throughput e poco costoso, con bassi costi di setup. La flessibilità del metodo ne consenta l'uso in una vasta gamma di applicazioni.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Matteo O'Sullivan e Fei Zhou sono destinatari di Australian National Health and Medical Research Council Borse di studio post-laurea la ricerca medica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5’ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
| 20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
| BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm | Pall Corporation | 74480C | |
| Deionised, purified water | |||
| Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
| Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche Group | 11 089 153 001 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
| OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
| Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
| Ice | |||
| Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay. | |||
| Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
| The Belly Dancer rocking platform | Stovall Life Sciences, IBI Sciences | Euro BDbo | |
| Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
| Water bath | |||
| Suction | |||
| Hot plate | |||
| Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
| X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film | ||
| Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay. | |||
References
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